斑马鱼内毒素炎症模型建立及中药抗内毒素炎症研究

革兰阴性菌外膜结构成分脂多糖(LPS)即内毒素,是其主要致病因子,具有广泛而复杂的生物学效应,可直接或间接引起机体发热、代谢改变、免疫功能紊乱,多器官功能损害、休克乃至死亡等许多病理生理过程。这些效应主要是通过LPS与细胞表面的受体结合,激活细胞内信号转导系统,促进细胞因子及炎症介质的大量合成与释放,导致机体失控性炎症反应。在现代医学对由内毒素触发全身炎症反应综合征的治疗仍然一筹莫展的今天,不断有中药、复方或其所含成分被证明对受内毒素攻击的动物有保护作用,我们先期的研究结果亦证明中医经典复方凉膈散具有良好的抗内毒素炎症活性,从中药寻找抗内毒素治疗措施呈现良好的前景,抗内毒素中药活性筛选成为关注的热点。然而,对于中药或复方来说,由于成分复杂,影响因素众多,限制了细胞筛选体系和分子筛选体系的应用,特别是在以有效部位、提取物甚至水煎剂为研究对象时则更加困难。若用哺乳动物模型进行大规模筛选,则费时、费力、费物资,代价难以承受。利用斑马鱼模型来筛选药物已成为发现候选药物的主要技术。近年来,转基因、诱导突变和反义morpholino knockdown等技术的使用,结合活体成像技术,使斑马鱼成为研究人类炎症免疫疾病相关的病理生理学及在活体内进行高通量药物筛选的良好模式生物。近年在国家自然科学基金资助下,开展了斑马鱼内毒素炎症模型构建及基于该模型的中药抗内毒素炎症活性筛选研究。采用LPS卵黄囊注射诱导成功建立斑马鱼内毒素炎症模型。以LPS诱导的中性粒细胞及巨噬细胞的迁移聚集、斑马鱼死亡率和生存时间可作为评价抗内毒素炎症活性参考指标。利用斑马鱼内毒素炎症模型开展了凉膈散方提取物(不同极性提取部位)抗内毒素活性筛选,凉膈散方中单味中药提取物(不同极性提取部位)抗内毒素活性筛选及凉膈散方所含活性单体抗内毒素活性筛选。研究证明该模型用于中药抗内毒素活性评价是可行的。鉴于有效成分组方是创新中药研发的新形式、新方法,我们利用斑马鱼内毒素炎症模型开展了抗内毒素中药有效成分组方的配伍与配比研究,获得优化配方并申请专利保护。利用LPS诱导的马鱼内毒素炎症模型,建立适宜于不同层次(中药单体成分、单味中药及复方不同提取部位或组分)中药形式抗内毒素活性筛选方法,为抗内毒素中药筛选提供一个介于体外初筛与哺乳动物验证之间的快速、低成本和活体筛选新方法,具有良好的应用前景。     

斑马鱼炎症模型及其在中药抗炎领域的应用

中药抗炎在近年来已成为一个重要的研究领域,中药制剂的抗炎临床研究已经取得了一定进展,但具体活性成分及作用机制仍需进一步明确。斑马鱼由于其独特的生物学优势,目前已被广泛应用于中药抗炎活性的筛选。综合近年来国内外有关斑马鱼模型在中药抗炎领域的报道,从已构建的斑马鱼炎症模型、斑马鱼模型中的炎症介质、斑马鱼模型在中药抗炎药物筛选中的应用3个方面对斑马鱼炎症模型及其在中药抗炎领域的研究进展进行综述,以期为模式生物斑马鱼在中药抗炎领域的研究应用提供新思路,为抗炎中药的开发与利用提供借鉴参考。     

