一氧化氮及其合酶与糖尿病视网膜病变发病关系的研究进展

一氧化氮(nitric oxide,NO)是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化合成的一种重要的信号分子和生物活性物质.目前的研究表明,NO及NOS在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的发生、发展中发挥重要的作用,因此NO及NOS成为当今治疗干预DR的一个研究热点,本文主要就NO及NOS与DR发病关系的研究进展作一综述.     

糖尿病大鼠视网膜一氧化氮合酶阳性神经元表达的变化

一氧化氮 (nitric oxide,NO)是重要的血管调节物质 ,被称为舒血管因子。一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase,NOS)是催化 L -精氨酸形成 NO的酶 ,由于 NO寿命极短 ,故一般以NOS的表达情况反映 NO的生成量 [1 ]。NOS广泛存在于血管周围的神经元中。我们通过观察 NOS阳性神经元在糖尿病大鼠视网膜表达的变化 ,探讨 NO在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用。1　材料和方法雄性 Wistar大鼠 10只 ,链脲佐菌素 (streptozotocin,STZ,Sigma)用 0 .1mol/ L ,p H4.2的枸橼酸缓冲液新鲜配制 ,浓度 75 .47mmol/ L。按 6 0 mg/ kg单剂腹腔注…     

氨基胍对缺血-再灌注损伤视网膜形态和功能的影响

视网膜缺血-再灌注损伤（retina ischemia reperfusion injury,RIRI）是眼科临床常见的病理过程,可导致视网膜结构和功能的严重损伤,其损伤机制复杂,治疗效果不理想,影响患者视功能的恢复。研究发现NO在RIRI中发挥着重要作用,一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）是NO合成的限速酶,应用NOS抑制剂氨基胍（aminoguanidine,AG）对大鼠青光眼视网膜神经节细胞具有明显的保护作用,而AG对RIRI有无保护作用尚不清楚。     

急性高眼压状态大鼠视网膜一氧化氮 及其合酶变化的研究

目的通过对急性高眼压下大鼠视网膜一氧化氮(nitric oxid e,NO)及其合酶(nitric oxide synthase,NOS)变化的分析,探讨一氧化氮在高眼压视网膜损伤中的作用。方法Wistar大鼠60只,随机分成为高眼压30 min组;高眼压60 min组;高眼压90 min组;高眼压后12 h组和高眼压后24 h 组。前房加压灌注成高眼压模型。利用镀铜镉还原法测定视网膜中NO₂^－/NO₃^－ 的 含量从而间接反映视网膜组织中NO的含量。利用免疫组织化学法研究视网膜内神经结构型一氧化氮合酶(neuronal constitutive nitric oxide synthase,ncNOS)的分布及其变化。结果正常及缺血大鼠视网膜神经结构型一氧化氮合酶(ncNOS)主要位于大鼠视网膜内核层内侧,节细胞层,内丛状层。急性高眼压30min,60min ,90min大鼠视网膜NO的含量逐渐下降(P<0.01),ncNOS阳性 细胞数也逐渐减少(P<0.05),阳性物质表达减弱;急性高眼压 90min后再灌注过程中,NO的含量比90min时明显升高(P<0.05),但与正常比较仍显著下降(P<0.01)。ncNOS阳性细胞数继续减少(P <0.01)。结论一氧化氮参与了急性高 眼压下视网膜损伤过程;通过ncNOS催化的途径合成的NO对缺血以及缺血再灌注的视网膜可能具有重要的作用。(中华眼底病杂志,2001,17:230-233)     

单眼视觉剥夺性幼猫视网膜中一氧化氮合成酶变化的组织化学研究

目的 观察一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)在正常和单眼视觉剥夺性幼猫视网膜中的变化，探讨一氧化氮(nitric oxide，NO)在弱视形成过程中的作用。方法 用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase,NADP-diaphorase)组织化学染色法观察正常组和单眼视觉剥夺组幼猫视网膜中NOS的变化。结果 (1)显微镜下观察：正常组和单眼剥夺组幼猫视网膜平铺片可见NOS阳性细胞，并可见细小的NOS阳性纤维；(2)计算机图位分析系统测量：正常组：视网膜NOS阳性细胞平均密度左右眼比较，差异无显著意义(P＞0．05)；单眼视觉剥夺组：非剥夺眼与剥夺眼比较，NOS阳性细胞平均密度差异有非常显著意义(P＜0．001)，剥夺眼与正常眼比较，有非常显著意义(P＜0．001)，非剥夺眼与正常眼比较，NOS阳性细胞平均密度差异无显著意义(P＞0．05)。结论 NO可能作为一种重要的神经递质参与幼猫弱视的形成。     

