C2株蓝氏贾第鞭毛虫TCTP基因的克隆、表达和序列分析（英文）

目的克隆C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)的翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)编码区,对其进行生物信息学分析和原核表达。方法根据WB株贾第虫TCTP编码区序列设计引物,以C2株贾第虫基因组DNA为模板扩增获得TCTP编码区片段,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),将酶切和测序验证正确的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定蛋白产物,采用Ni-NTA经亲和层析纯化重组蛋白。同时根据测序结果分析C2株贾第虫TCTP蛋白结构特征和进化关系。结果克隆了包含酶切位点全长470bp的C2株贾第虫TCTP编码区,构建了原核表达载体pET-28a(+)-TCTP,在Rosetta(DE3)中表达、纯化得到了相对分子量约18.5kDa的融合蛋白,与预期相符;测序结果显示C2株贾第虫TCTP序列与WB株相同,生物信息学分析显示贾第虫TCTP蛋白虽然序列长度较其它物种更短但与裂殖酵母TCTP空间结构相似,均由4个β折叠和3个主要的α螺旋组成,位于序列中部的不规则环状结构更小,仅9个氨基酸残基组成,在进化上与其它真核生物亲缘关系较远。结论成功克隆表达了贾第虫TCTP,为TCTP功能及贾第虫致病机制的研究提供了实验依据。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫TCTP基因的克隆、表达和序列分析

目的克隆C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)的翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)编码区,对其进行生物信息学分析和原核表达。方法根据WB株贾第虫TCTP编码区序列设计引物,以C2株贾第虫基因组DNA为模板扩增获得TCTP编码区片段,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),将酶切和测序验证正确的重组质粒转化E. coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定蛋白产物,采用Ni-NTA经亲和层析纯化重组蛋白。同时根据测序结果分析C2株贾第虫TCTP蛋白结构特征和进化关系。结果克隆了包含酶切位点全长470 bp的C2株贾第虫TCTP编码区,构建了原核表达载体pET-28a(+)-TCTP,在Rosetta(DE3)中表达、纯化得到了相对分子量约18.5 kDa的融合蛋白,与预期相符;测序结果显示C2株贾第虫TCTP序列与WB株相同,生物信息学分析显示贾第虫TCTP蛋白虽然序列长度较其它物种更短但与裂殖酵母TCTP空间结构相似,均由4个β折叠和3个主要的α螺旋组成,位于序列中部的不规则环状结构更小,仅9个氨基酸残基组成,在进化上与其它真核生物亲缘关系较远。结论成功克隆表达了贾第虫TCTP,为TCTP功能及贾第虫致病机制的研究提供了实验依据。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP基因的克隆表达及蛋白结构分析

目的 利用大肠杆菌对C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白(Impact-like protein)进行克隆表达,运用生物信息学软件进行蛋白结构分析。方法 提取C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA,PCR扩增ILP基因,构建pGM-T重组载体,挑选阳性克隆并进行序列分析;将ILP基因连入原核表达载体pET-28a(+),并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。运用PSIPRED和SWISS-MODEL进行蛋白结构分析。结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-ILP,该基因全长831 bp。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白条带出现在相对分子量约33 kD的位置,与预期相符。Western blot结果表明,大肠杆菌成功表达了重组蛋白。结论 成功克隆、表达并分析C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白,为蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白结构与功能的研究提供了有价值的资料。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP基因的克隆表达及蛋白结构分析北大核心CSCD

目的利用大肠杆菌对C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白(Impact-like protein)进行克隆表达,运用生物信息学软件进行蛋白结构分析。方法提取C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA,PCR扩增ILP基因,构建pGM-T重组载体,挑选阳性克隆并进行序列分析;将ILP基因连入原核表达载体pET-28a(+),并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。运用PSIPRED和SWISS-MODEL进行蛋白结构分析。结果成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-ILP,该基因全长831bp。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白条带出现在相对分子量约33kD的位置,与预期相符。Western blot结果表明,大肠杆菌成功表达了重组蛋白。结论成功克隆、表达并分析C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白,为蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白结构与功能的研究提供了有价值的资料。     

蓝氏贾第鞭毛虫胞外核酸酶的表达纯化和活性鉴定

目的 克隆、原核表达蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,贾第虫)的胞外核酸酶编码区,并对其蛋白产物进行活性鉴定。方法 对贾第虫胞外核酸酶(GeNuc)蛋白进行生物信息学分析,根据分析结果以C2株贾第虫基因组DNA为模板扩增获得GeNuc去信号肽段编码区序列,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),将酶切和测序验证正确的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定蛋白产物。Ni-NTA亲和层析纯化GeNuc蛋白,经复性后验证其对质粒DNA的水解能力。结果 成功克隆了长约800 bp的GeNuc编码区并构建了原核表达载体pET-28a(+)-GeNuc,测序结果显示C2株GeNuc序列与WB株相同;在大肠杆菌中诱导表达获得了相对分子量约30.8 kDa的融合蛋白;复性后的纯化GeNuc蛋白具有降解双链DNA的能力,但活性较商品化DNaseⅠ低。结论 证明了GeNuc的存在,为GeNuc抗体的制备及贾第虫致病机制的研究提供了实验材料。     

