Survivin干扰RNA载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:探索合成survivin siRNA和RNAi载体的构建,及其在HEK293细胞中的表达?方法:分别采用化学合成的针对survivin的siRNA和shRNA载体(pGCsi载体),转染HEK293细胞后观察HEK293细胞中survivin的RNA及蛋白表达?结果:不同序列的siRNA和shRNA转染入HEK293细胞后,survivin的RNA及蛋白表达出现不同程度的下降?结论:化学合成与shRNA载体均可有效抑制HEK293细胞的survivin基因表达,为利用survivin作为靶点治疗胰腺癌等恶性肿瘤提供了技术基础?     

人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白,功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程,多水平、多通路地调节靶因子,其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系,文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接,构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein,GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后,转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率,用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功;重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达;获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测,SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比,SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）,抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET,并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用,为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。     

Survivin靶向的短发夹RNA表达载体的构建

目的：构建存活素（Survivin）基因短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）重组质粒并测序鉴定,为下一步探索乳腺癌基因治疗的RNA干扰途径建立基础。方法：设计并合成有小发夹结构的8条DNA片段,退火成互补双链后克隆至pSilencer adeno 1．0-CMV载体中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5。菌株,提取质粒行酶切鉴定后测序分析。结果：酶切鉴定和测序结果证实构建成功。结论：survivin shRNA重组质粒的成功构建为下一步用腺病毒包装,并感染荷瘤裸鼠行靶向RNA干扰抗乳腺癌的研究打下基础。     

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。     

靶向血管内皮细胞因子受体3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建

目的构建靶向血管内皮细胞因子受体3(VEGFR-3)的小干扰RNA重组腺病毒表达载体。方法将构建的靶向VEGFR-3特异性小干扰RNA真核表达载体pGenesil-siRNA的启动子及siRNA序列克隆入穿梭质粒pAdTrack,将质粒线性化处理后转化入pAdEasy。重组腺病毒载体线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定;扩增后感染结肠癌LoVo细胞并进行Western blotting检测VEGFR-3蛋白的表达。结果双酶切鉴定及测序证实pAdTrack-pG-siRNA及pAd-VEGFR3-siRNA质粒构建正确,扩增纯化测定重组病毒pAd-VEGFR3-siRNA的滴度为5.6×109pfu/mL。病毒感染结肠癌LoVo细胞后测定VEGFR-3蛋白表达明显降低。结论靶向VEGFR-3小干扰RNA的腺病毒载体构建成功。     

人ClC-2基因小分子干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建靶向人ClC-2基因小分子干扰RNA（siRNA）真核细胞表达载体。方法：根据DEQOR提供的siRNA设计原则和程序，设计两个靶向ClC-2基因的发夹状siRNA；通过化学合成的方法合成两对分别互补的寡核苷酸链，退火后得到编码该siRNA的ClC-2基因片段。将该片段连接至经BglⅡ和HindⅢ双酶切的真核细胞表达载体pSUPER．puro的多克隆位点，转化扩增提取质粒；对重组质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定。脂质体Lipofectamine^TM2000介导瞬时转染，通过RT-PCR检测人胶质瘤细胞系BT-325细胞中ClC-2mRNA表达。结果：经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定，目的片段与真核细胞表达载体pSUPER．puro连接正确。转染两重组质粒细胞的ClC-2mRNA表达明显降低。结论：成功构建人ClC-2基因干扰真核表达载体2个。分别命名为pSUPER．puro-siClC-21和pSUPER．puro-siClC-22，可用于进一步研究ClC-2基因对人胶质瘤侵袭和迁移活动的影响。     

Survivin基因siRNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达

目的 为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗，构建针对survivin基因的siRNA的表达载体，转染细胞EC109后观察其对survivin基因表达的抑制作用。方法 利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因mRNA的寡核苷酸序列，插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survivin。重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109，western blot检测转柒前后survivin蛋白的表达情况。结果 测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致，证实成功构建了针对survivin基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达。结论 针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建，并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达。     

靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.     

大鼠CD40基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建靶向大鼠CD40基因小分子干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体。方法:利用Ambion公司的网上设计工具,设计2个靶向CD40基因的发夹状siRNA,通过化学合成的方法合成2对分别互补的寡核苷酸链,退火后将双链DNA片段连接至pSilencer4.1-CMV neo vector的多克隆位点,转化扩增提取质粒,对重组质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定。结果:经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与pSilencer4.1-CMV neo vector连接正确,靶向大鼠CD40基因的siRNA重组表达质粒构建成功。结论:成功构建了大鼠CD40基因的RNA干扰真核表达载体pSilencer4.1-CMV-CD40.1和pSilencer4.1-CMV-CD40.2,为进一步研究CD40基因在同种器官移植排斥反应中的作用奠定基础。     

人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体的构建及测序

目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定.方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经Spe Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切线性化的pHSER-dsRNA-GFP-SIN质粒上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定.结果将合成的两对人CCL20基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后,分别克隆到线性化的pHSER-dsRNA-GFP-SIN载体质粒上.在氨苄青霉素培养基条件下,筛选出相应的阳性菌落,经DNA测序鉴定确实为所需序列.结论构建成功了2对人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,可进一步用于干扰CCL20基因的mRNA转录,从而为制备CCL20基因表达抑制型的人角朊干细胞奠定基础.     

