体外扩增对食管癌患者NK细胞表面受体表达及其抑瘤活性的影响

目的： 探讨食管癌患者NK细胞扩增前后的受体表达及其对肿瘤细胞的杀伤。 方法： 收集福建省肿瘤医院食管癌患者外周血20例,健康供者（对照组）外周血10例。NK细胞培养采用细胞因子（IL-2+IL-12+IL-15+IL-18）组合,流式细胞术检测NK细胞免疫表型及其受体（CD56+、CD69+、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD158b、CD159a）的表达,LDH法检测不同效靶比时NK细胞对多种肿瘤细胞株（K562、Raji、Eca-109、TE-1）的杀伤作用。 结果： 与对照组相比,食管癌患者外周血CD3+、CD4+细胞比例以及CD4+/CD8+T细胞比值明显降低（P<0.05）,NK细胞（CD3-CD56+）及调节性T细胞（Treg）比例明显升高（P<0.05）。经细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合定向扩增20 d后,食管癌患者NK细胞比例高达90%以上,NK细胞数扩增达1 000倍以上（P<0.01）;而CD3+T细胞、CD4+、CD8+T细胞、CD19+B细胞、Treg细胞及单核巨噬细胞（CD14+）比例均显著降低（P<0.01）,且食管癌患者与对照组之间无统计学差异（P>0.05）。经细胞因子体外培养20 d后,NK细胞表面CD69及活化性受体（NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46）均明显上调,而抑制性受体（CD158b、CD159a）均明显下调（P<0.05）。培养20 d后,食管癌患者NK细胞对肿瘤细胞K562、Raji、Eca-109、TE-1的杀伤能力均显著高于培养前\[（69.2±5.1）% vs （42.3±3.0）%,（44.6±3.2）% vs （21.1±2.0）%,（69.7±3.9）% vs （50.3±35）%,（67.1±4.5）% vs （41.2±3.3）%;均P<0.01\]。 结论: 细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合能有效扩增外周血NK细胞并上调其活并性受体的表达、下调抑制性受体的表达,其数量及功能均能满足临床治疗需要。     

乳腺癌患者可溶性MICA对自然杀伤细胞受体的影响

目的观察乳腺癌患者外周血自然杀伤（NK）细胞杀伤活性及受体的变化,探讨可溶性MICA（sMICA）对NK细胞受体及杀伤活性的影响。方法ELISA法检测外周血血清sMICA的含量。流式细胞术（FCM）检测NK细胞百分比、NK细胞活化性受体NKG2D、抑制性受体KIR（CD158b）表达。MTT法检测NK细胞对乳腺癌细胞株MCF-7的杀伤活性。结果与健康人比较,乳腺癌患者中81．6％表达sMICA,含量为（205．36±71．27）ng／L,且sMICA含量与TNM分期呈正相关。乳腺癌患者外周血NK细胞所占百分比无明显差异,但血清sMICA阳性的乳腺癌患者中NK细胞杀伤活性明显降低,NKG2D表达下降,CD158b表达增高。当NK细胞培养体系中加入sMICA阳性的乳腺癌血清时,其杀瘤活性明显降低【（76．2±6．7）％与（48．4±4．1）％】,NKG2D的表达明显下调[（92．5±7．1）％与（62．5±6．4）％],而CD158b的表达明显上升【（10．6±3．2）％与（43．6±3．4）％】。sMICA阳性的乳腺癌患者NK细胞与细胞因子IL-15共培养,NK细胞的杀瘤活性、NKG2D的表达明显升高,KIR（CD158b）的表达明显下降。结论乳腺癌外周血血清中sMICA可通过下调NK细胞NKG2D表达以及上调KIR表达,降低NK细胞杀瘤活性。IL-15可逆转sMICA对NK细胞的免疫下调作用。     