中国人源蓝氏贾第鞭毛虫ppdk基因的克隆及其表达产物的鉴定

目的获取中国人源性蓝氏贾第鞭毛虫ppdk基因及相关基因产物方法以中国人源性贾第虫基因组DNA为模板,设计引物进行PCR扩增,获取ppdk基因并进行测序分析。筛选得到的阳性克隆连接至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达载体,并转化宿主菌大肠埃希菌感受态细胞E.coliBL21(DE3),进行重组蛋白的IPTG诱导表达。收集重组表达产物进行亲和层析纯化,再用Western blot进行免疫学分析鉴定。结果序列测定分析可知,获得的阳性克隆插入片段包含一个2 655 bp的开放阅读框架;比对其基因序列发现,其与ATCC 50803(美国WB虫株C6株)的同源性可高达99%。该基因片段编码884个氨基酸,预测其表达蛋白的分子质量单位大小约为97.6 ku。Western blot显示该基因序列的原核表达产物能够被抗6个组氨酸标签的特异性抗体识别,提示重组表达产物为实验预期的目的蛋白。结论对贾第虫ppdk基因进行了克隆及原核表达,并对表达产物进行了纯化和免疫学初步鉴定,为贾第虫病治疗的高通量药物筛选等的研究奠定了基础。     

型特异性基因鉴定法确定蓝氏贾第鞭毛虫C2株基因型的研究北大核心CSCD

目的鉴定中国四川蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)C2株的型特异性基因,为其基因分型提供依据。方法根据GenBank中收录的贾第虫基因序列,选取贾第虫WB株的2个型特异性基因和GS株的5个型特异性基因,设计引物,以C2株基因组DNA为模板,进行PCR反应。从中选取一个没有PCR产物的基因设计外围引物(该引物预期能扩增出此基因的侧翼序列和其相邻基因的部分序列),再次进行PCR反应。将纯化的PCR产物克隆至pMD19-T载体并测序。型特异性基因的缺失通过对其相邻片段的扩增验证。结果从中国四川贾第虫C2株基因组DNA中成功扩增出贾第虫WB株的2个型特异性基因GL50803_3386和GL50803_4447,扩增片段长度分别为1 586bp和1 080bp,并证实其缺失1个贾第虫GS株的型特异性基因GL50581_2613。结论中国四川贾第虫C2株可能属于贾第虫WB株。     

蓝氏贾第鞭毛虫末端结合蛋白 1 基因的克隆与原核表达

目的 克隆并原核表达 C2 株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia,简称贾第虫)末端结合蛋白 1(End-bind- ing protein 1,geb1)基因,获得重组 gEB1 蛋白。 方法 由于 geb1 基因无内含子,我们以 C2 株贾第虫基因组为模板,以国际标准株WB 株geb1 基因序列为参考序列,设计引物克隆 geb1 基因,经 NcoⅠ和 XhoⅠ双酶切与原核表达载体 pET-28α(+)连接,转化感受态 E. coli TOP10,经筛选和测序验证后导入大肠杆菌 E. coli Rosetta(DE3),异丙基-β-D -硫代半乳糖(IPTG)诱导 gEB1 蛋白表达,产物经 SDS-PAGE 和 Western blot 进行检测和验证。 结果 成功构建了表 达 C2 株贾第虫 geb1 基因的原核表达载体 pET-28α(+)- gEB1,转化入大肠杆菌 E. coli Rosetta(DE3),重组菌株经 0. 1 mmol / L IPTG ,30℃低温诱导 5 h, SDS-PAGE 和 Western blot 显示,在相对分子量约 29 KDa 的位置出现目的蛋 白条带,与理论值一致。 结论 用大肠杆菌成功表达了 gEB1 蛋白,为 gEB1 蛋白的功能研究和抗体制备提供了材料。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H3基因的克隆表达与基因分析

目的 克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫进行同源分析,构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树。方法 PCR扩增获取H3组蛋白基因,构建pGM-T-H3重组载体,转化E. coli TOP10感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,利用限制性内切酶NcoⅠ和 XhoⅠ构建pET28a(+)-H3重组载体,转化E. coli Rosetta( DE3),IPTG诱导组蛋白H3表达,Western blotting鉴定表达,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H3组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果 成功克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,同源比对结果显示C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因序列与美国WB株完全一致,但与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远。结论 C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树分析表明贾第虫H3组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早,本研究结果为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的实验资料。     

