血管抑素k1-5转基因治疗Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎

目的：探讨腺病毒介导的血管抑素k1-5对Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎的治疗作用.方法：在体外验证表达血管抑素k1-5的腺病毒载体对血管内皮细胞的抑制作用的基础上,将其应用于胶原蛋白诱导的关节炎鼠模型,以探讨其对关节炎的治疗作用,以临床评分和爪厚度来评价治疗效果.结果：鼠腹腔内注射表达血管抑素k1-5的腺病毒载体能显著降低关节炎鼠模型临床评分及爪厚度（P＜0.05）.结论：本试验初步证实表达血管抑素k1-5的腺病毒载体能明显改善Ⅱ型胶原蛋白诱导的鼠关节炎,可作为关节炎治疗的有效途径.     

顺铂不同疗程化疗对裸鼠人卵巢癌移植瘤的影响

目的观察顺铂(DDP)不同疗程化疗对裸鼠人卵巢癌移植瘤的影响,并探讨其对乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(P-gp)和肿瘤干细胞标记物CD133表达水平的影响。方法用人卵巢癌细胞株SKOV3建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,24只裸鼠随机分为对照组、短疗程化疗组和足疗程化疗组,每组8只。化疗期间观察裸鼠体重和肿瘤生长状况;Western Blot方法检测3组移植瘤组织中BCRP、P-gp、CD133的蛋白表达水平。结果对照组移植瘤体积最大,短疗程化疗组次之,足疗程化疗组最小(P<0.05);足疗程化疗组裸鼠体重低于对照组及短疗程化疗组(P<0.01,P<0.05);足疗程化疗组CD133、BCRP、P-gp蛋白表达水平高于对照组及短疗程化疗组(P<0.01,P<0.05)。结论 DDP足疗程化疗可以更好地抑制荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长,但残余瘤对化疗抵抗性更强,更难治疗。     

HTERT启动子调控HSV—tk＋GCV系统对人前列腺癌裸鼠移植瘤的疗效观察

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因结合环氧鸟苷(GCV)对人前列腺癌PC3、LNCaP细胞株裸鼠移植瘤的疗效.方法:建立人前列腺癌BALB/C裸鼠移植瘤模型,利用携带hTERT和ILSV-tk基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk肿瘤局部注射荷瘤裸鼠后,腹腔注射GCV治疗.结果:(1)LNCaP细胞株、PC-3细胞株裸鼠移植瘤各组肿瘤体积的增长趋势基本一致,Ad-hTERT-HSV-tk+GCV治疗组自腹腔注射GCV后第21天开始,肿瘤体积均明显小于另3组,不同组之间,不同治疗时间差别均有统计学意义(LNCaP细胞株:F分别为17.24和557.83,P<0.01;PC-3细胞株:F分别为24.48和599.37,P<0.01),且分组和治疗时间之间存在交互作用(LNCaP细胞株:F=10.15,P<0.01;PC-3细胞株:F=11.88,P<0.01).(2)LNCaP、PC-3细胞株移植瘤Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组凋亡率均高于其他组,而增殖都低于另3组.(3)透射电镜下发现,Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组可见凋亡小体.结论:Ad-hTERT-HSV-tk联合GCV对人前列腺癌裸鼠移植瘤模型具有明确的治疗作用.     

双氢青蒿素对人卵巢癌细胞株HO-8910裸鼠移植瘤的作用及P53表达的影响

目的探讨双氢青蒿素(DHA)对人卵巢癌细胞株HO-8910裸鼠皮下移植瘤的作用及P53表达的影响。方法将人卵巢癌细胞株HO-8910注入裸鼠的腋下,建立人卵巢癌移植瘤的动物模型,随机分为空白组,低剂量DHA组、中剂量DHA组、高剂量DHA组、顺铂阳性对照组,观察干预后各组移植瘤抑瘤率;免疫组织化学法和蛋白印迹法检测肿瘤细胞内P53蛋白的表达;应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法测定移植瘤中P53 mRNA的表达。结果①DHA对裸鼠移植瘤的生长有一定的抑制作用,并具有浓度依赖性。②病理学观察见细胞的体积较大,胞质疏松,核深染,可有不同程度的核固缩、核碎裂及核溶解,细胞中可见局灶性坏死。③免疫组织化学法结果证实随着DHA剂量的增加突变型P53蛋白表达减弱;蛋白印迹法检测到DHA组野生型P53蛋白表达上调。④RT-PCR法检测到DHA组野生型P53基因表达上调。结论 DHA对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用,且与剂量有一定的关系,其机制可能与上调野生型P53的表达导致细胞凋亡有关。     

腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因对Lewis肺癌的治疗作用

目的:体内观察腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因的抗肿瘤及协同化疗或放疗的作用.方法:建立C57小鼠的Lewis肺癌模型,瘤内注射不同剂量的上述三个基因重组的腺病毒,确定重组腺病毒治疗小鼠Lewis肺癌的有效剂量;与此同时观察有效剂量的重组腺病毒和放疗或化疗协同作用.结果:腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因治疗小鼠Lewis肺癌的有效剂量为5×108pfu,该重组腺病毒与放疗或化疗联合应用可以显著提高小鼠Lewis肺癌对放疗或化疗的敏感性.结论:腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因对小鼠Lewis肺癌具有良好的治疗作用;该重组腺病毒联合放疗或化疗可以显著提高小鼠Lewis肺癌对放疗或化疗的敏感性.     

腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因对Lewis肺癌的治疗作用

目的:体内观察腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因的抗肿瘤及协同化疗或放疗的作用.方法:建立C57小鼠的Lewis肺癌模型,瘤内注射不同剂量的上述三个基因重组的腺病毒,确定重组腺病毒治疗小鼠Lewis肺癌的有效剂量;与此同时观察有效剂量的重组腺病毒和放疗或化疗协同作用.结果:腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因治疗小鼠Lewis肺癌的有效剂量为5×108pfu,该重组腺病毒与放疗或化疗联合应用可以显著提高小鼠Lewis肺癌对放疗或化疗的敏感性.结论:腺病毒介导的p53、GM-CSF和B7-1基因对小鼠Lewis肺癌具有良好的治疗作用;该重组腺病毒联合放疗或化疗可以显著提高小鼠Lewis肺癌对放疗或化疗的敏感性.     

腺病毒载体介导血管抑素防治兔高危角膜移植术后新生血管化的实验研究

目的探讨腺病毒载体介导血管抑素靶向基因治疗兔高危角膜移植术后新生血管化的作用及其可能机制。方法 建立30只兔高危角膜新生血管移植受体模型,同时进行含有血管抑素基因的腺病毒载体的构建,行双眼角膜移植术,术中采用角膜原位转染法用微量进样器行角膜基质注射,右眼为实验眼注入病毒液,左眼为对照眼注入生理盐水。术后不同时间比较角膜植片透明度、水肿和新生血管程度,HE染色观察新生血管生长情况和炎症反应情况;免疫组化检测AS、VEGF在角膜植片中的表达;透射电镜观察超微结构。结果⑴实验组角膜新生血管术后较对照组显著减少(P<0.05)。⑵实验组比对照组炎症浸润程度轻。⑶.术后实验组AS的表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。⑷术后实验组VEGF的表达水平均显著低于对照组(P<0.05)。结论腺病毒载体介导血管抑素可有效防治兔高危角膜移植术后新生血管化。     

血管形成素-1基因转染对血管内皮细胞影响的实验研究

目的　探讨血管形成素 1(Ang1)基因重组腺病毒 (Ad .Ang1)的获取及其对人脐静脉上皮细胞 (ECV30 4 )的影响。方法　以逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)自人脾组织中克隆出Ang1全长cDNA ,测序后克隆到Ad5腺病毒载体中 ,制备纯化的Ad .Ang1;以Ad .Ang1转染ECV30 4细胞 ,1至 7d后 ,用RT PCR与Westernblot分别检测ECV30 4中Ang1转录与表达情况 ,同时观测其对ECV30 4的影响。结果　克隆的Ang1DNA片段为 15 15bp的全长cDNA。所获得的Ad .Ang1与 β 半乳糖苷酶 (LacZ)基因重组腺病毒 (Ad .LacZ)滴度分别为 5 6× 10 8pfu/ml、5 3× 10 8pfu/ml。β 半乳糖苷 (X gal)染色显示LacZ基因转染Hela细胞 ,蓝染率可达 95 %以上。Ang1基因转染后第 1、3、7d可检出mRNA表达 ,第 3、7d可检测到其蛋白表达。XTT检测显示Ad .Ang1组与对照组相比 ,各时间点的OD值差异不显著 ,P >0 0 5。结论　Ad .Ang1在体外培养的ECV30 4细胞中能有效表达 ,但对ECV30 4细胞增殖功能无明显促进作用     