K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果

目的：评价新建立的K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果。 方法：采集健康志愿者和肿瘤患者的外周血PBMC并分离NK细胞,采用前期构建的K562工程细胞(将IL-15、4-1BBL和IL-18在白血病K562细胞上进行跨膜表达获取）联合IL-2培养方案对NK细胞进行扩增和活化,以流式细胞术检测NK细胞的扩增效果和NK细胞表面受体表达水平,CCK-8法检测扩增后NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和ADCC活性,CCK-8法检测在培养方案扩增末期加入TKD多肽对NK细胞的活化效果。结果：对于健康志愿者的NK细胞,新建立扩增培养方案可使NK细胞在PBMC中的比例提高至（93±3）%;使NK细胞中活化性受体NKG2D、CD94、NKp30、NKp44和NKp46的比例分别提高60%、40%、20%、40%和63%,而抑制性受体的表达变化不大;扩增后NK细胞对白血病细胞K562、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMU-7721和乳腺癌细胞MCF-7的杀伤活性分别提高了19%、29%、26%和28%,其ADCC活性从（33±5.6）%上升至（65±12）%;方案中增加TKD可使NK细胞的杀伤活性从（86±4）%提高至（96±2）%。对于肿瘤患者的NK细胞,新扩增方案使其在PBMC的比例提高至（90.0±8.0）%,其对K562细胞的杀伤活性提高了17%左右。 结论： K562工程细胞联合IL-2扩增方案可高效扩增NK细胞,明显激活其杀伤活性,扩增和活化的NK细胞可满足临床治疗的需要。     

干扰素α对恶性造血细胞系主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关蛋白A表达的上调作用

目的观察干扰素a（IFN-a）对恶性造血细胞系主要组织相容性复合体（MHC）I类链相关蛋白A（MICA）表达的影响。方法反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测人类慢性髓系白血病细胞K562及人类伯基特淋巴瘤细胞Raji细胞MICAmRNA的表达,免疫组织化学法检测MICA蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝（MTF）比色法检测人类外周血自然杀伤（NK）细胞对肿瘤细胞的杀伤。结果K562细胞MICA表达阳性,Raji细胞MICA表达阴性。Raji和K562细胞分别在1000U／ml IFN-a诱导24h和48h时MICAmRNA开始表达上调（t=17．016,P〈0．05;t=5．616,P〈0．05）。72hRaji细胞和K562细胞分别在500U／ml和1000U／ml诱导条件下MICAmRNA表达开始上调（t=6．622,P〈0．05;t=9．071,P〈0．05）。IFN—Ot对MICAmRNA表达的上调作用呈一定时间和剂量依赖关系,且蛋白与mRNA表达水平一致。1000U／ml IFN—a诱导72h后,Raji细胞和K562细胞对NK细胞杀伤的敏感性明显上调（t=20．016,P〈0．05;t=7．969,P〈0．05）,抗MICA抗体封闭MICA后,NK细胞对Raji细胞杀伤率恢复至诱导前水平（t=0．393,P〉0．05）,而K562细胞则低于诱导前水平（t=9．841,P〈0．05）。结论IFN—a上调了恶性造血细胞中MICA基因的转录表达,继而增强了NK细胞对其识别与杀伤。     

NK细胞活化性受体NKG2D及其配体MICA在胃肠道肿瘤免疫逃逸机制中的作用

目的了解胃肠道肿瘤患者血清可溶性MICA（sMICA）的水平及其与自然杀伤（NK）细胞活化性受体NKG2D的关系,探讨NKG2D—MICA在胃肠道肿瘤免疫逃逸机制中的作用,为胃肠道肿瘤免疫治疗打下实验和理论基础。方法选择123例胃肠道肿瘤患者,均经病理证实。ELISA法检测血清sMICA含量,同时检测患者NK细胞活化性受体NKG2D表达水平。取30名健康人血清作对照。结果健康人sMICA水平（225．46±36．65）pg／ml。胃癌无远处转移患者（337．59±60．20）pg／ml（P〈0．01）,肠癌无转移患者（372．68±53．61）pg／ml也明显高于健康人（P〈0．01）。有远处转移的胃癌患者血清sMICA（391．52±51．68）pg／ml高于无转移患者（P〈0．05）,同样有远处转移肠癌患者血清中sMICA含量（452．45±56．13）pg／ml高于无转移患者（P〈0．05）。患者NK细胞活化性受体NKG2D表达率,在无转移的胃癌患者中为（78．95±3．39）％,肠癌中为（76．00±7．22）％,均低于健康人（82．58±4．36）％（P〈0．05）,而有远处转移的胃癌患者表达率为（73．65±5．38）％,低于无转移的患者（P〈0．01）,有远处转移的肠癌患者表达率为（70．14±5．62）％,低于无转移的肠癌患者（P〈0．05）。结论胃肠道肿瘤患者sMICA水平明显增高,可能是肿瘤细胞表面MICA脱落所致。NKG2D的表达低于健康对照组,提示患者NK细胞的NKG2D—MICA杀伤肿瘤细胞效应减弱,这可能是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。     

