紫杉醇诱导胆管癌QBC939细胞凋亡的初步研究

目的：探讨紫杉醇对胆管癌QBC939细胞作用的敏感性并研究紫杉醇对胆管癌细胞周期及细胞凋亡率的影响,并初步探讨紫杉醇诱导胆管癌细胞发生凋亡的机制,为胆管癌的临床治疗寻找新的治疗药物。方法：体外培养胆管癌细胞QBC939,采用不同浓度紫杉醇予以干预,通过细胞形态观察和Mrrr实验,初步研究紫杉醇对人胆管癌细胞QBC939的敏感性;应用流式细胞仪检测紫杉醇诱导胆管癌细胞凋亡,同时对细胞周期的变化和动力学予以检测。结果：各浓度紫杉醇对人胆管癌细胞QBC939生长均有明显抑制作用;胆管癌细胞被紫杉醇明显阻滞在S期及G2／M期,且抑制作用呈剂量和时间依赖效应。结论：紫杉醇对人胆管癌细胞QBC939增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖效应;紫杉醇能诱导人胆管癌QBC939细胞发生凋亡。     

紫杉醇诱导胆管癌QBC939细胞凋亡的初步研究

目的:探讨紫杉醇对胆管癌QBC939细胞作用的敏感性并研究紫杉醇对胆管癌细胞周期及细胞凋亡率的影响,并初步探讨紫杉醇诱导胆管癌细胞发生凋亡的机制,为胆管癌的临床治疗寻找新的治疗药物.方法:体外培养胆管癌细胞QBC939,采用不同浓度紫杉醇予以干预,通过细胞形态观察和MTT实验,初步研究紫杉醇对人胆管癌细胞QBC939的敏感性;应用流式细胞仪检测紫杉醇诱导胆管癌细胞凋亡,同时对细胞周期的变化和动力学予以检测.结果:各浓度紫杉醇对人胆管癌细胞QBC939生长均有明显抑制作用;胆管癌细胞被紫杉醇明显阻滞在S期及G2/M期,且抑制作用呈剂量和时间依赖效应.结论:紫杉醇对人胆管癌细胞QBC939增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖效应;紫杉醇能诱导人胆管癌QBC939细胞发生凋亡.     

生长激素对胆管癌细胞体外增殖的影响

目的：探讨生长激素在体外对胆管癌QBC939细胞增殖的影响。方法：将胆管癌细胞随机分为实验组（GH组）和对照组（NS组），GH组按剂量和培养时间分为50μg／L2h（GH50—2h），50μg／L24h（GH50—24h）．100μg／L2h（GH100—2h），100μg／L24h（GH100—24h）4个亚组，NS组按培养时间也分为NS-2h、NS-24h两个亚组，2h和24h后吸取上清用ELISA法检测类胰岛素生长因子1（IGF1）并细胞计数；胆管癌细胞用不同浓度GH（50μg／L，100μg／L）培养24h后固定，以流式细胞仪测定细胞周期；同时在不同浓度GH（50μg／L，100μg／L）干预的培养液中行细胞爬片后固定，用原位杂交的方法检测类胰岛素生长因子1受体mRNA（IGF1RmRNA）。结果：培养液中加入GH2h后QBC939细胞无明显增多（P〉0．05），但24h后细胞数目明显增多并有统计学意义（P〈0．05），24h流式细胞仪检测显示S期细胞百分（S％）比和细胞增殖指数（PI）也明显增加（P〈0．05）。IGF1RmRNA在胆管癌中呈阳性表达，且GH可诱导细胞IGF1RmRNA表达增强。结论：GH在体外能促进胆管癌QBC939细胞的增殖和分化。     

LY294002对胆管癌细胞化疗增敏作用的探讨

目的：运用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂（phosphatidyhnositol 3-kinase，PI3-K）LY29400212-（4-吗啉基）-8-苯基-4氢-1-幕并吡喃-4-酮]作用于胆管癌细胞系QBC939，探讨抑制PI3K／AKT信号转导通路对胆管癌化疗的增敏作用。方法：MTT法检测单独使用5-FU，MMC，celecoxib，联合磷酸化抑制奔ILY294002．体外对胆管癌细胞系QBC939的抑制作用；运用流式细胞技术检测QBC939凋亡抑制率。结果：运用LY294002后能明显增加5-FU，MMC，celecoxib对胆管癌细胞系QBC939体外培养细胞的抑制作用，并且能提高其凋亡率。结论：LY294002能有效提高化疗药物5-FU，MMC，celecoxib体外对QBC939细胞抑制作用的敏感性；抑制PI3K介导的信号转导通路对胆管癌肿瘤的治疗中可能有一定的协同作用．     