Survivin基因沉默对裸鼠人卵巢癌细胞移植瘤凋亡的影响

目的探讨survivin基因沉默对人卵巢癌细胞株SKOV3裸鼠移植瘤凋亡的影响。方法将重组survivin shRNA plasmid转染人卵巢癌细胞株SKOV3细胞,通过裸鼠移植瘤实验比较survivin基因沉默对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测与凋亡密切相关的cytochrome-c、caspase-9和caspase-3基因的表达。结果裸鼠移植瘤实验显示,与对照组(空载体组和未转染组)相比,survivin shRNA plasmid转染组人卵巢癌细胞株SKOV3细胞生长速度减慢,肿瘤体积缩小(P<0.05);荧光定量PCR和蛋白印迹法结果都显示,与对照组相比,survivin shRNA plasmid转染组cytochrome-c、caspase-9和caspase-3的表达明显升高(P<0.05)。结论 survivin基因沉默可通过促进肿瘤细胞的凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长。     

血管内皮生长因子受体-3抗体对人喉鳞癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的探讨血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)抗体对人喉鳞癌裸鼠移植瘤是否具有生长抑制作用。方法利用人喉鳞癌细胞株Hep-2细胞建立裸鼠喉癌模型,分成2组,每组12只,瘤周注射用药。观察肿瘤体积,生长曲线以及抑瘤率。结果 VEGFR-3抗体可以引起荷瘤体积和质量的减少,较0.9%氯化钠注射液对照组差异有统计学意义(t=11.64,P<0.05)。VEGFR-3抗体组抑瘤率为48.21%。结论阻断VEGFR-3受体有望成为喉癌淋巴结转移预防和治疗的潜在靶点。     

顺铂联合8-硝基白杨素对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的 研究顺铂联合8-硝基白杨素对人卵巢癌COC1细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法 建立人卵巢癌COC1细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成4组,每组5只：生理盐水组、8-硝基白杨素组、顺铂组、8-硝基白杨素+顺铂组。观察各组裸鼠移植瘤体积、重量及裸鼠体质量的变化;裸鼠血清乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、肌酐值和外周血白细胞计数的变化;FCM测定瘤组织细胞凋亡率;Western blot分析瘤组织细胞凋亡的可能分子生物学机制。结果 与顺铂组和8-硝基白杨素组相比,顺铂联合8-硝基白杨素联合作用COC1细胞裸鼠移植瘤后,移植瘤的体积、移植瘤的重量均明显降低(P<0.05);与顺铂组相比,顺铂联合8-硝基白杨素联合组裸鼠体质量无明显差异(P>0.05),裸鼠血清乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、肌酐值和外周血白细胞计数无明显差异(P>0.05);顺铂和8-硝基白杨素联合作用COC1细胞16 d后,COC1细胞发生凋亡,同时bcl-2蛋白表达降低,caspase-3蛋白表达增高。结论 顺铂联合8-硝基白杨素通过降低bcl-2蛋白表达,活化caspase-3蛋白表达来抑制人卵巢癌COC1细胞裸鼠移植瘤生长。     

共培养体系中小鼠囊胚对人卵巢癌细胞系HO-8910PM的影响

目的:观察两种具有侵袭特性的小鼠囊胚细胞与人卵巢癌细胞在相同的体外微环境下,动态的相互作用和整体生物学行为变化。方法:建立小鼠囊胚与人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM体外共培养模型,应用MTT法检测HO-8910PM细胞黏附率的改变;应用Transwell体外细胞侵袭实验观察HO-8910PM细胞体外侵袭及趋化性运动能力的变化;应用RT-PCR检测HO-8910PM细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2mRNA的表达。结果:癌细胞与小鼠囊胚共培养24h后,大部分囊胚开始边脱带边黏附,推开底层的癌细胞,在囊胚与肿瘤细胞间形成了明显的界限。共培养组的HO-8910PM细胞的黏附率低于对照组。Transwell小室体外侵袭实验及体外趋化性运动实验显示,共培养组穿过滤膜的细胞数明显少于对照组。共培养组MMP-2、MMP-9mRNA的表达及MMP/TIMP较对照组明显下降,TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达略有增加。结论:当人HO-8910PM细胞与小鼠囊胚共培养时,肿瘤细胞失去了特有的侵袭性;小鼠囊胚能显著降低HO-8910PM细胞的黏附、体外侵袭能...     