苦参碱诱导自然杀伤细胞对白血病K562细胞杀伤的实验研究

目的 探讨中药苦参碱对人自然杀伤（NK）细胞体外杀伤白血病细胞的作用及可能的分子机制.方法 以人慢性粒细胞白血病K562细胞为靶细胞,采用CFSE/PI双染色法流式细胞术检测不同质量浓度（02、0.5、0.8 mg/ml）苦参碱处理后,人NK细胞在不同效靶比下对K562细胞的体外杀伤活性.流式细胞术分析不同浓度苦参碱处理24 h对NK细胞主要活化性受体NKG2D和抑制性受体CD158a、CD158b表达的影响及K562细胞膜上NKG2D配体MICA/B、ULBP1、ULBP 2、ULBP 3表达的改变.结果 效靶比为5∶1时,NK细胞对0.2、0.5和0.8 mg/ml苦参碱处理后的K562细胞杀伤率分别为32.8％、38.1％和40.5％,较处理前均有不同程度增高（29.2％）;但进一步增加效靶比（10：1）后,NK细胞杀伤活性改变差异无统计学意义（P＞0.05）.苦参碱处理24 h,NK细胞抑制性受体CD158a、CD158b的表达均较处理前降低,而活化受体NKG2D的表达则增高.K562细胞表面NKG2D配体ULBP1和ULBP2分子的表达也较处理前增高（平均荧光强度分别为174.33±39.93比275.67±32.88,517.6±47.97比1368.6±49.43,P＜0.05）.结论 苦参碱可增强NK细胞对白血病K562细胞的体外杀伤活性,其机制可能与NK细胞受体及配体表达调节作用有关.     

NKG2D介导NK 细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究

 目的 探讨鼻咽癌CNE2细胞表面HLA-Ⅰ类分子表型和NKG2D配体的表达情况，进一步了解其对同种异体NK细胞杀伤活性的影响。方法 流式细胞仪检测NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3在K562、CNE2细胞的表达情况。PCR-SSP法分析CNE2细胞HLA-A、B、Cw分型和NK细胞KIR分型。LDH释放法测定5例健康者NK细胞在不同效靶比时对K562、CNE2细胞的杀伤活性，效靶比20：1时观察抗NKG2D配体的单抗对NK细胞杀伤K562、CNE2细胞活性的影响。结果 CNE2细胞表达MICA、MICB、ULBP2，不表达ULBP1、ULBP3。K562细胞表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。5例健康者NK细胞抑制性KIR与CNE2细胞表面的HLA-Ⅰ类分子之间存在错配。效靶比5：1、10：1、20：1、30：1时NK细胞对K562、CNE2细胞的杀伤活性分别为（29．02±0．45）％、（10．50±2．17）％；（44．43±1．36）％、（27．68±1．47）％；（57．82±1．35）％、（36．99±3．13）％：（71．24±2．36）％、（55．00±2．20）％，在各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较CNE2细胞明显增强（P=0．000）；在效靶比20：1时anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP1、anti—ULBP2、anti-ULBP3可明显抑制NK细胞对K562细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显著性差异（P=0．000）；anti—MICA、anti—MICB、anti—ULBP2可明显抑制NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性，与阻断前相比有显著性差异（P〈0．01），但anti—ULBP1、anti—ULBP3不能阻断NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性。结论 NKG2D配体影响NK细胞对靶细胞的杀伤活性，提高NKG2D配体的表达有可能提高NK细胞的抗肿瘤活性。     

