建泽泻法呢基焦磷酸合酶分子克隆、分布表达及生物信息学研究

三萜类化合物是道地药材建泽泻中的主要药效成分,在癌症治疗方面有很大的应用潜力。法呢基焦磷酸合酶(FPPS)为三萜类化合物合成途径中的重要限速酶之一,本文运用同源克隆和快速cDNA末端扩增(RACE)技术相结合的方法,克隆了建泽泻FPPS基因的全长cDNA(accession no.HQ724508),FPPS cDNA全长为1 531 bp,含有1个1 032 bp的开放阅读框,编码343个氨基酸的蛋白,包含5个保守的功能域,其中两个富含天冬氨酸(DDXXD)。实时荧光定量PCR(QRT-PCR)结果显示建泽泻FPPS基因在各器官中均有表达,10月至12月上旬相对表达量呈上升趋势,后下降,其中叶片表达量较高,块茎、根、叶柄表达量相对较低。高效液相(HPLC)分析结果表明不同生长期建泽泻主要药效成分23-乙酰泽泻醇B变化趋势与FPPS基因表达量变化一致,初步证明FPPS是泽泻醇类化合物合成途径中的重要调控位点。本研究为利用植物基因工程改善中药材品质提供科学依据。     

白木香纤维素合酶家族基因的鉴定及表达分析

纤维素合酶(cellulose synthase, CesA)是纤维素生物合成途径中的一类关键酶,在植物生长发育和植物防御反应中有着重要的作用。本研究利用白木香基因组数据库,通过生物信息学手段,对白木香纤维素合酶家族成员及其编码蛋白的理化特性、蛋白保守基序、染色体定位、启动子区域等进行预测分析。系统分析鉴定了21个白木香AsCesA基因,并发现AsCesA蛋白主要分布于质膜,氨基酸数目为390～1 261个,分子质量为43.35～142.58 kD,等电点分布在5.67～8.86,均含跨膜结构域,数目为6～8;系统进化分析表明21个AsCesA分为3个亚组;保守基序分析表明,不同AsCesA蛋白的motif组成有一定差异,但均含有motif2、motif6、motif7和motif10。顺式作用元件分析表明, AsCesA基因家族具有响应植物激素作用、非生物胁迫和生物进程相关的顺式作用元件。分析NaCl诱导不同时刻的白木香愈伤组织的转录组数据,选择了7个具有差异表达的AsCesA并分析其在非生物胁迫下的表达量变化。实时荧光定量PCR结果表明,盐、低温、干旱和重金属胁迫均能不同程度影响白...     

一氧化氮合酶在鼻息肉中的表达及意义

目的　了解一氧化氮 (NO)在鼻息肉组织中分布情况 ,检测一氧化氮合酶 (NOS)在人鼻粘膜和鼻息肉中的表达及其定位情况。方法　应用免疫组化染色方法 (SABC法 ) ,检测 38例鼻息肉和 17例对照组下鼻甲粘膜组织中 3种类型NOS的表达情况。结果　 (1)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在 38例鼻息肉组织的上皮及腺上皮细胞中均有表达 ;在炎症细胞里也有表达 ;在 17例对照组鼻粘膜上皮及腺上皮组织中均无表达 (P <0 0 1)。 (2 )神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)和内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)在 38例鼻息肉组织的上皮及腺上皮细胞中大多数无明显表达 ,少数可见弱阳性表达 ;在 17例对照组鼻粘膜上皮及腺上皮组织中有较强的表达 (P <0 0 1)。结论　 (1)NOS存在于炎症 (如鼻息肉 )和非炎症的人类上呼吸道组织中。 (2 )在鼻息肉组织中主要有iNOS的表达 ;在正常鼻粘膜组织中仅有eNOS的表达。 (3)iNOS可能是鼻息肉病理生理学机制中的诸多因素之一 ,在鼻息肉发生发展中发挥着重要作用     

