E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

E—选择突变体的构建和表达

从ｐＵＣ１８／Ｅ－选择素（Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ ＣＤ６２Ｅ）重组质粒，以ＰＣＲ的方法扩增得到Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ突变体ＣＤ６２Ｅ１和ＣＤ６２Ｅ２基因。将其分别插入痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的单一ＳｍａＩ位点，在痘苗病毒真核系统中进行了表达。初步的细胞粘附功能试验结果表明，Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ分子不同结构域的可削弱其粘附能力，为进一步研究Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ公子的结构与功能奠定了基础。     

E-选择素突变体的构建和表达

从ｐＵＣ１８／Ｅ－选择素（Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎＣＤ６２Ｅ）重组质粒，以ＰＣＲ的方法扩增得到Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ突变体ＣＤ６２Ｅ１和ＣＤ６２Ｅ２基因。将其分别插入痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的单一ＳｍａⅠ位点，在痘苗病毒真核系统中进行了表达。初步的细胞粘附功能试验结果表明，Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ分子不同结构域的缺失可削弱其粘附能力，为进一步研究Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ公子的结构与功能奠定了基础。     

E-选择素及其配体在肝细胞癌中的表达

侵袭和转移是恶性肿瘤主要的生物学特性之一。研究表明：肿瘤侵袭转移过程中均存在细胞粘附分子及其介导的粘附行为的改变。对肿瘤细胞与内皮细胞间粘附作用的研究还有助于阐明肿瘤转移的器官特异性的分子机制。Ｅ选择素是粘附分子选择素家族中的一员,其配体ｓＬｅＸ／...     

E－选择素cDNA克隆

Ｅ－选择素ｃＤＮＡ克隆胡美茹，汲言山，马民慧，舒翠玲，沈倍奋（军事医学科学院基础医学研究所北京１００８５０）粘附分子是指介导细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子。它们主要参与细胞的转导与活化、细胞的伸展与移动、细胞的生长及分化、肿瘤转移、创伤...     

hIL－16cDNA的克隆、测序及在E.coli中的表达与纯化研究

在国内首次从人的外周血单个核细胞（PBMC）中克隆了人白细胞介素－16(hIL－16)cDNA,并应用一种新型的大肠杆菌表达系统─硫氧还蛋白表达系统,成功地表达了重组hIL－16。hIL－16cDNA的扩增从人PBMC中提取总RNA,poly(T)8－12反转录cDNA,以半巢式PCR扩增出特异的DNA片段。hIL－16cDNA的克隆、测序与表达利用     

E-选择素不同结构域缺失对其粘附功能的影响

目的研究Ｅ－选择素不同结构域缺失对其粘附功能的影响。方法从人胎脐静脉内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法获其全长ｃＤＮＡ，设计并合成三对缺失Ｅ－选择素分子的ＥＧＦ结构域及ＥＧＦ＋ＣＲ１＋ＣＲ２结构域引物，并将三者基因分别在痘苗病毒真核表达系统中表达。结果细胞粘附功能试验结果表明，Ｅ－选择素分子ＥＧＦ结构域或ＥＧＦ＋ＣＲ１＋ＣＲ２结构域的缺失削弱了Ｅ－选择素分子的粘附能力。此外，本研究尚克隆并在痘苗表达系统中表达了可溶性Ｅ－选择素分子。结论Ｅ－选择素分子不同结构域缺失对其粘附能力削弱现象的发现为临床某些疾病的发病机理揭示及治疗提供了线索。可溶性Ｅ－选择素分子在痘苗病毒表达系统中表达成功为与其介导的白细胞粘附、肿瘤转移等过程的调节奠定了物质基础     

IL-1β诱导新生牛脑微血管平滑肌细胞表达E-选择素

Ｅ选择素是细胞粘附分子中选择素（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）家族的主要成员之一,属人类白细胞分化抗原ＣＤ６２Ｅ,为１１０ｋＤ的跨膜糖蛋白［１］;大多数研究认为,Ｅ选择素只表达在受细胞因子作用后的血管内皮细胞［２］,但近来有文献报道,非内皮源性的细胞经细胞因子或脂多糖诱导后也可表达Ｅ选择素［３,４］。本研究将观察新生牛脑微血管内皮细胞（ＢＣＭＳＭＣ）经ＩＬ１β诱导后是否表达Ｅ选择素。１　材料与方法１１　动物　新生牛,雄性,购自上海光明乳制品公司奶牛场;Ｗｉｓｔａｒ大鼠,雌雄兼用,本校实验动物中…     