IL-2+IL-15组合培养方案对乳腺癌患者外周血中NK细胞体外扩增的效果

目的：观察IL-2+IL-15组合体外培养方案对于NK、NKT和T细胞亚群的比例、表型、杀伤肿瘤细胞活性与黏附活性的影响,并初步探讨其作用机制。方法：采集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年5月至2012年7月期间收治的5例乳腺癌患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,用IL-2+IL-15 联合培养方案进行培养,观察培养15 d后细胞的扩增倍数和淋巴细胞亚群比例变化,流式细胞术检测细胞免疫表型、细胞表面受体的表达,LDH释放法和CD107a释放法检测不同细胞亚群对于HLA匹配或不匹配的靶肿瘤细胞系的杀伤活性,活细胞工作站检测总扩增产物对于不同靶肿瘤细胞系的黏附作用。结果：与扩增前相比,IL-2+IL-15培养方案扩增15 d后,NK细胞\[（36.74±1710）% vs （16.34±3.12）%,P<0.05\]、NKT细胞\[（24.88±12.34）% vs （4.06± 2.05）%,P<0.05\]比例显著增加,CD4+ T细胞和Treg细胞比例显著降低（P<0.05）,CD8+ T细胞比例显著升高（P<0.05）;NK细胞表面活化受体NKp30\[（ 92.38±7.19）% vs（32.14±17.64）%,P<0.05\]、NKp44\[（74.26±16.28）% vs（1.94±1.60）%,P＜0.05\]、NKG2D \[（ 98.58±128）% vs（6650±24.84）%,P<0.05\] 的表达率均显著升高,CD16表达率显著降低\[（ 85.12±7.66）% vs（95.60±253）%,P<0.05\]; NKT细胞、T细胞表面活化受体DNAM-1和NKG2D明显升高（P<0.05）。总扩增产物、NK细胞和NKT细胞对HLA不匹配的靶肿瘤细胞的杀伤率均显著高于HLA匹配靶细胞系的杀伤（P<0.05）;在共孵育至84 min时,与HLA匹配的靶肿瘤细胞系相比,总扩增产物细胞与HLA不匹配的靶细胞系黏附结合数目显著增多\[（ 4.80±0.53） vs （2.25±035）个,P<0.05\]。结论：IL-2+IL-15组合方案在扩增NK细胞的同时,也能够有效扩增NKT细胞,即可以扩增CD56+细胞群。并且,扩增产物主要以不受HLA限制的NK细胞杀伤活性为主来杀伤肿瘤细胞。     

肿瘤射频消融裂解物负载的DC—CIK细胞体外抗肿瘤活性实验研究

目的研究负载射频消融肿瘤原位裂解物的树突状细胞（Dc）联合细胞因子诱导杀伤活性细胞（CIK）体外抗肿瘤活性。方法制备BALB／C小鼠脾脏来源的CIK细胞及骨髓来源的Dc。建立射频消融灭活小鼠皮下结肠癌的实验模型,将其原位裂解的肿瘤组织反复冻融后取上清,lowry蛋白定量法定量,以终浓度5μg／ml载培养第5天的Dc（即Ag-Dc）,2d后再与培养第7天的CIK细胞共培养48h,流式细胞术分析其表面共刺激分子的表达,细胞增殖与毒性检测试剂盒（CCK-8试剂盒）检测其体外杀伤活性。结果DC表面分子表达共刺激分子CD86＋ CD11c＋、MHCⅡ＋ CD11c＋、MHCⅡ＋ CD80＋双阳性细胞百分含量分别为9．50％、42．4％、53．4％;Ag-DC表面分子表达共刺激分子双阳性细胞百分含量明显提高,分别为19．2％、74．2％、61．1％。CIK细胞培养第1天,CD3＋ NK1．1＋双阳性的百分含量为1．45％,第7天CD3＋ NK1．1＋双阳性表达明显提高为36．9％。Ag—DC—CIK细胞对结肠癌细胞C26的杀伤活性明显高于DC-CIK、CIK细胞,且相同效靶比下前者的杀伤活性明显高于后者。效靶比为5：1时,Ag-DC-CIK细胞杀伤率为（74．9±3．5）％,DC-CIK细胞杀伤率为（71．2±2．1）％,CIK细胞杀伤率为（68．7±2．9）％,差异有统计学意义（F=7．007,P=0．007）;效靶比为10：1时,Ag—DC-CIK细胞杀伤率为（82．3±4．5）％,DC-CIK细胞杀伤率为（77．1±5．1）％,CIK细胞杀伤率为（72．7±2．8）％,差异有统计学意义（F=7．727,P=0．005）;效靶比为20：1时,Ag-DC-CIK细胞杀伤率为（83．2±1．9）％,DC-CIK细胞杀伤率为（77．2±4．2）％,CIK细胞杀伤率为（73．0±2．6）％,差异有统计学意义（F=16．594,P=0．000）。结论负载肿瘤射频消融原位裂解产物的DC联合CIK细胞可以提高体外细胞毒活性,为肿瘤综合治疗提供新策略。     