他莫昔芬联合化疗对胆管癌耐药细胞株QBC939／ADM的影响

目的探讨他莫昔芬（TAM）联合化疗对胆管癌耐药细胞株QBC939／ADM的影响及其机制。方法应用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测TAM、多柔比星（ADM）、丝裂霉素（MMC）、长春地辛（VDS）及TAM分别联合其他三种化疗药对胆管癌细胞株QBC939及其耐药细胞株QBC939／ADM存活率的影响。流式细胞术（FCM）观察细胞生长周期及凋亡情况，观察细胞内ADM浓度的变化。免疫组织化学法（IHC）检测细胞P糖蛋白（P—gP）的表达。结果加用TAM后化疗药的作用得到增强，细胞凋亡率也明显提高。IHC结果显示QBC939／ADM呈过度表达，与QBC939相比，QBC939／ADM细胞内ADM的含量明显减少。用高浓度的TAM（10umol／L）作用QBC939／ADM后，细胞表面P—gP含量降低，细胞内ADM的含量相应提高。TAM对两种细胞的化疗都有增敏作用，其中耐药细胞的增敏作用更为显著。结论TAM可增强化疗药对胆管癌细胞株QBC939以及耐药细胞株QBC939／ADM的抑制作用，并可提高QBC939／ADM细胞内的药物浓度，其机制可能与其竞争结合过度表达的P—gp有关。     

尼美舒利对胆管癌细胞增殖及PCNA、Survivin蛋白表达的影响

目的：观察选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939生长的抑制作用及Survivin基因表达的变化。方法：应用MTT比色法、细胞群体倍增时间观察尼美舒利对人胆管癌细胞QBC939增殖的影响，流式细胞仪检测细胞凋亡，免疫组织化学法观察尼美舒利对QBC939细胞PCNA，Survivin蛋白表达的影响。结果：尼美舒利呈时间、剂量依赖性抑制胆管癌增殖，高浓度（200μmol／L）尼美舒利不仅抑制胆管癌细胞增殖，而且诱导其凋亡。流式细胞仪研究显示，随药物浓度增加，细胞凋亡率显著增加。免疫组化结果显示尼美舒利处理后的QBC939细胞PCNA，Survivin蛋白的表达明显减弱。结论：尼美舒利能抑制QBC939细胞增殖，诱导其凋亡，其机制可能与PCNA，Survivin蛋白的表达下调有关。     

尼美舒利对胆管癌细胞增殖及PCNA、Survivin蛋白表达的影响

目的:观察选择性环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939生长的抑制作用及Survivin基因表达的变化.方法:应用MTT比色法、细胞群体倍增时间观察尼美舒利对人胆管癌细胞QBC939增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡,免疫组织化学法观察尼美舒利对QBC939细胞PCNA,Survivin蛋白表达的影响.结果:尼美舒利呈时间、剂量依赖性抑制胆管癌增殖,高浓度(200μmol/L)尼美舒利不仅抑制胆管癌细胞增殖,而且诱导其凋亡.流式细胞仪研究显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加.免疫组化结果显示尼美舒利处理后的QBC939细胞PCNA,Survivin蛋白的表达明显减弱.结论:尼美舒利能抑制QBC939细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能与PCNA,Survivin蛋白的表达下调有关.     