诱生型一氧化氮合酶抗体的制备与初步应用

目的制备诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)特异性抗体并应用于iNOS检测。方法将iNOSN端片段装入原核表达载体pET 2 8a(+) ,在大肠杆菌BL2 1中表达 ,两步法纯化目的蛋白 ,使用纯化蛋白制备iNOS多克隆抗体。获得的抗血清用于小鼠巨噬细胞及小鼠脑缺血模型中iNOS的检测。结果得到具有较高表达量的融合蛋白 ,经两步纯化获得iNOSN端融合蛋白纯品 ,将此蛋白免疫家兔 ,得到iNOS多克隆抗体 ,Westernblot分析表明该抗体不与nNOS、eNOS交叉反应 ,而能检测组织、细胞中的iNOS。结论原核表达iNOSN端片段制备的iNOS抗体具有很好的反应性及特异性     

Fas胞外区基因的构建、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建Fas胞外区(eFas)基因的表达载体,表达纯化重组蛋白,进行多克隆抗体的制备,为进一步功能研究奠定基础。方法通过重叠PCR获得eFas基因的编码序列,构建pET-22b(+)/eFas表达载体,转化大肠杆菌Rosetta-gami,IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。将纯化的eFas融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,通过ELISA方法检测多克隆抗体的效价。结果获得了eFas的编码序列与表达载体,目的蛋白主要在包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度达95%以上。结论eFas融合蛋白基因的构建、表达、纯化以及多克隆抗体的制备,为进一步研究Fas提供了材料。     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。     

免疫球蛋白降解酶IdeS在大肠杆菌中的表达、纯化及功能鉴定

病原链球菌为逃避宿主的免疫反应,分泌一种可特异地裂解免疫球蛋白G的降解酶(immunoglobulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS)。IdeS既可作为工具酶用于IgG的指纹分析,又可用于治疗与自身免疫反应相关的疾病。本研究基于质粒pCold构建了两种重组IdeS的表达载体,并在大肠杆菌Shuffle T7中进行异源表达,经亲和色谱纯化后检测其蛋白活性。结果表明N-端含有His6-标签的重组IdeS产量为4 mg·L^-1,其与抗体IgG1以1∶200 (m/m)在37℃反应30 min即可完全酶解。而N-端含有His6-标签且C-端含有硅胶亲和标签(SiBP)的重组IdeS产量为1.5 mg·L^-1,其与抗体IgG1以1∶20 (m/m)在37℃反应30 min才可反应完全。C-端融合肽对于IdeS产量与活性都有较大的影响,使其活性降低,不利于后续应用于药物研发。上述结果表明,本系统所表达的N-端含有His6-标签的IdeS重组蛋白具有较高的活性,完全能满足抗体类药物研发...     

地高辛抗体对大鼠再灌注心肌一氧化氮合酶同工酶表达的影响

目的：观察心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reperfusion,MIR）时大鼠心肌组织、血清NO水平及一氧化氮合酶（NOS）同工酶蛋白表达的变化和内洋地黄素特异性抗体对MIR时心肌NO系统损伤的保护作用。方法：采用左冠状动脉前降支结扎30min,复灌45min建立在体大鼠MIR模型,Sprauge-Dawley大鼠随机分成7组,每组10只：假手术组,MIR模型组,生理盐水组,维拉帕米组,小、中、高剂量地高辛抗血清组（9、18、36mg/kg）。各组于再灌注45min后立即取左室心尖部缺血区心肌并断尾取血,检测心肌匀浆和静脉血中NO含量,心肌匀浆中的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平,免疫组织化学SABC法检测心肌组织eNOS、iNOS;光镜下观察心肌组织形态学变化。结果：MIR时心肌组织NO水平明显降低,但血清中NO水平无明显变化;eNOS表达明显减少,iNOS表达明显增加,心肌组织结构发生明显损伤;中、高剂量地高辛抗血清能有效降低心肌组织iNOS表达,恢复心肌细胞eNOS活性,提高心肌组织和血液中的NO水平,减轻MIR导致的心肌组织结构损伤。结论：内洋地黄素特异性抗体对MIR造成的心肌NO系统损伤具有明显的保护作用,其作用机制可能通过拮抗内洋地黄素,调节心肌NOS同工酶的表达紊乱而实现。     