逆转录PCR克隆L—选择素cDNA

本文为从转录水平研究Ｌ－选择素表达的调节机制，利用Ｇｏｌｄｋｅｙ软件及ＥＭＢＬ数据库选出人与大鼠Ｌ－选择高源性但与其它细胞因子及其受体无高源性的ｃＤＮＡ片段，设计ＰＣＲ引物，一步法分离Ｂ系Ｒａｊｉ细胞ＲＮＡ，逆转当ＰＣＲ扩增目的的片段，ＨｉｎｆⅠ酶切初步确定后，将片段插入ＰＵＣ１９质粒ＨｉｎｃⅡ位点，转化ＪＭ１０９大肠杆菌，经测序初步证实扩增克隆片段与设计相符。     

CD34基因克隆和表达

ＣＤ３４分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于多功能造血干细胞、祖细胞表面，在成熟血细胞表面无ＣＤ３４抗原表达，提示ＣＤ３４分子在早期造血调控方面起着重要的作用。本文采用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从高表达人ＣＤ３４抗原的ＫＧ－１ａ细胞系中成功地克隆出人ＣＤ３４抗原全长ｃＤＮＡ，并将此基因插入克隆“载体ｐＵＣ１８ＨｉｎｃＩＩ酶切位点，构建了重组质粒ｐＵＣ１８－３４。用双酶切ｐＵＣ１８－３４质粒，将分离得到的基因片段插入痘苗病毒载体的ＳｍａⅠ位点，构建了重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－３４。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ＰＪＳＡ１１７５－３４转染已被野生痘苗病毒感染的ＴＫ￣－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人ＣＤ３４抗原全长ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＡＰ检测，表明重组痘苗病毒能特异地表达人ＣＤ３４抗原。人ＣＤ３４抗原ｃＤＮＡ克隆和表达，为进一步研究其结构和功能的关系以及研究造血调控机理奠定了基础。     

大鼠神经肽Y前体cDNA克隆,测序及哺乳动物细胞表达载体的构建

利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从大鼠脑组织中钩得神经肽Ｙ前体ｃＤＮＡ编码区序列，将该ｃＤＮＡ定向亚克隆入哺乳动物细胞表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ中，构建了重组质粒ｐＲｃ／ＣＭＶ－ＮＰＹ。经双脱氧核苷酸终止法对插入片段作序列分析，证明ＮＰＹｃＤＮＡ序列的准确性及插入方向正确。     

CLONING AND EXPRESSION OF cDNA FOR HUMAN LYMPHO-TOXIN

人淋巴毒素（ｈＬＴ）系由淋巴细胞经抗原或有丝分裂原活化后产生的一类细胞因子，它具有抗瘤、抗病毒活性和许多重要的免疫调节作用，是一种非常有前途的生物制剂。近年来发现的膜相关型淋巴毒素更提示ｈＬＴ可能具有尚未被揭示的免疫调节活性。因此，克隆人ＬＴｃＤＮＡ并在大肠杆菌表达重组ｈＬＴ，对于ｈＬＴ的开发利用和研究其功能都具有重要意义。本实验按照公布的ｈＬＴｃＤＮＡ序列，经计算机分析并结合实验要求设计并合成一对ＰＣＲ引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化２４ｈ的人Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ扩增出一５４１ｂｐＤＮＡ片段；经α－互补筛选，质粒小量快速抽提，限制性内切酶酶切鉴定，将该片段定向克隆于ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９质粒载体。限制性内切酶图谱分析和Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法序列测定表明：该ＤＮＡ片段与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致。它包括编码人淋巴毒素成熟肽的全部ｃＤＮＡ序列。再进一步将该ｃＤＮＡ片段克隆于原核表达载体ｐＢＶ２２０，经地高辛标记探针菌落原位杂交筛选，限制性内切酶酶切鉴定方向，筛选出一阳性重组子ｐＢＶ－ｈＬＴ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析表明：经温控诱导，该重组菌成功     

