间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的序列和重组抗原表位分析

目的对间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)基因的序列及重组抗原的表位进行比较分析。方法根据GenBank中已知的pLDH基因序列(登录号为DQ198262和DQ060151)设计特异性引物,体外扩增间日疟原虫和恶性疟原虫LDH的全长基因,对两序列进行比对分析,用SYFPEITHI软件进行表位预测分析。将Pv-LDH和Pf-LDH基因克隆入pET28a表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Westernblotting和中和ELISA法鉴定重组蛋白。结果Pv-LDH和Pf-LDH基因的编码区全长均为951bp,编码316个氨基酸,Pf-LDH与参考序列DQ198262完全一致,而Pv-LDH与参考序列DQ060151仅在第666位有一个核苷酸的变异;两者的核苷酸和氨基酸序列的一致性分别为75.1%和90.2%。T细胞表位预测分析结果显示,能识别pLDH抗原表位的人类白细胞抗原(HLA)分子类型共28种,预测的表位数约为180个,相同或相似的表位约占总表位数的75%,Pv-LDH和Pf-LDH特异性表位分别为38个和45个。Westernblotting分析显示,Pv-LDH重组抗原可被疟疾患者血清识别,但反应强度明显低于Pv-LDH重组抗原免疫兔血清。中和ELISA试验结果显示,Pv-LDH抗原对多克隆抗体最高抑制率可达70.3%,而Pf-LDH抗原的最高抑制率仅为30.5%。结论Pv-LDH和Pf-LDH基因的核苷酸序列及其重组抗原均有差异,特异性表位诱导的抗体在整个抗体谱中相对较少。     

人体疟原虫乳酸脱氢酶基因多态性及B细胞表位预测

目的　分析4种人体疟原虫乳酸脱氢酶（Plasmodium lactate dehydrogenase, pLDH）基因多态性并预测pLDH 肽链B细胞抗原表位。方法　收集传染病报告信息管理系统中登记的云南省疟疾病例血样和流行病学等信息。采用巢式PCR技术扩增4种人体疟原虫pLDH基因并测序,应用MEGA 7.0.26和DnaSP 5.10软件分析4种人体疟原虫pLDH基因DNA序列多态性,并采用免疫表位数据库（IEDB）预测pLDH 肽链B细胞抗原表位。结果　分别从153份间日疟、29份恶性疟、17份卵形疟和11份三日疟患者血样中获得间日疟原虫LDH（PvLDH）、恶性疟原虫LDH（PfLDH）、卵形疟原虫LDH（PoLDH）、三日疟原虫LDH（PmLDH）基因测序序列,分别定义15、2、4、2种单倍型,核苷酸多样性指数（π）为0.104。PoLDH基因种内分化程度较高,π为0.012;PvLDH、PfLDH和PmLDH基因π值均 < 0.001。4种人体疟原虫pLDH肽链可预测到4～5个/链的B细胞抗原活性区,活性得分约0.430;其中活性区短肽“86⁃PGKSDKEWNRD⁃96”为4种人体疟原虫共有的B细胞抗原表位,“266⁃GQYGHS(T)⁃271”仅出现在PvLDH和PoLDH肽链,PvLDH、PfLDH肽链特有的B细胞抗原表位分别是“212⁃EEVEGIFDR⁃220”和“208⁃LISDAE⁃213”。结论　PoLDH基因多态性可能来自微弱的负向纯化选择,PvLDH、PfLDH、PmLDH基因则可能维持了相对保守状态。pLDH肽链近C端可能存在可区分间日疟、恶性疟原虫感染的B细胞抗原表位“212⁃EEVEGIFDR⁃220”和“208⁃LISDAE⁃213”。     

化学合成恶性疟原虫杂合45肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

为了使化学合成的人恶性疟原虫杂合45肽抗原基因(HPFAG)在大肠杆菌中表达,我们将HPFAG与表达载体pWR450.1质粒重组连接,转化大肠杆菌,获得一批转化子。这些转化子经质粒DNA斑点杂交试验,蛋白质SDS—PAGE和DNA酶解分析,表明化学合成的HPFAG与表达载体质粒发生了重组,且有6个重组子在大肠杆菌中与p—半乳糖苷酶呈融合蛋白形式表达。     