KIR2DS1受体对人类NK细胞杀伤白血病细胞的作用研究

目的 探讨活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）家族成员KIR2DS1在自然杀伤（NK）细胞杀伤白血病细胞中的作用.方法 采集健康人群外周血单个核细胞,采用NK细胞分选试剂盒富集NK细胞,将分选的NK细胞进行体外扩增培养,以作为效应细胞.取初治确诊的急性髓细胞白血病（AML）患者新鲜骨髓液,分离后的白血病细胞作为靶细胞.采用CCK8比色法检测NK细胞对白血病细胞的杀伤率.采用聚合酶链反应和顺序特异性引物（PCR-SSP）基因分型法分别检测NK细胞及靶细胞的KIR基因和HLA-Cw;根据KIR2DS1表达与否将NK细胞分为KIR2DS1阳性NK细胞与KIR2DS1阴性NK细胞;用抗-KIR2DS1抗体封闭NK细胞的KIR2DS1受体,用CCK8比色法检测封闭前后KIR2DS1阳性组NK细胞对靶细胞的杀伤率.根据HLA-Cw将NK细胞和靶细胞分别分为C1纯合子组（表达HLA-Cw 01、03、07、08、12、14、16）、C2纯合子组（表达HLA-Cw02、04、05、06、15、17、18）和C1/C2杂合子组（既表达C1组的等位基因又表达C2组的等位基因）.结果 经过富集后NK细胞的纯度为（91.2±5.94）％;不同效靶比下,KIR2DS1阳性NK细胞的杀伤率明显高于阴性组;当效靶比为10：1时,KIR2DS1阳性NK细胞组对白血病细胞的杀伤率（42.82±6.81）％高于KIR2DS1阴性组（28.61±5.14）％;抗-KIR2DS1封闭后NK细胞对白血病细胞杀伤作用明显减弱（t=-3.00,P＜0.05）;KIR2DS1阳性NK细胞C1纯合子组对靶细胞C2纯合子组的杀伤率（54.39±3.46）％明显高于靶细胞C1组（41.22±3.68）％（t=8.33,P＜0.05）和C1/C2组（41.32±5.09）％（t=6.37,P＜ 0.05）.结论 KIR2DS1阳性NK细胞对白血病细胞的杀伤效力高于KIR2DS1阴性NK细胞,即KIR2DS1可以有效介导NK细胞杀伤白血病细胞;HLA-C1纯合子的KIR2DS1阳性NK细胞对HLA-C2纯合子的靶细胞杀伤作用强.     

Tim-3分子在胃癌患者外周血NK细胞上的表达及临床意义

目的：检测Tim-3分子在胃癌荷瘤个体NK细胞上的表达,探讨Tim-3在胃癌发生发展中的作用。方法：收集2012年8月-2013年1月在苏州大学附属第一医院初治的原发性胃癌患者32例,健康体检者28例为正常对照组。流式细胞仪检测胃癌患者及正常对照组外周血NK细胞上Tim-3的表达,分析其与胃癌患者临床病理特征的关系。结果：胃癌患者外周血CD56＋NK细胞上Tim-3的表达量为（49.27±21.06）%,显著高于健康对照组（37.00±17.16）%（P〈0.05）。有淋巴结转移者 Tim-3＋CD56＋NK 细胞高表达率（55%）高于无淋巴结转移患者（0%）;有远处转移患者Tim-3＋CD56＋NK细胞高表达率（100%）显著高于无远处转移者（40.7%）,差异均有统计学意义（P〈0.05）。Ⅲ-Ⅳ期胃癌患者Tim-3＋CD56＋NK细胞高表达率较Ⅰ-Ⅱ期患者高（73.7% vs 15.4%）,差异具有显著性（ P〈0.01）。结论：Tim-3在胃癌的发生发展中发挥着一定作用,是潜在的用于评估胃癌预后的指标。     