siRNA沉默卵巢癌CXCR4基因对卵巢癌腹腔转移的影响

目的研究应用基因靶向治疗对卵巢癌腹腔转移的实验疗效观察。方法制作好的卵巢癌大鼠模型60只,采用随机数字表法随机分为实验组和对照组,实验组应用基因靶向治疗,对照组采用阴性治疗,siRNA沉默卵巢癌CXCR4基因后,观察CXCR4蛋白的表达情况,对卵巢癌细胞增殖的影响,观察应用基因靶向治疗后腹腔转移情况,评价大鼠生存情况。结果实验组在治疗后腹水中的CXCR4显著减少（P〈0．05）;对照组治疗后腹水中的CXCR4量显著性增加（P〈0．05）;实验组与对照组相比,治疗前腹水中CXCR4,差异无统计学意义（P〉0．05）;治疗后差异有统计学意义（P〈0．05）。实验组腹水抽出量与实验组相比,明显减少（P〈0．05）。结论应用基因靶向治疗方法siRNA沉默卵巢癌CXCR4基因对卵巢癌腹腔转移,具有较好的疗效,临床预后较好。     

脂质体介导的小发夹干扰RNA对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1表达的影响

目的:探讨脂质体介导的小发夹干扰RNA(shRNA)对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响。方法:设计合成针对ERCC1基因的小发夹干扰RNA(ERCC1-shRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染COC1/DDP细胞。分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)检测转染后细胞中ERCC1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞计数检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:转染后COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA表达较转染前明显降低(F=203.73,P<0.01),ERCC1蛋白表达亦显著下降。RNA干扰ERCC1基因后48h,COC1/DDP细胞的凋亡率较对照组有明显升高(t=20.65,P<0.01)。结论:构建的重组质粒表达载体转染COC1/DDP细胞可明显下调ERCC1 mRNA及蛋白的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。     

更昔洛韦对转染HSV1—TK基因的人肺腺癌细胞A549的体内外杀伤效应

目的:活体内外观察更昔洛韦(ganciclovir,GCV)对转染HSV1-TK基因的人肺腺癌细胞A549杀伤效应。方法:构建一个包含TK基因的逆转录病毒表达载体,用电穿孔法转化人肺腺癌细胞A549,MTT法测转基因细胞对GCV敏感性和观察旁观者效应;流式细胞仪、扫描电镜检测GCV诱导转染细胞凋亡,PCR和原位杂交分别检测转染细胞TK基因整合和表达,活体比较GCV对转染细胞、亲代细胞接种裸鼠皮下肿瘤治疗效果。结果:转染细胞对GCV IC_(50)比亲代细胞提高46倍,旁观者效应在高细胞密度较低细胞密度明显。FCM发现转染细胞经GCV作用3天后DNA直方图呈现亚G0G1峰,亲代细胞无该 峰形成。细胞周期分析表明亚G_0G_1细胞在A549-TK和A549分别为(12.2±1.7)％和(1.3±0.3)％(P<0.01).扫描电镜发现转染细胞有明显的凋亡特征如核浓缩、凋亡小体和核呈半月征等,对照细胞无这些变化。PCR、原位杂交表明转染细胞有TK基因整合和表达,体内实验表明转染细胞接种肿瘤受GCV治疗抑制生长,亲代细胞接种肿瘤不受抑制。结论:转TK基因细胞获得GCV的敏感性,旁观者效应杀灭肿瘤细胞与细胞间密切接触有关,TK/GCV杀灭肿瘤与诱导凋亡有关,GCV活体内抑制转TK基因细胞接种肿瘤生长。     