我国首株牛源贾第虫的分子鉴定

目的通过16S及内转录间区(ITS)rDNA基因序列的扩增、克隆以及序列分析,从分子水平对首次在我国分离的一株牛源贾第虫进行种类及基因型鉴定。方法根据GenBank中登录的贾第虫rRNA基因序列,设计引物,采用热启动-降落PCR方法从牛源贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段,经TA克隆至pMD18-T载体后测定其核苷酸序列,然后进行序列分析。结果成功地扩增出该株牛源贾第虫的16S rRNA全基因及rDNA ITS序列,大小为1 715 bp,包括1 447 bp的16S rDNA全长序列和243 bp的ITS间区序列,以及25 bp的26S rDNA基因5'末端。序列分析表明此牛源贾第虫为E型蓝氏贾第虫。结论本研究从分子水平鉴定我国首株牛源贾第虫为蓝氏贾第虫(E型),并首次报道了该虫株的rDNA 16S及ITS序列,为牛源贾第虫的进一步研究奠定了基础。     

蓝氏贾第鞭毛虫沉默信息调节因子2(Sir2)基因的克隆、表达与纯化

目的获取蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,Gl)沉默信息调节因子2(Sir2)基因序列及其重组蛋白。方法以蓝氏贾第鞭毛虫中国C2克隆株基因组DNA为模板,PCR扩增GlSir2基因编码序列,将所得片段连接至pMD-19T质粒。转化大肠埃希菌(E.coli)JM109,挑取阳性克隆进行测序。将GlSir2基因插入原核表达载体pET28b,构建表达载体pET28b-GlSir2,转化E.coli BL21(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况。收集重组表达产物,用8 mol/L尿素溶解包涵体并收集上清,镍离子亲和层析进行纯化。将纯化产物透析复性,蛋白质印迹(Western blotting)进行免疫学鉴定。结果获得了蓝氏贾第鞭毛虫中国C2克隆株GlSir2基因编码序列,该序列包含一个1 680 bp的开放阅读框架,可编码559个氨基酸,预测其蛋白的相对分子质量(Mr)约为62 800。构建表达载体pET28b-GlSir2,经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式表达。溶解包涵体并经纯化后的目的蛋白纯度达80%以...     

华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析

目的 对华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基（CsF₀-ATP-synt_B）基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。 方法 以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F₀-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板，扩增该基因（去除线粒体靶向序列的成熟肽基因），将其克隆到原核表达质粒pET-28a（+）中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠，制备抗血清。蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性。 结果 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基，编码271个氨基酸，相对分子质量（Mr）为31 171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。 结论 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin多克隆抗体的制备及鉴定

目的 原核表达刚地弓形虫过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin,Prx)并制备多克隆抗体。方法 PCR技术扩增弓形虫cDNA中的prx基因,克隆至pET-28a(+)载体,构建prx/pET-28a(+)重组表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)Rosetta中诱导表达。亲和层析纯化重组Prx蛋白,并制备兔多克隆抗体,蛋白印迹技术对多克隆抗体进行鉴定。结果 成功从弓形虫cDNA中扩增出prx目的基因,构建了prx/pET-28a(+)重组质粒,获得抗Prx重组蛋白的多克隆抗体。蛋白印迹技术检测出弓形虫Prx的特异性条带。结论 重组弓形虫Prx制备的多克隆抗体能检测Prx在弓形虫速殖子表达。     

幽门螺杆菌GGT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆幽门螺杆菌( H pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在大肠杆菌中的表达.方法: 从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,酶切和测序验证,构建原核表达载体pET-28a(+)-GGT,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析检测表达产物.结果: 成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pET-28a(+)-GGT质粒,高效表达出了68 kDa的融合蛋白.结论: 在大肠杆菌中成功表达了GGT重组融合蛋白,为进一步研究GGT与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系奠定了基础.     

广州管圆线虫ASP基因的克隆及原核表达

目的对广州管圆线虫ASP基因的完整开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫性分析。方法以广州管圆线虫幼虫cDNA文库中含有ASP基因的质粒为模板,扩增目的基因,进一步将其克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-IDA亲和层析纯化表达产物。免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫性。结果广州管圆线虫ASP基因的编码区含有366个碱基,编码121个氨基酸,相对分子量(Mt)为13398.26Da。重组质粒pET-30a(+)-ASP构建成功,IPTG诱导获得可溶性表达的重组蛋白,经亲和层析获得的纯化蛋白可被广州管圆线虫病人血清识别。结论广州管圆线虫ASP基因可在原核表达系统中获得具有免疫性的高效表达。