基于模式生物斑马鱼模型的中药药效物质筛选技术及应用

目的作为一个复杂成分体系,中药药效物质的精准辨识和筛选是中药现代化研究的一个瓶颈问题,探索新的实验技术十分重要。方法斑马鱼是新兴的模式生物,具有体外受精、胚胎透明,不需要解剖可方便在显微镜下观察组织器官的发育等生物学优势,可在细胞板中完成实验,需要样品量少,已被欧洲替代法验证中心推荐为新的替代动物。斑马鱼全基因组测序结果显示斑马鱼与人的基因组相似性达87%,大量的研究表明斑马鱼对药物反应与临床反应也高度相似,为斑马鱼应用于研究人类疾病与药物筛选奠定了理论和实践基础。本实验室利用斑马鱼模型构建了较为齐全的中药药效物质筛选的技术体系,并对甘草、阿胶、栀子、乳香等传统中药进行药效或毒性成分的筛选辨识研究。结果本实验室利用斑马鱼模型建立了可涵盖肿瘤、心血管、神经系统、骨骼、皮肤、重要器官等的活性/毒性筛选技术平台。从前期大规模的筛选中,发现甘草具有一定的抗肿瘤作用,进一步利用斑马鱼活性跟踪技术和高速逆流色谱分离技术,发现了2个未报道的抑制血管生成的活性成分。新阿胶是山东福胶集团的独家品种,是以猪皮为来源,作为阿胶的替代品,但是现代药理学数据缺乏导致市场认可度低,因此我们利用斑马鱼模型系统开展了新阿胶的化疗损伤后的"扶正"与"生血"的作用机制。中药栀子临床发现具有防治血栓的功效,但是抗血栓的药效标志物并不清楚,作者采用斑马鱼模型整合代谢组学技术,发现3个代表性的抗血栓成分。乳香在历代典籍中具有"孕妇慎服"记载,但是原因不明,我们利用斑马鱼模型构建发育毒性模型,并结合灰色关联度分析法,证明乳香具有一定的发育毒性,并发现了潜在的毒性靶器官,并发现了主要的毒性效应成分。结论斑马鱼作为一种新型的模式生物,在中药药效物质筛选、活性评价、毒性预警方面都具有广阔的应用前景。     

基于脂多糖诱导斑马鱼炎症模型研究何首乌多糖抗炎活性

目的 探究何首乌中水溶性多糖(water-extractedPolygonum multiflorum polysaccharides,WPMP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致斑马鱼系统性炎症的保护作用。方法 WPMP经分离纯化后得到2种组分(WPMP-1和WPMP-2),收集斑马鱼胚胎于28.5℃中培养箱中孵育,设置空白组、LPS诱导模型组,通过孵化率、心率、卵黄囊面积、活性氧生成率、NO生成率等指标确定LPS最佳诱导炎症浓度,确定炎症模型后,加入不同组分的WPMP,并以上述相同指标评价WPMP的抗炎效果。结果 不同浓度WPMP (10,50,100 μg·mL^-1)对LPS引起的斑马鱼炎症具有保护作用,呈现浓度依赖性,能够恢复卵黄囊正常大小,显著降低心率、活性氧生成率以及NO生成率,且在相同多糖浓度下,WPMP-2的抗炎活性高于WPMP-1。结论 PMP具有较好的抗炎作用,为WPMP作为一种天然的抗炎成分提供了科学依据。     

转基因斑马鱼模型应用于索拉非尼抗肝癌活性筛选的方法研究

目的 使用斑马鱼 (Danio rerio) 肝癌模型进行药物筛选,确定筛选方法和最适条件。方法 用不同浓度盐酸多西环素 (Dox) 处理转基因斑马鱼胚胎,诱导其肝脏异常增生,通过综合评价诱导效应与毒性效应,确定适合的诱导浓度;选择适宜的诱导浓度,对索拉非尼抑制肝部异常增生的能力进行评估。结果 确定了盐酸多西环素的最适诱导浓度为30~60mg/L,索拉非尼对斑马鱼模型的肝部异常增生有显著的抑制作用,同时也观察到药物的毒副作用。结论 该模型适用于索拉非尼及其类似物抗肝癌活性的评价与筛选,是评估化合物体内生物活性的快速筛选模型,同时也可以观测毒副作用,在其它抗肝癌药物及与Ras下游信号通路相关靶点的药物的筛选等方面具有广阔的应用前景。     