复方参鹿颗粒干预肾阳虚型骨髓增生异常综合征造血调控的临床观察

 目的　评判复方参鹿颗粒对肾阳虚型骨髓增生异常综合征（MDS）（难治性贫血／难治性血细胞减少伴多系造血异常）（RA／RCMD）造血调控情况。方法　30例MDS-RA／RCMD患者随机分成复方参鹿颗粒组（简称参鹿组）（15例）和十一酸睾酮组（15例）,测评治疗前后外周血象、T细胞亚群＋自然杀伤（NK）细胞、骨髓细胞免疫表型。结果　参鹿组与治疗前相比,红细胞、血色素、血小板有明显上升,治疗前分别为（2.39±0.99）×1012／L、（84.47±28.68）g／L、（81.13±96.85）×109／L,治疗后分别为（2.80±0.98）×1012／L、（94.87±25.63）g／L、（98.67±107.9）×109／L,差异均有统计学意义（t＝4.0359、t＝2.7009、t＝2.2573,均P＜0.05 ）,十一酸睾酮组仅有血红蛋白数量上升,治疗前为（71.93±27.53）g／L,治疗后为（80.07±26.03）g／L,差异有统计学意义（t＝2.3125,P＝0.0365）;参鹿组治疗后CD+4、CD+8、CD+4／CD+8、NK细胞均达到或接近正常值,分别为（37.9±5.9）%、（24.0±5.8）%、1.75±0.83、（13.0±6.9）%,与治疗前的（29.3±11.7）%、（29.6±5.8）%、1.12±0.59、（8.8±5.7）%相比差异有统计学意义（t＝2.6194、t＝2.6595、t＝2.6581、t＝2.2288,均P＜0.05）,十一酸睾酮组治疗后仅CD+8、CD+4／CD+8接近正常值,分别为（22.1±7.5）%、1.50±0.74,与治疗前（26.6±7.5）%、1.18±0.55相比差异有统计学意义（t＝2.2377,P＝0.0420;t＝2.9352,P＝0.0109）,治疗后,参鹿组CD+4表达率为（37.9±5.9）%,十一酸睾酮组为（30.5±12.6）%,差异有统计学意义（t＝2.1738,P＝0.0474）;参鹿组对骨髓细胞CD+13、CD+33、CD+34、CD+64、CD+117的异常阳性表达调控能力强于安雄组（前三者u＝2.76、u＝3.39、u＝2.85,均P＜0.01,后两者u＝2.17、u＝2.46,均P＜0.05）。结论　复方参鹿颗粒能有效调控肾阳虚型MDS-RA／RCMD正常造血功能。     

STC-1蛋白对肾癌细胞生长平衡影响机制探讨

目的：研究斯钙素1（stanniocalcin1,STC-1）与缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）的相互作用,是否借助调节Ca2＋水平参与肾癌细胞生长调控。方法：构建高表达HIF-1α的肾癌细胞模型,使用不同浓度STC-1蛋白干预转染后的肾癌细胞（转染组）和单纯肾癌细胞（非转染组）。MTT法检测各组细胞增殖情况;RT-PCR及ELISA法检测细胞内HIF-1α、STC-1基因及蛋白表达;荧光分光光度计检测细胞内Ca2＋水平。结果：非转染组和转染组肾癌细胞HIF-1α蛋白表达分别为8.3±1.2和15.1±0.9,t=24.18,P〈0.001;STC-1蛋白表达分别为7.2±0.9和10.8±1.1,t=8.90,P=0.003;提示转染HIF-1α的肾癌细胞内HIF-1α和STC-1表达显著提高。不同浓度STC-1溶液干预非转染组肾癌细胞24h后,对照组HIF-1α蛋白表达为8.3±0.5,低剂量组为7.8±0.7,中剂量组为5.3±0.4,高剂量组为4.2±0.3,F=171.726,P〈0.001,对照组STC-1蛋白表达为7.1±0.4,低剂量组为6.8±0.3,中剂量组为4.1±0.2,高剂量组为3.3±0.4,F=257.174,P〈0.001;对照组细胞内Ca2＋含量为95.7±8.6,低剂量组为60.3±5.5,中剂量组为48.6±6.3,高剂量组为33.7±4.2,F=198.931,P〈0.001,对照组细胞增殖活性为0.226±0.021,低剂量组为0.343±0.024,中剂量组为0.293±0.018,高剂量组为0.252±0.023,F=23.615,P〈0.001;不同浓度STC-1溶液干预转染组肾癌细胞24h后,对照组HIF-1α蛋白表达为15.3±1.6,低剂量组为14.6±1.1,中剂量组为10.1±0.9,高剂量组为8.6±0.8,F=135.696,P〈0.001,对照组STC-1蛋白表达为11.2±0.4,低剂量组为10.9±0.5,中剂量组为7.4±0.7,高剂量组为5.6±0.8,F=105.101,P〈0.001;对照组细胞内Ca2＋含量为65.5±6.7,低剂量组为40.1±3.4,中剂量组为30.7±4.6,高剂量组为17.7±3.3,F=136.621,P〈0.001;对照组细胞增殖活性为0.295±0.033,低剂量组为0.446±0.025,中剂量组为0.379±0.015,高剂量组为0.313±0.022,F=45.571,P〈0.001。提示STC-1蛋白可促进单纯肾癌细胞和转染后肾癌?     

