地高辛标记探针对泰泽氏菌PCR结果的鉴定

用泰泽氏菌可疑的小鼠肝组织匀浆腹腔注射SCID鼠和 BAL B/c小鼠肝、肾、肺、脾的 DNA,PCR扩增 ,核酸杂交。根据泰泽氏菌的保守序列合成引物扩增泰泽氏菌的基因组 DNA,建立了泰泽氏菌的套式 PCR方法 ,并将此方法应用于 SCID小鼠和 BAL B/c小鼠以及可疑样品的检测 ,其中 SCID小鼠肝、肾组织和 BAL -B/c小鼠的肝组织及可疑组织得到特异性扩增带 ,其他动物样品和组织 DNA均为阴性结果。进一步对该DNA片段进行核酸杂交 ,结果证实 ,凡 PCR套式扩增为阳性的 ,均有杂交带。因此 ,泰泽氏菌套式 PCR方法在实际检测中是切实可行。…     

微量补体结合试验法检测小鼠泰泽氏病原体抗体的初步探讨

自1917年Tyzzer在癌移植实验的小鼠中,发现以肝多发性灶坏死和出血坏死性肠炎为主要特征的本传染病以来,已在其他动物如大鼠、仓鼠、豚鼠、家兔、犬中相继发现。此病原体的存在对癌症等实验性研究有严重影响,故被公认列为无特定病原体动物应排除的病原体。该病原体呈细长形,比细菌大,易自溶,且只能在活细胞内生长。诊断该病的方法除了特征病变外,尚未完全确立。近年来国外报告应用补体结合试验和间接免疫荧光试验监测。1985年,本实验室应用微量补体结合试验的方法,对实验小鼠泰泽氏病原体抗体作了检测,结果证实本中心各小鼠群均未受到该病的感染。现报告如下:     

泰泽氏病原体抗原表位相关肽的初步筛选与鉴定

目的获得泰泽氏病原体抗原表位相关肽,用于实验动物血清中该病原体感染相关抗体的检测。方法选用泰泽氏病原体的四种单克隆抗体(M2、M3、M4、M5)作为配基,从噬菌体表面展示的随机7肽文库中筛选单抗识别的抗原表位,获得特异性噬菌体克隆;并采用ELISA、Western blot方法对其进行分析鉴定,获得阳性噬菌体克隆。结果获得阳性噬菌体克隆5个,其展示的融合蛋白能被泰泽氏病原体的免疫血清识别,ELISA检测A值的P/N为8.0～17.1;Western blot分析显示单一特异性条带,相对分子质量约为38×103。结论本研究获得的5个阳性克隆所表达的融合蛋白,为泰泽氏病原体抗原表位相关肽,可作为该病原体隐性感染血清学检测的候选抗原。     

泰泽氏菌研究若干进展

自1917年Tyzzer首次描述泰泽氏菌引起小鼠致死性肠(型)肝炎以来，已发现该菌可感染小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠、麝鼠、家兔、白尾棕兔、浣熊、郊狼、犬、灰孤、猫、雪豹、马、袋鼠和非人灵长类等哺乳动物．有报道提示也可能感染人。由于泰泽氏菌具有专营细胞内寄生，不能在无细胞培养基上生长的特点，对其许多生物学特性、分类学地位等的研究一直进展缓慢，罗函禄曾对泰泽氏病作过概述，近年来，由于泰泽氏菌在体外细胞培养上繁殖成功．使对泰泽氏菌的分类学、抗原性、感染和传播机制及检测等方面均有很大进展。     

ICR小鼠人工感染泰泽氏菌的组织病变观察

20只ICR小鼠经尾静脉途径人工感染泰泽氏菌。感染小鼠健康活泼,与对照小鼠无区别。感染后4-7天,lO只经醋酸可的松激发的小鼠其肝脏均表现出轻重不等的散在、灶性病变以至弥漫性灶性坏死,Gierasa染色镜检可见数量不等、典型的泰泽氏菌,细菌培养阴性。10只未经激发小鼠和5只对照小鼠均未见有病变,镜检也未查到泰泽氏菌。上述试验结果表明,泰泽氏菌在ICR小鼠体内的繁殖和形成肝脏病变与机体的免疫状态有密切关系。     