恶性疟原虫var基因家族与抗原变异研究进展

恶性疟原虫变异抗原基因(var基因)家族编码的恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)是介导恶性疟原虫抗原变异和红细胞黏附微血管的媒介。本文从恶性疟原虫抗原变异和致病性、感染红细胞表面变异分子的表达、var基因家族的基因结构、PfEMP1蛋白的黏附特性以及var基因家族的变异调控等方面对恶性疟原虫var基因家族与抗原变异的研究进行综述。     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体制备及功能分析

目的 制备恶性疟原虫（FCC1/HN株）融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体，分析其生物学特性及功能。 方法 用PfCP-2.9免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG1500）作用下进行融合，制备单克隆抗体，并分析其特性。 结果 获得1株能分泌抗PfCP-2.9的小鼠杂交瘤细胞株单克隆抗体F12D，经免疫球蛋白类型和亚类鉴定为IgG1。ELISA和蛋白质印迹法（Western blotting）显示单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应，F12D所识别的PfCP-2.9抗原表位不能耐受还原剂巯基乙醇，表明F12D识别的是构象表位。间接免疫荧光试验（IFA）显示F12D可识别培养的FCC1/HN。体外抑制试验结果显示，F12D终浓度为0.3 mg/ml时，对FCC1/HN的抑制率为56%。 结论 单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应，其所识别表位为构象表位，F12D可识别体外培养的FCC1/HN，并对其生长具有抑制作用。     

基于蛋白重复序列及线性B细胞表位预测筛选间日疟原虫特异性抗原肽

目的 目的 建立一种基于蛋白重复序列及线性B细胞表位预测筛选间日疟原虫 （Plasmodium vivax,P. vivax） 特异性抗 原肽的方法。方法 方法 以PlasmoDB数据为基础, 建立间日疟原虫蛋白序列数据库。编写重复序列查找软件, 逐一检索16 aa 多肽在全部蛋白序列中的重复次数, 统计出重复较高者进行连续B细胞表位预测, 优选具有间日疟原虫特异性的肽进行合 成, 偶联钥孔戚血蓝蛋白 （Keyhole limpet hemocyanin, KLH） 后免疫小鼠, 并检测抗体滴度。 结果 结果 通过软件分析间日疟原 虫全部5 432个蛋白序列中的16肽的重复次数, 利用BcePred网站预测其中重复较高的1 000个序列, 获得22个候选肽, 经 聚类分析和相似性比较, 优选到5个潜在特异性肽, 人工合成并偶联KLH后免疫小鼠诱生的抗体滴度均超过1 : 9 000。 结 结 论 论 建立了一种基于蛋白重复序列联合线性B细胞表位预测筛选间日疟原虫特异性抗原肽的方法, 得到的5个肽均能诱 导小鼠产生高滴度抗体。     

化学合成恶性疟原虫杂合抗原基因表达产物免疫功能的研究

本文报道化学合成恶性疟原虫杂合抗原基因３个重组克隆菌表达产物，经ＰＡＧＥ纯化后，免疫家兔制备血清，琼脂双向扩散和酶联免疫吸附试验及Ｗｅｓｔｅｒａ ｂｌｏｔ和原虫体外生长抑制试验，结果表明化学合成恶性疟原虫杂合抗原基因表达产物均具有良好的免疫原性及明显的抑制其原虫体外生长的作用。     

鼠疫菌抗原CTL表位预测方法的建立

目的 建市鼠疫菌抗原CTL表位的预测方法 ,为鼠疫菌表位组学研究提供行之有效的研究平台.方法 采用nHLAPred,BIMAS和SYFPEITHI网络预测法对IJcrV抗原的CTL表位进行预测.结果 预测得到了LcrV的特异性CTL优势表位:V8～16 NPQHFIEDL,V311～319 KYDSVMQRL和V258～264SYNKDNNEL.结论 结合小同预测方法 进行工细胞表位的预测,可得到鼠疫菌LcrV抗原的CTL表位,具有较高的准确率,可为表位网谱的绘制提供参考依据.     