不同纵隔淋巴结切除方式对非小细胞肺癌患者围手术期免疫功能的影响

目的 探讨肺癌纵隔淋巴结不同切除方式对非小细胞肺癌患者围手术期免疫功能的影响.方法 连续收集2009年3月至2012年3月接受手术治疗的415例非小细胞肺癌患者临床资料,其中系统性淋巴结清扫术（SLND）组216例,淋巴结采样术（LNS）组199例.检查所有患者术前、术后3d及术后7d外周血淋巴细胞计数（LC）及淋巴细胞中CD4＋T淋巴细胞、CD8＋T淋巴细胞、自然杀伤（NK）细胞比例.对两组患者上述指标进行比较.结果 SLND组术后各时点全血中淋巴细胞、CD8＋T淋巴细胞、NK细胞比例均低于LNS组,差异有统计学意义[术后3d：淋巴细胞（0.95±0.57）×10^9/L比（1.10±0.65）×10^9/L,CD8＋T淋巴细胞（19.53±6.48）％比（20.93±6.70）％,NK细胞（17.36±6.06）％比（18.57 ±5.97）％,均P＜0.05;术后7d：淋巴细胞（0.86±0.53）×10^9/L比（1.00±0.60）×10^9/L,CD8＋T淋巴细胞（17.27±5.64）％比（18.40±5.26）％,NK细胞（13.11 ±4.84）％比（14.20±5.30）％,均P＜ 0.05];术后3d时LND组CD4＋T淋巴细胞低于SLNS组,差异有统计学意义[（29.59±6.53）％比（31.19±6.32）％,P＜0.05],术后7d时两组差异无统计学意义[（36.64±6.65）％比（37.20±6.83）％,P＞0.05].结论 与SLND相比较,LNS可以减轻患者术后免疫功能的抑制.     

CD4^＋IL-9^＋细胞在大肠癌免疫微环境中的分布及临床意义

目的：检测CD4^＋IL-9^＋（Th9）细胞在大肠癌免疫微环境中的表型和分布特征,分析其与临床病理的相关性。方法：选取2013-06-05-2013-10-10广西医科大学第一附属医院初次行手术治疗的45例大肠癌患者的肿瘤组织、相对应癌旁组织以及外周血（术前和术后）,同时抽取15例健康志愿者外周血,用流式细胞仪检测各标本中Th9、Th1和Th2在CD4＋细胞中的比例,记录患者的临床病理资料（性别、年龄、民族、Ducks分期、肿瘤大小、淋巴结转移、CEA和AFP水平）;另选取5例同期肠癌患者的肿瘤组织对Th9细胞表型特征（CD45RO／CD45RA）进行流式细胞仪测定。结果：肠癌组织中的Th9细胞比例为（1．12_＋0．33）％,明显高于癌旁组织（0．85±0．29）％和术前外周血（0．65±0．27）％,P值均〈0．05;肠癌组织中Th9细胞表面高表达CD45RO蛋白为（85．23±5．91）％,低表达CD45RA蛋白为（18．23±6．78）％;术前外周血Th9细胞比例为（0．65±0．27）％,明显高于术后外周血（0．47±0．24）％,P=0．0012;Th9细胞与肠癌临床病理相关性分析表明,其与Ducks分期有关,P〈0．05,与其他因素无关;肠癌组织中Th9细胞比例与Th1细胞无明显相关,r=0．140,P=0．360,与Th2细胞比例呈负相关,r=-0．65,P〈0．001。结论：Th9淋巴细胞在大肠肿瘤微坏境存在聚集现象,其与肿瘤的进展有关,可能参与了大肠癌免疫微环境的调节进而影响了肿瘤的发生和发展。     