基于斑马鱼模型的中药来源化合物血管抑制活性筛选

目的 利用斑马鱼高通量模型,对10种中药来源化合物进行筛选。方法 选取受精后转基因血管荧光Fli-1品系斑马鱼对10个中药来源的化合物进行筛选,用不同的药物浓度分别作用于斑马鱼,观察对斑马鱼体血管的影响。以斑马鱼肠下血管面积为主要指标,斑马鱼肠下血管出芽数为次要指标进行定量分析,考察各化合物对斑马鱼血管生成的抑制作用。结果 木犀草素(87.34 μmol·L^–1)、洋川芎内酯A(52.02 μmol·L^–1)、盐酸小檗碱(537.91 μmol·L^–1)、和厚朴酚(9.39 μmol·L^–1)、齐墩果酸(10.95 μmol·L^–1)组斑马鱼肠下血管面积与正常对照组相比肠下血管面积显著减少(P<0.01或P<0.001);木犀草素、洋川芎内酯A、盐酸小檗碱、齐墩果酸、和厚朴酚对肠下血管面积的抑制作用分别为12%,17%,18%,15%,24%;各化合物与正常对照组相比斑马鱼肠下血管出芽数无显著性差异;阳性对照组(索拉非尼5 μmol·L^–1)斑马鱼肠下血管面积与正常对照组比较显著性减少(P<0.05),其对血管新生的抑制作用为22%,肠下血管出芽数与正常对照组相比显著性减少(P<0.05)。结论 木犀草素、洋川芎内酯A、盐酸小檗碱、齐墩果酸、和厚朴酚具有抑制血管新生作用。     

以Lipid A为靶点拮抗内毒素中药的筛选

目的利用生物传感器跟踪技术从抗炎中药中筛选出具有拮抗内毒素的中药,为进一步对中药拮抗内毒素活性成分的分离纯化提供实验依据。方法将革兰阴性细菌的脂质A(Lipid A)包被于生物传感器的非衍生板建立靶点,跟踪测定赤芍、大黄、黄芩等78种中药的水提物和醇提物与Lipid A的结合活性,再将筛选出的中药去鞣质后与定量的内毒素(LPS,20、50ng·ml-1)37℃孵育30min后,测定孵育后的样品与Lipid A的结合情况,以评价样品内的活性物质含量。结果在所筛选的78种中药中有12种中药的水提物与Lipid A具有较高的亲和活性,在这12种中药中有6种中药的醇提物与Lipid A也具有较高的亲和活性;通过对所筛选出的12种中药的水提物去除鞣质后与LPS的消耗实验,发现所筛选出的12种中药均含有除鞣质以外的与lipid A具有特异性结合的物质,并且12种中药中能与Lipid A发生特异性结合作用的活性物质含量存在较大的差异。结论生物传感器跟踪技术是一种快速、准确、有效的筛选平台,筛选出的12种中药均含有非鞣质类能与lipid A发生特异性结合作用的物质,为进一步对12种中药抗内毒素有效部位或单体的分离提供了重要的实验依据。     

单味中药及活性成分体外抗内毒素实验研究

目的：研究单味中药及活性成分抗内毒素作用。方法：采用鲎试剂试管凝集反应进行体外抗内毒素的实验研究。结果：所研究单味中药及活性成分均有不同程度的抗鲎试剂试管凝集反应现象。结论：所研究单味中药及活性成分对细菌内毒素有直接的破坏降解作用。     

板蓝根抗内毒素活性化学成分的筛选

目的:对从板蓝根中分离到的31种化合物做抗内毒素活性筛选.方法:将31种化合物分别制成1 mg&#8226;mL 1的无菌水溶液,按《中华人民共和国药典》细菌内毒素检查法检查,再将有活性的化合物溶液分别与可使家兔产生典型发热反应的内毒素温育后,按《中华人民共和国药典》热原检查法做体内实验.结果:6种化合物有体外抗内毒素作用,其中1种化合物有半体内抗内毒素活性.结论:从已分离到的板蓝根化学成分中可筛选出抗内毒素活性化合物.     