一氧化氮与视网膜缺血-再灌注损伤

一氧化氮（NO）在视网膜缺血-再灌注损伤中占重要地位。视网膜缺血-再灌注时,一氧化氮合成酶（NOS）被多种炎性介质和细胞因子激活,使NO大量生成。NO是一种活性很强的自由基,具有广泛的生物学活性。在缺血-再灌注早期,少量NO可降低缺血缺氧对视网膜的损伤程度;晚期过多的NO可通过多种途径对视网膜造成损害。就目前有关NO在视网膜缺血-再灌注损伤中的研究进展进行综述。     

尾加压素Ⅱ对人晶状体上皮细胞一氧化氮合成的影响

目的探讨新型生物活性物质尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ,U-Ⅱ)对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)内一氧化氮合酶(nitric oxide sythase,NOS)活性及一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的影响。方法用不同浓度的U-Ⅱ(1×10-9mol.L-1、10×10-9mol.L-1、100×10-9mol.L-1)干扰体外培养的HLEC,采用化学比色法和硝酸还原酶法测定HLEC内NOS活性和NO含量。结果空白对照组、(1×10-9mol.L-1、10×10-9mol.L-1、100×10-9mol.L-1)U-Ⅱ组的NOS活力值分别为(3.407±0.168)U.mg-1、(4.058±0.169)U.mg-1、(4.921±0.298)U.mg-1和(5.598±0.897)U.mg-1;NO含量分别为(0.747±0.183)μmol.g-1、(1.238±0.232)μmol.g-1、(1.531±0.101)μmol.g-1、(1.850±0.114)μmol.g-1。与空白对照组相比,U-Ⅱ呈浓度依赖性增强细胞内的NOS活性,刺激NO合成,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。结论 U-Ⅱ可使HLEC内NOS活性增强和NO生成增多,提示U-Ⅱ可能通过NOS/NO途径促进HLEC增殖。     

一氧化氮和内皮素在青光眼发病中的作用

青光眼是以眼内压升高损害视功能为主要特征的常见眼病,以往人们对其进行了广泛的研究.然而,就其发病机制,尤其是原发性开角型青光眼(POAG)的发病机理目前仍不甚清楚[1].近年来,人们对青光眼发病的研究集中到视盘病变与一些危险因子的关系上,特别是对一氧化氮(nitric oxide, NO)和内皮素(endothelin,ET)研究的深入,对青光眼发病认识有了新突破.研究发现NO和ET参与眼内压(IOP)的调节、眼血流的调节及视网膜神经节细胞凋亡(apoptosis)的过程[2],并成为1997年瑞士巴塞尔国际青光眼会议讨论的热点[3].本文就近年来在这方面的研究进展作一综述.     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞近视因子基因的表达

目的研究视网膜近视因子基因在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化。方法3～4周龄断乳三色豚鼠40只,取20只建立近视眼模型（以右眼作为实验眼,以对侧未遮盖眼作自身对照）,剩余的20只豚鼠作正常对照。用眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型,用酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞。RT-PCR检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、诱导型一氧化氮合成酶（induciblenitric oxide synthase,iNOS）、神经型一氧化氮合成酶（neu-ronal nitric oxide synthase,nNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）、视黄醛脱氢酶（retinaldehyde dehydrogenase,RALDH）、醛脱氢酶（aldehydedehydrogenase,ALDH）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fi-broblast growth factor,bFGF）、转化生长因子β（transforminggrowth factor-β,TGF-β）的mRNA在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况。数据分析采用One-way ANOVA检验。结果眼罩遮盖10d后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。酶消化法成功培养出视网膜Müller细胞。正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达nNOS、bFGF、TH、TGF-βmRNA,且遮盖眼表达nNOS、bFGF和TGF-βmRNA上调（P〈0.05）,TH mRNA下调（P〈0.05）。iNOS mRNA仅在遮盖眼视网膜Müller细胞阳性表达。三组视网膜Müller细胞均不表达eNOS、RALDH和ALDHmRNA。结论豚鼠近视眼视网膜Müller细胞表达nNOS、iNOS、bFGF和TGF-βmRNA上调,TH mRNA下调。Müller细胞是近视眼视网膜信号因子一氧化氮（nitric oxide,NO）、多巴胺（dopamine,DA）、bFGF和TGF-β的一个重要来源。     

一氧化氮内皮素与青光眼

青光眼是以眼内压升高损害视功能为主要特征的常见眼病,以往人们对其进行了广泛的研究.然而,就其发病机制,尤其是原发性开角型青光眼(POAG)的发病机理目前仍不甚清楚[1].近年来,人们对青光眼发病的研究集中到视盘病变与一些危险因子的关系上,特别是对一氧化氮(nitric oxide, NO)和内皮素(endothelin,ET)研究的深入,对青光眼发病认识有了新突破.研究发现NO和ET参与眼内压(IOP)的调节、眼血流的调节及视网膜神经节细胞凋亡(apoptosis)的过程[2],并成为1997年瑞士巴塞尔国际青光眼会议讨论的热点[3].本文就近年来在这方面的研究进展作一综述.     