恶性疟原虫的基因表达控制

由疟原虫感染引起的疟疾是一种严重危害人体健康的寄生虫病,在发展中国家造成巨大的经济损失.恶性疟原虫基因组测序的完成,使实验室可以更进一步研究恶性疟原虫的基本生物学过程,其中恶性疟原虫基因表达调控受到重视.严格的基因表达模式控制着疟原虫的分化,随着一些假定转录因子的鉴定,恶性疟原虫的基因表达调节机制可能与真核生物不一样.该文对恶性疟原虫基因调节的最新研究进展进行了综述.     

恶性疟原虫var基因家族研究进展

疟疾严重威胁人类健康，恶性疟原虫是致疟疾病例死亡的主要病因。PfEMP1蛋白由var基因家族编码在恶性疟原虫的生存和重症疟疾发病过程中起重要作用。vor基因家族基因数目多，调控机制复杂，一直是研究的热点。该文就vor基因家族的分布、结构、多态性、转录、表达及其调控机制方面近期的进展加以综述。     

Immunogenicity of recombinant fragments of Plasmodium falciparum acidic basic repeat antigen produced in Escherichia coli

The acidic basic repeat antigen (ABRA) of Plasmodium falciparum is a potential vaccine candidate against erythrocytic stages of malaria. We report, for the first time, the immunological characteristics of recombinant ABRA constructs. The recombinant proteins representing different fragments of ABRA were expressed in Escherichia coli, either as fusions with maltose binding protein or as 6X histidine tagged molecules, and purified by affinity chromatography. Immunogenicity studies with these constructs in rabbits and mice indicated that the N-terminal region is the least immunogenic part of ABRA. T-cell proliferation experiments in mice immunized with these constructs revealed that the T-cell epitopes were localized in the middle portion of the protein. More importantly, the purified immunoglobulin G specific to middle and C-terminal fragments prevented parasite growth at levels approaching 80-90%. We found that these proteins were also recognized by sera from P. falciparum-infected patients from Rourkela, a malaria endemic zone of India. Our immunogenicity results suggest that potential of ABRA as a vaccine candidate antigen should be investigated further.     

恶性疟原虫AMA-1基因变异区在大肠杆菌中的诱导表达

目的　恶性疟原虫 (P.f .) AMA- 1蛋白抗原在大肠杆菌中的表达。　方法　以 FCC1/ HN基因组DNA作为模板 PCR扩增 AMA- 1基因变异区 ,扩增产物以 Bam H 和 H ind 双酶酶切后作为插入片段 ,与具有相同粘性末端的表达质粒 p QE- 40连接 ,并用 DNA自动测序仪测定 AMA- 1DNA片段的序列。取含重组表达质粒的重组菌株以 IPTG进行诱导表达 ,表达产物以 SDS- PAGE电泳和以兔抗 AMA- 1抗血清进行 Western blotting分析鉴定。　结果　 FCC1/ HN AMA- 1基因变异区 DNA序列长度为 5 0 6 bp,预计编码 16 8个氨基酸。 Westernblotting分析确认诱导后的 SG130 0 9/ AMA- 1表达产物在分子量约 2 3.0 k Da处出现 1条与兔抗 AMA - 1抗血清特异反应的条带。　结论　 FCC1/ HN AMA- 1基因变异区在大肠杆菌中获得表达 ,Western blotting分析表明该蛋白片段含有特异抗原表位     

重组恶性疟原虫醛缩酶鉴定及其单克隆抗体的制备

目的 鉴定重组表达的恶性疟原虫醛缩酶（ALD），制备针对此酶的单克隆抗体。 方法 用PCR法扩增恶性疟原虫海南株ALD基因，经大肠埃希菌表达并纯化的ALD免疫BALB/c小鼠，腹腔注射免疫3次,每次间隔2周，加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞制备单克隆抗体。同时用获得的免疫血清进行间接荧光抗体试验（IFAT）和蛋白质印迹（Westernt blotting）分析。 结果 ELISA检测表明，小鼠能产生较高的针对ALD免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达1∶10⁵，IFAT显示免疫血清能特异性识别疟原虫体内的抗原；Western blotting分析显示免疫血清识别的疟原虫蛋白相对分子质量（Mr）约41 000；所制备的免疫血清与人红细胞内醛缩酶无交叉反应。经ELISA检测 3次，筛选获得7株分泌针对ALD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3株分泌的单克隆抗体能识别培养的恶性疟原虫；抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型。 结论 本实验构建并表达了重组疟原虫糖酵解醛缩酶，并获得特异性的单克隆抗体。     