VEGF-C反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株SKOV3侵袭转移能力的影响

[目的]探讨VEGF—C反义寡核苷酸（VEGF—CASODN）对人卵巢癌细胞SKOV3侵袭转移能力的影响。[方法]以VEGF—C基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸，脂质体介导转染。MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质Matrigel的黏附能力；体外侵袭实验检测卵巢癌细胞侵袭能力；Western blot检测细胞VEGF—C、MMP-2、E—cadherin蛋白表达。[结果]黏附实验结果显示VEGF—C ASODN转染后，在30min、60min、90min、120min各时间段与空白对照组、LIP组及SODN组相比，细胞黏附率都有明显下降（P〈0．01）：侵袭实验结果显示VEGF—CASODN转染48h后浸润细胞数目（62．5±8．71与空白对照组、LIF组和SODN组（分别为127.2±13．6、125．8±14．1、119．3±11．21相比明显减少（P〈0．01）；Western blot结果显示VEGF—C ASODN转染后细胞中VEGF—C、MMP-2蛋白表达与空白对照组、LIF组和SODN组相比明显下降，而E—cadherin蛋白表达明显增高（P〈0．01）。[结论]VEGF—C ASODN能明显抑制卵巢癌细胞体外实验中的侵袭转移能力，可望为卵巢癌提供一种有效的辅助治疗方法。     

CXCR4 抑制剂LPS 对胆管癌细胞株QBC939生物学行为的影响

目的:探讨人胆管癌细胞株QBC 939 中CXCR4 基因的表达,及LPS 对CXCR4 表达及生物学行为的影响。方法:RT-PCR 和Western blot法检测胆管癌细胞株QBC 939 中CXCR4 mRNA 及蛋白的表达,与不同浓度LPS 干预后CXCR4 mRNA 及蛋白表达的变化;MTT 法和平板克隆形成试验检测LPS 对QBC 939 细胞生长及克隆形成的抑制作用;趋化试验检测LPS 对QBC 939细胞趋化侵袭能力的影响。结果:QBC 939 细胞中有CXCR4 mRNA 及CXCR4 蛋白的表达明显,LPS 能有效的抑制QBC 939 细胞中CXCR4 mRNA 及CXCR4 蛋白的表达,且具有浓度相关性。不同浓度的LPS 对胆管癌细胞株QBC 939 的增殖影响不同,24h 内各浓度LPS 对细胞增殖均无明显抑制,LPS 浓度为0.1 μ g/mL 时,48h 内无明显影响,为1.0 μ g/mL、5.0 μ g/mL 时,QBC 939 细胞生长受到明显抑制,72h 各浓度LPS 对细胞增殖均有明显抑制作用;平板克隆形成试验显示对照组细胞培养第10天即可见明显克隆体形成,至第14天时克隆体数目多、体积大。而试验组细胞于培养第13天时才出现克隆体,且克隆体数目少、体积小。CXCL12（SDF-1）对QBC 939 细胞有明显的趋化作用,对照组细胞趋化率为53.5% ,LPS 各浓度组细胞趋化率明显低于对照组。结论:胆管癌细胞株QBC 939 中CXCR4 mRNA 及CXCR4 蛋白呈阳性表达;CXCR4 抑制剂LPS 能有效抑制胆管癌细胞株QBC 939 的生长与转移能力,CXCR4 可能成为胆管癌基因治疗的靶点之一。      

紫杉醇抗胆管癌细胞差异表达蛋白的分离、质谱鉴定及生物信息学分析

目的：筛选紫杉醇诱导胆管癌细胞凋亡的相关蛋白并鉴定差异表达的蛋白点以寻找抗胆管癌药物作用的新靶点,筛选胆管癌新的肿瘤标志物,为胆管癌的早期诊断、疗效观察提供基础理论依据。方法：应用比较蛋白质组学技术对紫杉醇诱导凋亡的胆管癌QBC939细胞进行蛋白分离和蛋白表达谱差异分析,筛选并鉴定其相关蛋白并测定其胶内酶解后的肽指纹图谱。结果：本研究发现对照组和实验组蛋白点匹配率分别为（90．1±0．14）％和（87．1±0．22）％（P〈0．05）,匹配后在干预组中共发现68个差异表达蛋白点,其中47个表达下调和21个上调;共获得28张PMF,初步质谱鉴定发现11个与凋亡相关的差异表达蛋白,其中6种蛋白表达上调,5种蛋白表达下调。结论：应用蛋白质组学技术分析所获得的68个差异蛋白质点可能在QBC939细胞发生凋亡过程中发挥重要作用;被鉴定出的11个与细胞凋亡相关的差异蛋白点提示紫杉醇是通过多个重要蛋白,发挥其诱导细胞凋亡的抗癌作用机制的。     