泰泽氏病及其隐性感染过程在生物医学研究方面的意义

小鼠中由一种毛样杆菌(Bacillus piliformis)引起的泰泽氏病(Tyzzer’s disease),对癌症研究的毁灭性影响,可能比其它小鼠疾病——甚至是脱脚病都严重。其隐性发病过程,在紧张状态下很容易被激化;据记载,在一群小鼠中有一批经辐射作用后,有47％发生了泰泽氏病,而同群中未经辐照的个体则均无发病。同样,经人工感染     

实验动物泰泽氏菌形态学特性观察

1997年曾报导过兰州地区实验动物中感染有泰泽氏菌 (Ｔｙｚｚｅｒ’ｓｏｒｇａｎｉｓｍ) ,又称毛样杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｉｌｉｆｏｒｍｉｓ) [1 ] 。由本病原菌导致的实验动物疾病 ,可能出现腹泻、体重减轻、腹部扩张、死亡等症状。但是腹泻不是啮齿动物常见的症状 ,只有兔在发病时 ,可能出现严重腹泻 ,迅速脱水和高死亡率[2 ] 。过分拥挤、高温、高湿、饲料潮湿以及免疫抑制等因素易使动物发生泰泽氏病。随着实验动物环境条件和饲养设施的改进以及实验动物微生物净化工作的开展 ,大批动物同时发病的情况并不多见。然而 ,我们在对本地…     

某实验动物科技机构人员泰泽氏菌感染的血清学调查

用泰泽氏菌RJ株作IFA抗原进行人员泰泽氏菌感染的血清学调查,结果发现,与实验动物有密切接触的饲养人员组的泰泽氏菌抗体阳性率和抗体滴度高于辅助人员组和无关人员组。     

大鼠育成群中发现泰泽氏病

在大鼠育成群中发现了泰泽氏病的流行。按感染率及眼观肝病变计算其发病率,前者为36～80％,后者为5～30％。从发病大鼠的肝脏中分离到的泰泽氏菌,用大鼠进行了传代。将此菌经口投给大鼠,向时并用可的松后,可在感染肝脏中看到形成多量的芽胞(10~(-6)～10~(-7)/g)。     

人群中泰泽氏菌感染的血清学调查

以泰泽氏菌RJ株为抗原用间接免疫荧光试验进行人群中泰泽氏菌感染的血清学调查．结果，与实验动物有密切接触的饲养人员组的泰泽氏菌抗体阳性率（85．7％）要高于相关人员组（40．5％）和无关人员组（22．0％），抗体滴度也有类似变化。这种抗体阳性率的确切意义尚待进一步研究．     

泰泽病原体研究现状

泰泽病原体(Tyzzer’s organism或Bacillus piliformis或Clostridium piliformis)是一种带鞭毛、菌毛、芽胞，专营细胞内寄生的革兰阴性杆菌。该菌广泛存在于实验动物、家禽、家畜、宠物及非人灵长类，引起动物的出血坏死性肠炎和粟粒状肝坏死。对人的潜在威胁已经引起了人们的关注。由于不能在无活细胞的人工培养基上生长、繁殖和自溶性，导致目前对该菌的生物学特性、致病机理、遗传学、诊断和检测方法以及泰泽病的预防始终没有突破性进展。本文就泰泽病原体的生物学特性、感染和传播、致病机理和病理变化等方面作一个简要的综述。     

反向斑点杂交应用于泰泽病原体检测的研究

【摘要】目的 建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体(Tyzzer)的反向斑点杂交方法（Reverse dot blot, RDB）。方法 根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针，上游引物用生物素标记，进行PCR扩增，建立反向斑点杂交方法，用此法进行了特异性和灵敏度实验，同时，用RDB、ELISA和IFA对41只小鼠、38只大鼠进行了检测。结果 RDB特异性强，最低检测限为4.5ng/µl。对79例实验动物的检测中，与ELISA检测结果一致性为100%，阳性率是7.95%（6/79）；与IFA一致性为92.4%（73/79），IFA阳性率是0%。结论 建立了PCR扩增与分子杂交相结合的准确、灵敏、特异的泰泽病原体反向斑点杂交检测方法。     