Epitope specificity and capacity to inhibit parasite growth in vitro of human antibodies to repeat sequences of the Plasmodium falciparum antigen Ag332

It has earlier been shown that the Plasmodium falciparum-reactive human monoclonal antibody 33G2 inhibits parasite growth in vitro as well as cytoadherence of infected red blood cells to melanoma cells in vitro. MoAb 33G2 recognizes an epitope of the P. falciparum antigen Ag332 and cross-reactive determinants in Pf 155/RESA and Pf 11.1 located in repetitive regions containing sequences of regularly spaced pairs of glutamic acid. To study whether antibodies of this specificity frequently occur in human immune sera and if they could be of importance for protective immunity, antibodies were affinity purified on MoAb 33G2 reactive Ag332 peptides. The epitope specificity of the affinity purified antibodies, determined by the Pepscan method, resembled that of MoAb 33G2, but showed differences in fine specificity. The antibodies cross-reacted to some extent with Pf 11.1 and Pf 155/RESA repeat peptides as detected by peptide ELISA and Pepscan. In indirect immunofluorescence all purified antibodies displayed a dotted pattern of staining of late stage infected red blood cells of two lines of the P. falciparum strain FCR3, including a Pf 155/RESA deficient line. The in vitro growth of these two lines was efficiently inhibited by the affinity purified antibodies, indicating that their inhibitory effect was mainly due to reactivity with antigens other than Pf 155/RESA. This, and the fact that Pf 11.1 has been shown not to be expressed by the asexual stages suggests that Ag332 may be an important target for potentially protective antibodies in vivo and that Ag332 based immunogens are of interest for development of malaria subunit vaccines.     

多重PCR种特异性检测恶性疟原虫和间日疟原虫方法的建立

目的建立恶性疟原虫和间日疟原虫种特异性检测的多蕈PCR方法,用于疟疾的检测和诊断.方法根据疟原虫18S核糖体小亚基ssRNA的基因序列设计合成8对11条引物,通过对恶性疟、间日疟患者及健康对照者血样的DNA进行扩增,选择出敏感性和特异性最佳的引物用于建立多重PCR方法,并用梯度变化的方法分别对引物浓度、复性温度、延伸温度和循环次数等反应参数进行比较分析,优化PCR反应条件.利用优化后的多重PCR埘采自云南和上海的139份疟疾患者血样和32份非疟疾患者血样进行检测,以镜检方法为金标准,分析多重PCR方法检测患者血样的敏感性和特异性.结果从8对11条引物中优选出2对共3条引物用于建立多重PCR.利用这3条引物进行多重PCR,一次反应即可完成对恶性疟原虫和间日疟原虫的种特异性鉴定.对疟疾和非疟疾患者血样检测结果显示,该方法检测患者血样的敏感性为97.8%,特异性为100%.结论多重PCR方法敏感、特异、可进行批量检测,适用于对人群的疟疾监测和疑似疟疾病例的诊断,并能鉴定恶性疟原虫和间日疟原虫虫种.     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法　采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果　得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论　LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫PFC0460w基因片段的克隆与生物信息学分析

用逆转录PCR方法从恶性疟原虫3D7株红内期RNA扩增PFCO460w基因片段,克隆于pGEM-T easy载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选阳性克隆,PCR鉴定、测序并作序列分析。结果显示,从恶性疟原虫3D7株中扩增到3种PFCO460w片段序列,分别为618、597和543 bp,其中618 bp的片段序列与PlasmoDB数据库中的已知序列完全一致（GenBank登录号为XM₀01351147）。597 bp和543 bp片段序列已登录GenBank数据库,登录号分别为JF799872和JF799873。618 bp片段编码205个氨基酸,经Robbeta服务器结构预测,其编码的蛋白质可能有5种三维结构。