索拉非尼及PI3K、mTOR抑制剂对肝胆肿瘤细胞增殖及Ghrelin基因表达的影响

目的 探讨索拉非尼及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂对肝胆肿瘤细胞增殖及Ghrelin（GHRL）基因表达的影响。方法 收集体外常规培养的肝癌SMMC7721细胞和胆管癌QBC939细胞,经不同浓度（0、50、100、200 μmol/L）索拉非尼、LY294002（PI3K抑制剂）及Rapamycin（mTOR抑制剂）处理48 h后,采用MTS细胞活性检测试剂盒检测SMMC7721、QBC939细胞的增殖率,实时定量PCR（qPCR）检测SMMC7721、QBC939细胞中GHRL 基因的mRNA水平。结果与对照组相比,LY294002、索拉非尼和Rapamycin处理后的SMMC7721、QBC939细胞的增殖率均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,且随着药物浓度的增加,两种细胞的增殖率均降低（P＜0.05）。qPCR结果显示,经LY294002和索拉非尼处理48 h后的SMMC7721细胞中GHRL mRNA水平与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）;与对照组相比,随着Rapamycin作用浓度的升高,实验组SMMC7721细胞的GHRL mRNA水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;经LY294002、索拉非尼和Rapamycin处理的QBC939细胞中GHRL mRNA水平高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 三种药物均可以抑制肝癌和胆管癌细胞的增殖并促进QBC939细胞的GHRL表达,但仅Rapamycin能上调SMMC7721肝癌细胞的GHRL基因表达。GHRL基因表达与肝癌和胆管癌的发生可能有密切关系。     

阻断NF-κB信号通路对人肝门部胆管癌细胞QBC939增殖的影响

  目的  研究阻断NF-κB信号通路对人肝门部胆管癌细胞QBC939生长增殖的影响。  方法  常规培养QBC939细胞, 采用PDTC(100μmol/L)阻断NF-κB信号通路, Western blot检测核内P65蛋白水平的表达, CCK-8检测细胞生长增殖抑制率, 流式细胞仪观察细胞周期与凋亡的变化情况。  结果  经PDTC阻断NF-κB信号通路后, 与对照组相比, 细胞核内P65蛋白水平明显下降(P < 0.05)。CCK-8检测显示细胞增殖活性明显受到抑制, 并随时间的延长而愈渐明显, 12、24、36h后细胞增殖抑制率分别为(22.53±0.03)%、(46.54±0.03)%、(58.02±0.03)%, 与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。流式细胞仪检测发现实验组G₀/G₁期细胞比例高于对照组, 分别为(68.53±1.72)%、(38.3±1.35)%, 差异有统计学意义(P < 0.05);细胞凋亡率在实验组为(27.68±2.77)%, 对照组仅为(9.27±2.36)%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。  结论  阻断NF-κB信号通路诱导人肝门部胆管癌细胞G₀/G₁期阻滞及细胞凋亡, 从而抑制细胞生长与增殖, 提示NF-κB信号通路组成性激活参与人肝门部胆管癌的发生发展, 以NF-κB信号通路作为治疗的靶点可能给人肝门部胆管癌带来新的治疗选择。      

去甲斑蝥素对人类胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡作用的实验研究

 【摘要】　目的　研究去甲斑蝥素（NCTD）对人类胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用,初步探讨其作用机制。方法　将NCTD作用于经体外培养的QBC939细胞系,分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）,流式细胞术及免疫组织化学SP法进行检测。结果　0.125、0.75、2.5、10、120 μg／ml NCTD作用48 h,对QBC939细胞系均有抑制作用（P＜0.05）,且具有浓度依赖性,绘制浓度效应曲线,得出半数抑制浓度（IC50）为（3.66±1.14）μg／ml;在分别作用12、24、36、48、72 h后,生存率有随时间增加而下降的趋势（P＜0.05）。流式细胞术结果表明,随着NCTD浓度的增加,凋亡率逐渐增高,各浓度组分别为（8.6±0.4）%、（17.6±0.3）%、（22.9±0.4）%、（25.5±0.9）%、（31.1±1.5）%（P＜0.001）;质量浓度为2.5 μg／ml的NCTD作用QBC939细胞48 h后,出现G2／M期阻滞现象,NCTD与对照组分别为（14.1±1.0）%和（5.7±0.3）%（P＜0.05）。不同浓度的NCTD作用于QBC939细胞后,与对照组相比Caspase-3蛋白表达均增加。结论　NCTD具有抑制人类胆管癌细胞系QBC939增殖的作用,这种作用可能与诱导细胞凋亡,干扰细胞生长周期有关。     