B7—1（CD80）基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞系Ｒａｊｉ中克隆到Ｂ７－１（ＣＤ８０）ｃＤＮＡ，并经测序证实，将其插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ中，用脂质体转染小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，Ｇ４１８筛选，并经流式细胞仪检测，得到了细胞表面表达Ｂ７－１的重组克隆。ＰＣＲ从其基因组ＤＮＡ中扩增到Ｂ７－１基因，提示Ｂ７－１ ｃＤＮＡ已整合至宿主细胞的基因组ＤＮＡ中，本文为研究Ｂ７－１在肿瘤免疫中所起的作用奠定了基础。     

恶性疟原虫丝氨酸重复抗原部分基因的克隆及其表达

采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株(PFD-3/YN)丝氨酸重复抗原基因片段,经基因序列测定后克隆于pWR450-1融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌TG1。在不同菌体浓度及不同剂量IPTG诱导下检测SERA融合蛋白的表达。采用dot-ELISA及Western-blot分析对表达产物进行鉴定,结果显示SERA基因与pWR450-1重组后在大肠杆菌TG1中表达一72kDa的融合蛋白,当工程菌OD590值为0.8～1.2时,加入终浓度1mmol/LIPTG进行诱导,表达量较高。dot-ELISA和Westernblot分析表明SERA基因表达产物能被抗SERA单克隆抗体所识别。     

阴道毛滴虫黏附蛋白ap33基因克隆及其表达

通过提取阴道毛滴虫mRNA ,逆转录合成cDNA ,PCR得到预期长度片段后 ,将其克隆到pUCm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析 ,并与GeneBank中核苷酸序列进行同源性分析。再将其克隆至表达载体PET-32a。重组子用酶切、PCR和测序鉴定后 ,转化大肠杆菌并以异丙基 -B- D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。从阴道毛滴虫临床分离株中扩增出 92 7bp的ap33的基因片段 ,构建重组质粒PET- 32a (+) - ap33;IPTG诱导后 ,SDS -PAGE显示表达产物的大小约 5 0kDa。     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

在大肠杆菌中高效表达DMD cDNA 5－7蛋白

选择ＤＭＤ／ＢＭＤ缺失突变热点区基因片段ｃＤＮＡ５～７ｋｂ，经序列测定，逐步克隆，插入到原核表达载体ｐＳＭ４３，转化大肠杆菌ＴＡＰ１０６，获得了重组基因的高效表达菌株，成功地表达出分子量４９０００的ＤＭＤｃＤＮＡ５－７蛋白，表达量占菌体总蛋白的１２％。为进一步研究Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ结构与功能奠定了基础，并为临床开展蛋白诊断的应用研究制备了基因工程抗原。     

小鼠白细胞介素18的基因克隆及其融合蛋白的表达

白细胞介素１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８，ＩＬ－１８）是一种能诱导ＩＦＮ－γ产生的新型细胞因子，在调节Ｔｈ１型细胞免疫应答中起重要作用。采用逆转录ＰＣＲ从活化的小鼠腹腔巨噬细胞中获得了小鼠ＩＬ－１８（ｍＩＬ－１８）ｃＤＮＡ，测序鉴定正确的片段经ＥｃｏＲＩ酶切后克隆入ＧＳＴ融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，再转化至大肠杆菌ＤＨ５ａ高效表达，经纯化获得了有活性的ｍＩＬ－１８融合蛋白。     

人白细胞分化抗原CD28基因克隆及序列分析

ＣＤ２８分子是秀达于Ｔ淋巴细胞表面的大小约４４ｋＤ的双链同型二聚体多肽分子。ＣＤ２８可以通过共刺激的途径激活杀伤性Ｔ淋巴细胞，在肿瘤免疫中发挥重要作用，为了真核细胞表达ＣＤ２８分子并制备ＣＤ２８分子的单克隆抗体，以进一步研究ＣＤ２８分子在信号传递方面的功能，利用逆转录多聚酶链反应的方法，扩增了人ＣＤ２８分子的全序列基因，并将其克隆于ｐＵＣ１９质粒，进行了ＤＮＡ序列分析，为真核细胞表达ＣＤ２８分子并