白内障术后房水一氧化氮及一氧化氮合酶的动态变化

目的：探讨白内障术后房水一氧化氮（NO）与炎症反应的关系。方法：用新西兰白兔动态观察对照组、晶状体囊外摘出术组（ECCE）和晶状体囊外摘出＋人工晶状体植入术组（ECCE＋IOL）眼内炎症反应及房水一氧化氮合酶（NOS）和NO2－／NO3－的活性。结果：白内障术反应与房水NOS和NO活性呈动态变化，ECCE＋IOL组明显高于ECCE组，且上两组均高于对照组。结论：房水NO的变化与白内障术后眼内炎症反应密切相关。     

角膜碱烧伤房水一氧化氮及一氧化氮合酶变化

目的探讨角膜碱烧伤后房水一氧化氮（NO）与炎症反应的关系。方法用健康家兔动态观察对照组、实验组和对侧眼组眼内炎症反应及房水一氧化氮合酶（NOS）和NO2^-／NO3^-的活性。结果角膜碱烧伤后炎症反应与房水NOS和NO活性呈动态变化，实验组明显高于对侧眼组，且两组均高于对照组。结论房水NO的变化与角膜碱烧伤后的眼内炎症反应密切相关。     

糖尿病视网膜病变：一种非可控性炎症

非可控性炎症在多种疾病的发生发展中起到重要作用。糖尿病视网膜病变（DR）是一种低度慢性炎症性疾病,确切地说可能是一种非可控性炎症。DR中的中性粒细胞不能及时凋亡或被清除、不同表型的巨噬细胞同时存在、周细胞功能减弱、Th1细胞反应降低等细胞因素致DR炎症不易缓解。与此同时,抗炎型可溶性因子含量的降低,如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF—β）、一氧化氮（NO）、环氧化二十碳三烯甘油酸（EETs）、脂氧素等进一步使炎症持续。此外高糖条件下产生的脂质代谢产物、糖基化终末产物、活性氧中间产物（ROI）等持续存在的刺激因素均可导致炎症不能缓解。对DR炎症发病机制的深入理解有助于探索新的治疗途径,延缓其发生发展。     

Possible role for nitric oxide releasing nerves in the regulation of ocular blood flow in the rat

AIM—To investigate the role of nitrergic nerves in the regulation of ocular blood flow.
METHODS—Conscious, lightly restrained rats were treated with either the neuronal nitric oxide synthase inhibitor 7-nitroindazole (7-NI), or the non-selective inhibitor, NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), and ocular blood flow was measured ex vivo from tissue samples, using the fully quantitative [14C]-iodoantipyrine technique.
RESULTS—In the peripheral circulation, L-NAME produced an increase in arterial blood pressure (+22%) while 7-NI had no effect. In contrast, both 7-NI and L-NAME produced significant decreases in ocular blood flow (−31% and −59% respectively). The ocular vascular resistance calculated from ocular blood flow and mean arterial blood pressure increased by 29% following 7-NI, but by 130% following L-NAME.
CONCLUSIONS—Nitric oxide releasing neurons may play an important contributory role in regulating ocular blood flow.

Keywords: nitric oxide; neuronal nitric oxide synthase; 7-nitroindazole; NG-nitro-L-arginine methyl ester; ocular blood flow     