5种丹参类注射剂临床配伍禁忌文献研究

含有丹参Salvia miltiorrhiza的中药注射剂主要包括丹参注射液、丹参滴注液、注射用丹参（冻干）、注射用丹参多酚酸盐和注射用丹参多酚酸。其在临床应用中存在配伍禁忌,如配伍后发生理化性质的变化,与抗癌药物进行配伍后会促进恶性肿瘤的转移,与止血药、雄激素、阿托品等药物配伍会降低丹参类注射剂的疗效,与抗凝药配伍会导致出血现象的发生等。对5种丹参类注射剂配伍禁忌的相关文献进行归类总结,以期为该类注射剂在临床中的合理应用提供指导。     

丹参类制剂及丹参活性成分改善脑循环作用机制的研究进展

近年来,随着脑血管病的发病率不断升高,其相关病症已经严重的影响了患者的生活质量。研究发现丹参类制剂及丹参活性成分具有明显的改善脑循环作用,主要从改善脑部微循环、改善脑侧支循环以及促进侧支血管的新生3个方面归纳总结了丹参类制剂及丹参活性成分改善脑循环的药理作用及作用机制,旨在为丹参类制剂改善患者脑循环的应用提供理论依据。     

丹参有效成分及丹参类制剂抗炎药理作用的研究进展

中药在治疗炎症方面具有疗效较好、毒副作用小等优点。综述丹参Salvia miltiorrhiza中的水溶性成分（丹酚酸A、丹参茎叶总酚酸、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素等）、脂溶性成分（丹参酮II_A、丹参酮I、隐丹参酮、甲基丹参酮等）、丹参多糖,丹参类注射液（丹参注射液、注射用丹参多酚酸、丹红注射液等）以及丹参其他类制剂（如丹参凝胶、丹参涂膜剂等）的抗炎药理作用研究进展,以期为丹参抗炎作用研究及丹参的临床应用提供参考。     

超高效液相色谱-荧光法测定丹参饮片中黄曲霉毒素

目的 建立超高效液相色谱-荧光法测定丹参饮片中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂。方法 样品经70%甲醇提取,通过免疫亲和柱净化后,用超高效液相色谱-荧光法进行分析测定,WatersAcquity UPLC BEH C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）;流动相为甲醇-乙腈（1∶1）、水,梯度洗脱;体积流量0.4 mL/min;柱温30℃;荧光检测器激发波长365 nm;发射波长456 nm;进样量2 μL。结果 黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂分别在0.120 1～1.920 8、0.036 1～0.577 2、0.122 1～1.954 0、0.042 1～0.673 2 ng/mL内线性关系良好,r均大于0.99;定量限分别为0.10、0.03、0.39、0.03 ng/mL;黄曲霉毒素B₁的回收率为107%,RSD为6%;黄曲霉毒素总含量的回收率为80%,RSD为9%。专属性、重复性、精密度、稳定性试验均符合检测要求。结论 所建立的方法准确、可靠、专属性强,可准确地测定丹参饮片中黄曲霉毒素的含量。     

丹参多糖的急性和亚急性毒性试验研究

目的 检测丹参多糖的急性毒性与亚急性毒性,为丹参多糖的安全性做出初步评价.方法 预试验中,以剂量8、6、4.5 g·kg-1,对小鼠等容积[0.2 mL·(10 g)-1]一次性灌胃给药,若死亡数≥30%,按改良寇氏法设计试验测定半数致死量(LD50),否则,按倍比稀释法测定最大耐受量(MTD);对大鼠口服灌药高(6 g·kg-1)、中(3 g·kg-1)、低(1.5 g·kg-1)剂量的丹参多糖,14 d后进行常规行为观察、血生化检测、免疫脏器系数和心、肝、脾、肾、肺、胃的大体肉眼观察以及病理学检查.结果 急性毒性预试验中小鼠无1例死亡,未测出半数致死量,最大耐受量结果显示小鼠灌服丹参多糖最大耐受量为15 g·kg-1,相当于临床用药的200倍;亚急性毒性试验中,大鼠各检测指标与正常对照组相比,均无统计学差异.结论 丹参多糖无毒,可安全使用.     