CXCR4短发夹shRNA表达质粒的构建

目的构建趋化因子受体CXCR4shRNA质粒重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法设计有小发夹结构的两条DNA序列.经退火成互补双链,再克隆至Psilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果成功构建了CXCR4hRNA质粒重组体.结论CXCR4 shRNA质粒重组体的成功构建为研究CXCR4靶向RNA干扰抗肿瘤的作用打下基础.     

DNMT1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的:本研究利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法:设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体,转化JM109菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:DNMT1靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,可进一步利用克隆所得的小RNA序列干扰DNMT1的mRNA转录,从而达到治疗肿瘤的目的.     

MBD2靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的本研究利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术,以MBD2(methyl CpG-binding domain 2)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体,转化JM109菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论 MBD2靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中MBD2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础.     

RNA干扰技术用于survivin基因表达的研究

目的：构建pSUPER-SVV表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证survivin基因表达是否受到抑制。方法：设计特异性以survivin基因为靶序列的寡核苷酸序列,退火后将其连接于pSUPERbasic载体中,经测序鉴定插入序列的正确性。以脂质体转染方法将pSUPER-SVV干扰质粒转染人类宫颈癌（HeLa）细胞,应用流式细胞术和RT-PCR方法检测survivin基因的表达情况。结果：成功构建survivin的RNAi表达载体。该载体可以使HeLa细胞中survivin基因在mRNA转录水平明显降低,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.05）。利用流式细胞术检测蛋白表达水平,转染pSUPER-SVV组抑制率可达31.62%,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.001）。结论：成功构建干扰survivin基因表达的载体,转染HeLa细胞后survivin基因在mRNA转录水平、蛋白表达水平均受到明显抑制。     

FAK短发夹RNA干扰重组体的构建与鉴定

目的本研究利用RNA干扰技术,以粘附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)为靶基因,设计构建重组体,并对重组体进行鉴定,为下一步探索心肌纤维化的新途径奠定基础。方法设计小发夹结构四条DNA序列,经退火成互补两对双链,再克隆到载体PAVU6 27中构建重组体,转化入JM109菌株,提取质粒进行酶切鉴定、测序分析。结果酶切鉴定和测序分析均提示FAK靶向RNA干扰重组体的构建成功。结论FAK靶向RNA干扰重组体的成功构建,为下一步利用该重组体沉默心脏成纤维细胞中FAK基因的表达,探索心肌纤维化机制打下基础。     

DNMT1靶向RNAi重组体对胃癌细胞周期的影响

目的 :本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因 ,设计构建重组体 ,研究其对胃癌细胞周期的影响。方法 :设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体 ,经鉴定正确后 ,转染胃癌细胞AGS ,最后使用流式细胞仪分析细胞周期。结果 :转染后的胃癌细胞的S期细胞较前有明显减少 ,G2 -M期细胞明显增多。结论 :DNMT1靶向RNA干扰重组体转染到胃癌细胞中后促使S期细胞进入G2 -M期 ,最后衰老死亡。从而为肿瘤的治疗开辟了新途径。     

RNA干扰技术抑制EC-109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对survivin基因的siRNA,抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC-109细胞的凋亡. 方法:构建针对survivin的siRNA表达质粒,转染至EC-109细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点收集转染细胞,利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒,观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况. 结果:荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达46.70%. 半定量RT-PCR检测到pSIREN/S质粒在EC-109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%;蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒pSIREN/S的EC-109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%,而对照质粒pSIREN/CN对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经pSIREN/S转染的EC-109细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder,流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论:survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达,并能有效地诱导EC-109细胞的凋亡,为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.     

凋亡抑制蛋白-survivin基因的克隆和表达

目的:克隆survivin基因、原核表达并鉴定. 方法:从培养的人喉癌Hep-2细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得survivin基因. 将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,测序、鉴定. 将测序正确的survivin基因亚克隆到pRSET-c载体中,构建survivin表达载体,IPTG诱导表达4～5 h,做SDS-PAGE分析,鉴定survivin蛋白的表达. 结果:DNA测序证明,获得了survivin基因,其序列与GeneBank中报道序列完全一致. SDS-PAGE分析表明,survivin蛋白获得高效表达,其相对分子质量为16.5×103,表达量约占菌体总蛋白的30%. 结论:Survivin基因的克隆和表达均获得了成功. 为进一步探讨survivin基因在肿瘤诊治中应用奠定了基础.