人甲胎蛋白启动子控制HIV-1 Vpr表达的重组腺病毒体内抑瘤效果研究

目的：研究人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒对裸鼠肝癌模型的肿瘤组织生长抑制作用,探讨其应用于肝癌基因治疗的可行性。方法：将人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒（rvAdAFP-Vpr）直接注射到利用BEL-7402细胞建立的肝癌裸鼠模型瘤体内,同时往裸鼠腹腔内注射环磷酰胺（CTX）,经过1个月的治疗,利用肿瘤生长曲线、增殖指数、凋亡指数等指标,观察rvAdAFP-Vpr对肝癌组织生长抑制的效果。结果：人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒在肝癌组织中表达了Vpr蛋白,rvAdAFP-Vpr注射明显诱导肿瘤细胞凋亡,抑制了体内肝癌组织的生长,rvAdAFP-Vpr治疗组和rvAdAFP-Vpr＋CTX治疗组抑瘤率分别达到41％和66．7％,与空白对照组和rvAd-null组相比,具有统计学意义,差异显著（P〈0．05,P〈0．01）,两组的Ki-67指数和凋亡指数相比,对照组和空腺病毒载体（rvAd-null）组同样具有统计学意义,差异显著（P〈0．05,P〈0．01）。结论：人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒rvAdAFP-Vpr通过引起肝癌细胞凋亡,有效抑制了体内肝癌组织的生长。本研究结果为HIV-1 Vpr应用于肝癌治疗提供了依据。     

钾通道基因Kv 1.5在大鼠脑不同发育阶段的mRNA表达研究

目的　研究大鼠大脑不同发育阶段钾通道基因Ｋｖ１－５的ｍＲＮＡ表达。方法　①利用一步法提取脑组织中ＲＮＡ;②ＤＮＡ模板的制备;③体外转录合成ＲＮＡ探针;④ＲＮＡ：ＲＮＡ杂交。结果　Ｋｖ１－５在大鼠胎儿期大脑皮层未表达,出生２５ｄ后表达明显增强,成年大鼠与出生后２５ｄ相比表达未发生变化。结论　Ｋｖ１－５ｍＲＮＡ的表达与发育阶段有较大关系,出生前期Ｋｖ１－５ｍＲＮＡ表达快速增长可能与大鼠脑发育和功能分化有关。     

微小 RNA-7-5p靶向调节锌指蛋白核转录因子 4基因抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的 探讨微小RNA(miR)-7-5p对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及锌指蛋白核转录因子4(KLF4)基因表达调控的影响.方法 研究起止时间为2018年3—10月.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-7-5p在人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF及口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量.将miR-7-5p模拟物(miR-7-5p mimics)及阴性对照序列(mimics Control)分别转染至SCC25细胞,分为三组:Control组(未转染的SCC25细胞)、NC组(转染mimics Con-trol的SCC25细胞)、miR-7-5p组(转染miR-7-5p mimics的SCC25细胞).以qRT-PCR检测miR-7-5p在SCC25细胞中的转染效果;MTT法检测miR-7-5p对SCC25细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-7-5p对SCC25细胞凋亡的影响;通过双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blotting)检测miR-7-5p对KLF4的靶向关系.结果 miR-7-5p在3种口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量[(0.21±0.02)、(0.43±0.04)、(0.48±0.05)]明显低于人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF(1.00±0.09)(P<0.05);转染miR-7-5p mimics能够上调SCC25细胞中miR-7-5p的表达(P<0.05);miR-7-5p过表达能够明显抑制SCC25细胞增殖能力[Control组、NC组72 h吸光度(1.43±0.13)、(1.46±0.15)比miR-7-5p组(0.81±0.09)](P<0.05),并诱导细胞凋亡[Control组、NC组凋亡率(9.48±2.65)％、(10.21±3.02)％比miR-7-5p组(24.41±8.15)％](P<0.05);双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-7-5p过表达可抑制KLF4-Wt报告基因载体细胞相对荧光活性;qRT-PCR和Western blotting进一步证实了miR-7-5p能够靶向调节KLF4 mRNA和蛋白表达.结论 miR-7-5p直接靶向调控KLF4基因的表达来抑制口腔鳞状细胞癌SCC25细胞增殖,诱导细胞凋亡.