具有酪氨酸酶抑制活性的丹参有效成分筛选研究

目的 筛选丹参中对酪氨酸酶活性具有抑制作用的有效成分。方法 基于受试物抑制酪氨酸酶催化底物L-多巴的反应原理,将丹参经80%乙醇提取后依次经石油醚、氯仿、醋酸乙酯、饱和正丁醇和水5种不同极性溶剂萃取,分别检测各提取部位对酪氨酸酶活性的抑制作用;并通过UPLC-MS/MS技术鉴定活性最强提取部位化学成分,结合分子对接技术预测各成分潜在活性,并通过酶学检测验证。结果 丹参氯仿萃取层具有较强的酪氨酸酶抑制活性。其生物活性与丹参素、原儿茶醛等6种成分有关,酶学检测验证结果与筛选结果一致。结论 丹参中丹参素和原儿茶醛等成分对酪氨酸酶活性具有显著的抑制作用。     

丹参活性成分及制剂改善脑侧支循环及促进血管生成的药理作用研究进展

丹参Salvia miltiorrhiza作为临床上常用的活血化瘀药,其药理作用广泛,尤其在治疗脑血管病上方面效果良好,其主要活性成分和制剂均具有良好的改善脑侧支循环及促进血管生成的药理作用。通过对改善脑侧支循环和血管生成的丹参活性成分（丹参素类和丹参酮类）和丹参类制剂（丹参注射剂如注射用丹参多酚酸、注射用丹参多酚酸盐、丹红注射液及口服制剂如复方丹参滴丸、复方丹参片、复方丹参颗粒等）的药理作用进行综述,为临床合理用药以及与侧支循环和血管生成相关的脑血管病治疗提供依据。     

深绿木霉D16生物菌肥对丹参生长和次生代谢的影响

目的 研究深绿木霉D16固体菌肥不同剂量在盆栽和大田环境下对丹参苗生长和次生代谢的影响,为深绿木霉生物菌肥在生产上的应用提供参考。方法 分别在温室和陕西商洛丹参规范化生产基地开展实验,设置不同剂量（5、15、25 g）的D16菌肥处理组3组,25 g不加菌的固体菌种培养基为对照组,测定不同剂量D16菌肥对丹参苗生物量、有效成分含量的影响。结果 不同剂量的D16菌肥对丹参生长和有效成分积累均有显著影响,施用15 g的菌肥用量效果较优,收获时在盆栽和大田环境下干重分别是同期对照组的5.61倍和1.42倍,有效成分含量最高可达盆栽同期对照组的27.91倍和大田同期对照组的1.89倍。结论 15 g的深绿木霉菌肥能显著促进丹参苗的生长和有效成分积累,为内生真菌提升中药质量的生产实践做出了有益的探索。     

丹参药材用不同水温超声提取后丹酚酸B的含量测定

目的 测定丹参药材用不同温度的水超声提取后丹酚酸B的含量,以及含量的稳定性考察,并分析含量变化的原因.方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为Zorbax SB-C18,流动相为5％冰乙酸-乙腈(82:18),流速为1.0 mL·min-1,柱温为25℃,检测波长为285 nm.结果 加入20～60℃的温度的水所超声提取的丹酚酸B的含量低且不稳定性,随时间延长而下降较快,而采用70～ 100℃的温度的水所超声提取的丹酚酸B的含量高且较稳定.结论 丹参药材中的某种酶类或菌类物质在一定温度和有水的条件下会水解丹酚酸B,应尽量避免丹参药材与水的接触.     

ADS-7多功能吸附树脂制备高纯度丹酚酸B的应用研究

目的 探讨ADS-7多功能吸附树脂对丹参中丹酚酸B的分离纯化方法。 方法 以丹酚酸B的含量及洗脱率为指标,通过动态吸附试验考察ADS-7树脂的吸附性能。 结果 ADS-7树脂对丹参中丹酚酸B具有较高的吸附选择性,吸附量为95.7 mg·g^-1(干树脂),甲酸/50%乙醇(10∶90)作为洗脱剂,丹酚酸B的纯度高达87.2%。 结论 ADS-7树脂用于丹参中丹酚酸B的分离纯化简单高效。