反向斑点杂交检测泰泽病原体

目的 建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体（Tyzzer’s organism）的反向斑点杂交方法（reverse dot blot，RDB）.方法 根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针，上游引物用生物素标记，进行PCR扩增，建立反向斑点杂交方法，用此法进行了特异性和灵敏度实验，同时，用RDB、ELISA和IFA对41只小鼠、38只大鼠进行了检测.结果 RDB特异性强，最低检测限为4.5 ng/μL.对79例实验动物的检测中，与ELISA检测结果一致性为100%，阳性率是7.59%（6/79）；与IFA一致性为92.4%（73/79），IFA阳性率是0%.结论 建立了PCR扩增与分子杂交相结合的准确、灵敏、特异的泰泽病原体反向斑点杂交检测方法.     

泰泽菌PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立和应用泰泽菌巢式PCR检测方法。方法 参照日本学者Goto检测泰泽菌16S rDNA序列设计的两对引物,对PCR的检测条件进行了改进和优化。结果 巢式PCR反应的外引物能引导扩增出一条625 bp的DNA片段,内引物则能引导扩增出一条196 bp的DNA片段。此625 bp和196 bpDNA片段的大小均与Goto报道的结果完全一致。试验证明196 bp的阳性带为泰泽菌16S rDNA特异性保守片段。通过将泰泽菌阳性肝组织标本经系列稀释的试验表明,该PCR方法的检测灵敏度为2个菌。另外,将阳性对照标本扩增的625 bp DNA片段作核酸序列测定,发现其碱基序列与Goto报道的泰泽菌MSK株及RJ株16S rDNA序列均有99％同源性。结论 根据上述结果,我们应用本方法对普通级小鼠、大鼠、金黄色地鼠肝组织标本各5份、普通级豚鼠肝组织标本10份、沙鼠肝组织标本10份、MHV3感染的小鼠肝组织1份进行了初步检测,结果未发现带菌动物。     

用间接免疫荧光法检测大鼠的抗泰泽氏菌抗体

用大鼠来源的泰泽氏菌芽孢RJ株经口服感染3周龄Wistar系大鼠,获得该菌抗原和抗血清,建立了检测泰泽氏病的免疫荧光法,并证实该法具有特异性。用该法检测不同饲养环境中的大鼠,结果:饲养在隔离器内的SPF级大鼠的抗体阳性率为0(0/28),饲养在开放系统内的普通级大鼠的抗体阳性率为40.9％(36/88),而饲养在同一开放系统内的普通级小鼠的阳性率仅为3％。这种差异是否反映了不同种类动物来源的菌株具有不同的抗原性,尚待进一步研究。     

实验大鼠泰泽病原体三种检测方法的比较

目的 利用不同的检测方法调查了解我国实验大鼠中泰泽病原体的携带情况,并比较三种方法的检测结果,为合理选择实验室检测方法提供依据.方法 应用ELISA法,间接免疫荧光（IFA）法和套式PCR法三种检测方法对国内大型实验动物生产厂家送检的125只实验大鼠同时进行泰泽病原体检测,并对比分析检测结果,评估我国实验大鼠泰泽病原体的携带情况.结果 共检测125只实验大鼠,其中清洁级54只,SPF级71只,IFA法检出36只阳性,89只阴性,阳性检出率28.8%：ELISA法检出24只阳性,101只阴性,阳性检出率19.2%：PCR法检出6只阳性,119只阴性,阳性检出率4.8%;ELIsA法和IFA法阳性检出率要高于PCR法.结论 对于泰泽病原体的检测,可以采用IFA法或ELISA法进行抗体检测,对可疑的样品用PCR法验证.相比而言,IFA法具有简单,可靠、价格低廉的优点,可以用于实验大鼠泰泽病原体感染状况的初步调查和流行病学监测.     