Protective role of heme oxygenase-1 against endotoxin-induced uveitis in rats

Endotoxin-induced uveitis (EIU) is an animal model of acute ocular inflammation. Cytokines, chemokines, and nitric oxide (NO) have been reported to play important roles. We have determined whether heme oxygenase (HO)-1, a heat shock protein, can suppress EIU. EIU was induced by a footpad injection of lipopolysaccharide (LPS) in male Lewis rats. Hemin, an inducer of HO-1, was injected intraperitoneally 1 hr prior to the LPS injection. HO-1 and HO-2 expression in the iris-ciliary body (ICB) was studied by real time PCR and Western blot analysis. The number of infiltrating cells and the protein concentration in the aqueous humor (AqH) were evaluated by microscopy and by protein assay. The expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor (TNF)-alpha, and IL-1beta mRNA was determined by real time PCR. The concentration of nitrate plus nitrite, and levels of IL-6 and TNF-alpha in the AqH were also evaluated by Griess reagents and by enzyme-linked immunosorbent assay, respectively. The expression of HO-1 mRNA and protein, induced by LPS, was enhanced significantly by pre-injection of hemin (P<0.001). HO-2 was constitutively present in the ICB and was not up-regulated by LPS or by hemin. The number of infiltrating cells and the concentration of protein in the AqH was significantly elevated by LPS injection, and hemin significantly reduced the number of cells and the protein concentration (P<0.0001). The expression of iNOS and IL-6 mRNA and protein were down-regulated by hemin (P<0.001). Hemin is effective in inducing HO-1 and in reducing the ocular inflammation induced by LPS probably by down-regulating NO and pro-inflammatory cytokine expression.     

缺氧诱导因子-1α、诱导型一氧化氮合成酶及环氧合酶-2在慢性高眼压大鼠视网膜中的表达

目的探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）的表达与高眼压视网膜损伤的关系,为青光眼视网膜缺氧提供证据。方法用巩膜静脉烧烙法在50只SPF级Wistar大鼠的双眼制作慢性高眼压模型,眼压高于造模前40%以上者为造模成功。按照视网膜取材时间的不同将动物模型眼随机分为高眼压3、7、14、21、28 d组,每组10只大鼠20只眼。另选取10只匹配大鼠作为假手术对照组,仅作球结膜切开。应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法及Western blot法检测各组视网膜组织中HIF-1α、iNOS、COX-2 mRNA及其蛋白在大鼠视网膜中的表达。结果 HIF-1α、iNOS、COX-2 mRNA及蛋白在假手术组大鼠视网膜中呈微弱表达,造模眼HIF-1α、iNOS、COX-2 mRNA及其蛋白在视网膜中的表达水平明显升高,于7 d时达到高峰,随后有所下降,但仍明显高于正常组的表达水平。造模后3、7、14、21、28 d组大鼠视网膜中HIF-1α、iNOS、COX-2 mRNA及其蛋白的表达与假手术组相比,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 HIF-1α、iNOS、COX-2的低氧信号途径是青光眼神经变性发生发展中重要的病理生理机制。     

氨基胍对兔缺血-再灌注损伤后视网膜形态学及一氧化氮和一氧化氮合酶表达的影响

背景临床研究表明,多种眼科疾病如青光眼、视网膜中央动脉阻塞、缺血性视神经病变等均可导致视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）,严重影响视功能,因而对治疗RIRI药物的研究是非常必要的。目的观察并探讨氨基胍对兔RIRI后形态学的变化,并研究其对一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（iNOS）在视网膜中表达的影响及其机制。方法清洁级日本大耳白兔66只,以随机数字表法分为正常组、RIRI模型组和氨基胍治疗组。用前房灌注生理盐水法升高眼压60min后恢复灌注建立兔RIRI模型,氨基胍治疗组每日在模型兔腹腔内注射氨基胍注射液80mg／kg,而RIRI模型组以同样的方法注射等量生理盐水。RIRI模型组和氨基胍治疗组分别于缺血即时、再灌注后6、24、72h各取2只兔活体行眼底彩色照相及荧光素眼底血管造影（FFA）。各组兔分别于再灌注后1、6、24、72h用空气栓塞法处死并摘除眼球以制备视网膜切片,用TUNEL法检测视网膜组织神经细胞的凋亡变化,通过硝酸还原酶法检测NO浓度,比色法检测iNOS活力。结果各时间点眼底彩色照相及FFA检查结果表明,与RIRI模型组比较,氨基胍治疗组视网膜水肿程度减轻,血管闭塞程度及比例降低,荧光素渗漏量及面积减轻并减少。TUNEL染色凋亡细胞计数检测表明,正常组兔视网膜未见TUNEL阳性细胞,而缺血-再灌注1、6、24、72h后RIRI模型组兔视网膜凋亡细胞计数均明显高于氨基胍治疗组（F分组=2762．37,P=0．00;F时间=894．24,P=0．00）。RIRI模型组和氨基胍治疗组各组内相邻时间点之间TUNEL阳性细胞的差异均有统计学意义（RIRI模型组：q=24．47、36．59、-20．37,P〈0．05;氨基胍治疗组：q=20．94、16．79、-6．92,P〈0．05）,再灌注后24h各组TUNEL阳性细胞数量达到高峰。各时间点RIRI模型组兔视网膜NO浓度明显高于氨基胍治疗组（q=3．84、4．01、8．91、3．75,P〈0．05）,各组内相邻时间点之间NO浓度的差异均有统计学意义（RIRI模型组：q=4．77、13．40、-10．29,P〈0．05;氨基胍治疗组：q=4．55、9．05、-5．08,P〈0．05）,各组24h视网膜中NO浓度达峰值。各时间点RIRI组视网膜iNOS活力均明显高于氨基胍治疗组（q=-3．74、-4．94、-6．53、-3．98,P〈0．05）;各组内相邻时间点间iNOS活力的差异均有统计学意义（RIRI模型组：q=8．43、6．71、-6．39,P〈0．05;氨基胍治疗组：q=4．16、5．08、-3．93,P〈0．05）,各组24h iNOS活力达峰值。结论氨基胍对维持RIRI后的视网膜形态和功能起保护作用,其作用机制可能为抑制iNOS的活性,减少NO的生成。     