索拉非尼对裸鼠胆管癌移植瘤淋巴管生成的影响

目的 探讨索拉非尼对胆管癌移植瘤淋巴管生成的影响.方法 对Bal B/c-nu裸鼠皮下接种胆管癌QBC939细胞,构建裸鼠移植瘤模型.成瘤后,随机将36只裸鼠分为对照组、索拉非尼30 mg·kg-1·d-1组和索拉非尼60 mg·kg-1·d-1组,每组12只,灌胃法连续给药6周,观察各组裸鼠移植瘤的生长情况.以淋巴管内皮透明质酸盐受体1(LYVE-1)标记肿瘤周边淋巴管,并计数微淋巴管密度(LMVD).以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肿瘤周边组织中血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR-3)mRNA的表达.结果 索拉非尼能显著抑制胆管癌移植瘤的生长,索拉非尼30 mg·kg-1·d-1组和60 mg·kg-1·d-1组的抑瘤率分别为55.1%和67.9%.对照组、索拉非尼30 mg·kg-1·d-1组和60 mg·kg-1·d-1组裸鼠移植瘤周边组织的LMVD分别为11.75±3.19、6.84±2.18和5.03±1.91.对照组的LMVD明显高于两个用药组(P＜0.01).对照组、索拉非尼30 mg·kg-1·d-1组和60 mg·kg-1·d-1组裸鼠移植瘤周边组织中VEGFR-3 mRNA的相对表达量分别为2.158±0.312、1.027±0.144和0.736±0.149,对照组中VEGFR-3 mRNA的相对表达量明显高于两个用药组(P＜0.05).各组裸鼠胆管癌区域引流淋巴结中均未观察到胆管癌转移灶.结论 索拉非尼能显著抑制胆管癌裸鼠移植瘤的生长.索拉非尼可能通过抑制胆管癌周边组织中VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3轴的表达,来降低LMVD.     

斑蝥提取物通过细胞周期G2/M期阻滞诱导人胆管细胞癌QBC939细胞凋亡

目的:研究斑蝥提取物(cantharis extract,CTE)体外诱导人胆管癌QBC939细胞凋亡作用及其对细胞周期分布的影响。方法:体外培养人胆管细胞癌QBC939细胞,CTE作用于QBC939细胞48小时,利用CCK-8法检测QBC939细胞增殖率并计算半数抑制浓度(IC50);光学显微镜下观察细胞形态的改变;AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡情况;用PI染色检测对QBC939细胞周期分布的影响;Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白及细胞周期相关蛋白表达变化。结果:CTE显著抑制QBC939细胞增殖,呈浓度及时间依赖性,处理48小时的IC50为4.16μg/ml。经光学显微镜下观察可见随着药物浓度增加,细胞密度减少,游离变圆的细胞明显增多。AnnexinⅤ/PI双染流式凋亡检测示,随着药物浓度的增加,凋亡细胞数量逐渐增加,药物处理组(1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml)的细胞凋亡率分别为(9.52±1.01)%、(15.62±1.88)%、(46.03±4.88)%,与对照组(4.59±0.43)%比较,差异有统计学意义(P<0.05)。PI检测细胞周期示,CTE能将QBC939细胞周期阻滞在G2/M期,随药物浓度增加而增加,G2/M期细胞比例逐渐增加,与对照组比较差异有统计学意义,而G1期细胞比例逐渐减少。Western blot检测示,CTE处理组细胞增殖相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)表达降低,相对蛋白表达量与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2家族蛋白Bax和Bid表达增加,而Bcl-2、Mcl-1表达降低,抑制凋亡蛋白家族蛋白Survivin表达显著下降,凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表达下降,与对照组比较CTE处理组上述相对蛋白表达量差异有统计学意义(P<0.05);CTE处理组细胞周期相关蛋白Chk1表达无显著改变,相对蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05),磷酸化的Chk1蛋白及p53蛋白表达逐渐增加,相对蛋白表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CTE显著抑制QBC939细胞增殖,诱导QBC939细胞凋亡,其可能机制与CTE调节凋亡相关蛋白表达,同时调节肿瘤细胞周期相关。