乳腺癌术后化疗对外周血T细胞亚群、NK细胞和Treg细胞的影响

目的 探讨乳腺癌术后化疗对患者外周血T细胞亚群、NK细胞（CD16+CD56+自然杀伤细胞）和Treg细胞（CD4+CD25+调节性T细胞）的影响及临床意义。方法 采集62例乳腺癌患者术后首次化疗前1天和第6次化疗结束2周的外周血, 应用流式细胞技术检测外周血中T细胞亚群、NK细胞和Treg细胞的比例。结果 化疗后与化疗前相比,外周血CD4+T细胞的比例下降（24.78±1.62 vs. 33.78±2.1）,CD8+T细胞（26.26±2.00 vs. 22.95±3.48）和NK细胞（24.09±0.83 vs. 12.26±1.09）比例升高,CD4+／CD8+T细胞比例降低（0.84±0.15 vs. 1.46±0.35）,Treg细胞比例下降（10.35±1.48 vs. 17.47±1.11）,差异均有统计学意义（P＜0.05）。在分层分析中发现,采用TEC方案化疗组患者的外周血中Treg细胞下降的幅度要高于FEC方案化疗组。结论 化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时可能在不同水平影响机体免疫功能,而且使用不同的化疗方案会有一定的差异。     

弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞检测的临床意义

 【摘要】　目的　探讨弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者化疗前后外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞的变化与治疗效果的关系。方法　收集经病理确诊且治疗有效的DLBCL患者47例,分别于化疗前及化疗第2个周期、第4个周期结束后第3天采集静脉血,经流式细胞术测定T淋巴细胞亚群及NK细胞,比较化疗前与化疗后T淋巴细胞亚群、NK细胞水平的差异,并与同期健康体检者50名进行比较。结果　DLBCL患者组化疗前外周血CD+3、CD+4、CD+4／CD+8、NK细胞表达水平[（70.04±8.87）%、（42.79±6.06）%、（1.68±0.59）%、（14.40±6.02）%]较健康对照组[（63.89±6.67）%、（32.72±5.77）%、（0.85±0.25）%、（9.95±5.24）%]低（P＜0.05）,而CD+8细胞表达水平较健康对照组高[（27.21±6.54）%比（39.92±7.11）%]（P＜0.05）。DLBCL患者组化疗第4个周期外周血CD+3、CD+4、CD+4／CD+8表达水平与化疗第2个周期相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）,该组患者化疗第4个周期CD+3、CD+4、CD+8、CD+4／CD+8、NK细胞表达水平与治疗前相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论　初治DLBCL患者体内存在着免疫抑制,外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞可作为反映DLBCL患者机体细胞免疫功能的较好参数,在临床上可用于免疫功能的监测,为DLBCL治疗方案的选择提供指导意义。     

血清抗体及补体对利妥昔单抗介导的NK 细胞杀伤Raji细胞作用的影响

 【摘要】 目的 体外检测血清抗体及补体对利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞杀伤作用的影响。方法 通过巢式反转录聚合酶链反应（nest-PCR）检测NK细胞上FcγRⅢa（CD16a）基因型;流式细胞术检测加入血清抗体前后NK细胞上FcγRⅢa的表达;DIO-PI双荧光染色法检测添加血清补体及抗体后NK细胞对Raji细胞的杀伤效应强度。结果 添加血清补体组杀伤率较未添加组明显增强,而添加血清抗体组杀伤率较未添加组明显减弱,在FcγRⅢa-158V／V组内,添加血清补体组、添加血清抗体组与未添加组细胞毒性指数分别为（94.25±1.79） %、（59.79±0.66） %和（69.05±2.38） %,三组之间两两比较均P＜0.05;在FcγRⅢa-158V／F组内,添加血清补体组、添加血清抗体组与未添加组细胞毒性指数分别为（66.71±5.57） %、（18.13±2.99） %和（39.63±3.86） %,三组之间两两比较均P＜0.05。结论 血清补体可增强利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞的杀伤作用。血清抗体会减弱利妥昔单抗介导的NK细胞对Raji细胞的杀伤作用。使用肿瘤特异性单克隆抗体（MAb）治疗肿瘤患者时,同时输注新鲜冷冻血浆可提高其抗肿瘤疗效;而MAb与静脉注射用免疫球收白（IVIG）同时使用则可能降低其抗肿瘤疗效。