大鼠群中泰泽氏病流行方式

泰泽氏病(Tyzzer’s disease)是最先在小鼠中发现的,由一种革兰氏阴性、产生孢子的杆菌引起的传染病。本菌在人工培养基上不生长。此后,多种实验动物、家畜和野生动物曾有自然病例的报告,虽然关于此病的细菌学资料尚付阀如。近几年来,作者观察本病在大鼠群中流行的方式,井成功地使该菌在大鼠间传播。本文描述可在此大鼠饲育设施中本病的流行病学资料及病原的某些特性。本饲育设施每周从繁殖场A和B分别购入3周龄wistar大鼠约 800只,SD大鼠2000只饲养一星期左右。饲养条件相同,约有800只wistar大鼠与约600只SD大鼠同饲于一室,室温20-24℃,湿度50-56％,笼具、垫料和颗粒粒使用前经高压灭菌。1971年3月以来,用常规血清学检查和可的松刺激试验发现繁殖场     

血红素加氧酶-1显性负性突变体转基因小鼠模型的建立与鉴定

目的对泰泽病原体nested—PCR检测方法进行优化和应用研究。方法以感染泰泽病原体RJ株的大鼠肝组织作为阳性对照,按国标GB/T 14926．10—2008《实验动物泰泽病原体检测方法》间接免疫荧光检测fIFA）呈阳性的上海地区大鼠肝组织为材料,对本室已建立的泰泽病原体nested—PCR检测方法中的DNA抽提方法和PCR过程进行优化,并应用于22只免疫抑制实验动物的泰泽病原体检测。结果肝脏组织DNA以酚／氯仿抽提法为好;nested—PCR出现196bp的特异性条带,此方法的敏感性达1pg;产物纯化后进行测序比对分析显示,上海地区实验大鼠感染样品以及RJ株感染样品的序列均与Genbank中泰泽病原体16S rRNA（Genbank D14638．1）的同源性为100％。应用研究表明,22个样品中IFA检测阳性样品8个,阳性率为36．4％;Nested-PCR检测阳性样品13个,包含所有的IFA阳性样品,阳性率为59．1％。结论本方法灵敏度高,特异性强,经进一步应用改进后,可用于泰泽病原体的检测。     

实验大小鼠卡氏肺孢子虫感染的病理及病原学观察

用肺印片染色法对实验大鼠和小鼠进行卡氏肺孢子虫隐性感染的调查．结果未发现虫体。用地塞米松皮下注射大鼠，用药1～9周均可在肺内查到病原体，随痛原体数量给药次数不断增加，并可见到不同发育阶段的包囊和滋养体，病理变化也逐渐加重，主要为肺间质淋巴细胞、吞噬细胞的浸润和肺泡内泡沫状蛋白样物质渗出．对照组动物体内病原体检查阴性．无病理改变，发育正常，对用药6～9周的大鼠肝及骨髓做涂片检查，在1只重度感染的鼠肝涂片中见到包囊。     

泰泽病原体单克隆抗体的制备和鉴定

目的　制备多种抗泰泽病原体的单克隆抗体 ,用于该菌隐性感染的检测。方法　用含泰泽病原体的大鼠肝匀浆免疫BALB c小鼠 ,采用杂交瘤技术和间接免疫荧光方法筛选抗该菌的单克隆抗体 ;运用免疫电镜、Westernblotting和免疫双向扩散试验确定单克隆抗体的抗原定位和相对分子质量及IgG亚类型。结果　共筛选出 5种单克隆抗体 (M2、M3、M4、M5和M7)。免疫电镜表明 :抗体M2、M4、M5、和M7与泰泽病原体的细胞壁结合 ,而M3为抗菌毛的单克隆抗体 ;Westernblotting结果表明 :抗体M2、M3和M4与相对分子质量约为 6 4× 10 3的抗原有特异性结合 ,M5与M7与相对分子质量约为 4 1× 10 3的抗原特异性结合 ;M2、M5、M7为IgG1 ,M3为IgG2b,M4为IgG2a。对模拟自然感染大鼠考的松激发试验阳性为 2 10 ,而单克隆抗体为诊断抗体的IFA则为 8 10。除M7外 ,4种单抗不与清洁级以上大鼠回盲部细菌发生反应。结论　筛选的杂交瘤细胞能稳定分泌抗体 ,其IFA效价达 1∶10 2 4 ;表明这些抗体具有高效价、较高特异性和敏感性。