Morphine-stimulated nitric oxide release in rabbit aqueous humor

Recent studies in our laboratory have demonstrated a role of nitric oxide (NO) in morphine-induced reduction of intraocular pressure (IOP) and pupil diameter (PD) in the New Zealand white (NZW) rabbit. The present study was designed to determine the effect of morphine on NO release in the aqueous humor of NZW rabbits, as this effect could be associated with morphine-mediated changes in aqueous humor dynamics and iris function. Dark-adapted NZW rabbits were treated as follows: (1) treatment with morphine (10, 33 or 100 microg, 5 min); (2) treatment with morphine or endomorphin-1 for 5, 15 or 30 min; (3) pretreatment with naloxone (100 microg), L-NAME (125 microg) or reduced glutathione (GSH, 100 microg) for 30 min, followed by treatment with morphine (100 microg, 5 min). After the various treatment regimens, aqueous humor samples were obtained by paracenthesis and immediately assayed for nitrates and nitrites (an index of NO production), using a microplate assay kit. Morphine caused a dose-dependent increase in the levels of NO in aqueous humor after 5 min of treatment with each dose. Rabbits treated with endomorphin-1 (100 microg) had no significant change in NO levels in aqueous at any point in the course of time. Aqueous samples from rabbits treated with morphine (100 microg) for 5 min increased from 29.84+/-2.39 microM (control) to 183.94+/-23.48 microM (treated). The increase in NO levels by morphine (100 microg, 5 min) was completely inhibited in the presence of naloxone (100 microg), L-NAME (125 microg) or GSH (100 microg). These results indicate that morphine-induced increase in NO production in aqueous humor is a transient response that is linked to the activation of mu opioid receptors. Data obtained suggest that morphine-stimulated changes in ocular hydrodynamics and iris function are due, in part, to increased release of NO in aqueous humor. In addition, the sensitivity of the response to l-NAME and GSH suggests that morphine-induced release of nitric oxide into aqueous humor is mediated by activation of mu-3 opioid receptors found in the anterior segment of the eye.     

内毒素诱导性葡萄膜炎眼中NO含量和基质金属蛋白酶-9及其组织型金属蛋白酶抑制剂-1与诱导型NO合酶的表达

目的 观察基质金属蛋白酶（MMP）-9及其组织型金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1、一氧化氮（NO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在内毒素诱导性葡萄膜炎（EIU）眼组织中的变化。 方法 90只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为实验组(81只)和对照组(9只)。实验组大鼠双后足垫注射伤寒杆菌内毒素(LPS)200 μl建立EIU模型；对照组大鼠不予注射。在LPS注射后0、6、12、18、24、48、72、96h和7d分别处死9只实验组大鼠，观察眼部改变并进行组织病理学检查。检测血浆、房水和葡萄膜组织的NO含量和房水蛋白浓度。免疫组织化学方法和计算机图像分析系统检测MMP-9、TIMP-1和iNOS的表达及其平均吸光度［A, 旧称光密度（OD）］值。 结果 虹膜、睫状体的上皮细胞和渗出的炎性细胞表达iNOS、MMP-9和TIMP-1。房水蛋白浓度，血浆、房水和葡萄膜组织中NO含量，以及MMP-9的A值与炎症程度呈正相关，iNOS和TIMP-1的A值与炎症程度无明显相关性。iNOS在LPS注射后6h可见表达，12h达高峰，以后逐渐下降。TIMP-1表达出现于24h，72h时达高峰。 结论 在EIU发生、发展过程中, MMP-9、TIMP-1、NO、iNOS的含量或表达发生变化，提示它们参与EIU的病理过程。 (中华眼底病杂志, 2005, 21: 371-374)