抗菌药物诱导内毒素释放及抗内毒素药物研究进展

不同种类抗菌药物诱导内毒素释放情形不同。主要作用于青霉素结合蛋白(PBP)的抗菌药物有β 内酰胺类，可杀灭菌体而释放大量内毒素(LPS)，而非作用于PBP的抗菌药物有氨基苷类、喹诺酮类、大环内酯类，使细菌释放内毒素较少。在保证有效杀菌的前提下，选择致内毒素释放较少的抗菌药物，并合用抗内毒素药物对减轻机体损伤及预防多脏器功能衰竭的发生可能有益。     

中药化学成分抗内毒素研究现状

目的：综述中药化学成分抗内毒素研究现状。方法：用文献查阅法，对有抗内毒素作用的中药化学成分的来源、抗内毒素研究方法、实验结果及结论等分别介绍。结果：绞股蓝总皂苷等9个中药化学成分分别从降低内毒素致实验动物死亡率；逆转内毒素引起的心血管功能紊乱，低血压弥散性血管内凝血(DIC)及血尿素氮和血浆肌酐升高；抑制肿瘤坏死因子(TNFα)、一氧化氮(NO)、血小板活性因子(PAF)及乳过氧化物酶(LPO)等的合成和过度释放等多种途径发挥其抗内毒素活性。结论：绞股蓝总皂苷等中药化学成分有抗内毒素作用，对抗内毒素系列中药研究开发有指导作用。     

中药活性成分抗耐药肿瘤细胞体外筛选研究

我们以两种耐药机制不同的多药耐药瘤株ＭＣＦ－７／ＡＤＲ和ＨＬ６０／ＡＤＲ为研究对象，对多种中药皂甙，大黄蒽醌和部分生物碱等成分进行了细胞杀伤实验和耐药逆转研究。结果表明，常规剂量下，皂甙体外对耐药和敏感细胞均没有杀伤作用，其中大多数不具备耐药逆转活性，少部分具有很低的耐药逆转活性；大黄蒽醌类对耐药和敏感细胞均有很强的杀伤作用，而且对耐药细胞的杀伤作用似乎更强，但也不具备逆转耐药活性；生物碱类普遍以     

板蓝根抗内毒素活性物质筛选

目的从板蓝根氯仿提取部位(F02)4个不同极性组分(F021、F022、F023和F024)中筛选出抗内毒素活性最强的部位.方法用板蓝根不同组分对内毒素致小鼠死亡保护作用及对内毒素致鼠巨噬细胞分泌炎性因子肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素-6(IL-6)的影响作比较研究.结果 F02、F021、F022、F023和F024组对2.42 mg·kg-1内毒素致小鼠死亡有保护作用,死亡率分别为30%、50%、20%、50%和60%.对内毒素刺激鼠巨噬细胞分泌TNFα和IL-6有抑制作用,LPS浓度为50 ng·mL-1时,抑制率TNFα分别为76.54%、30.86%、78.60%、36.63%、2.06%,IL-6分别为75.85%、18.45%、77.68%、21.41%、3.64%;LPS浓度为100 ng·mL-1时抑制率TNTα分别为49.65%、16.86%、66.97%、13.39%、7.16%,IL-6分别为59.78%、1.28%、61.86%、2.08%、1.44%.结论板蓝根氯仿提取部位第F022组分抗内毒素活性最强,该部位为板蓝根抗内毒素活性物质.     

斑马鱼模型在中枢神经系统疾病中的研究进展

中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）疾病严重损伤人的身心健康,在全球范围内造成巨大的疾病负担,且患病人数逐年呈增长趋势。由于CNS疾病的复杂性、多因素性及多基因调控性,导致相关疾病的发病机制尚不明确,市场上也严重缺乏针对该类疾病的有效药物。因此,探索CNS疾病的病理机制对药物的开发十分重要,急需一种模式生物来构建CNS疾病模型。斑马鱼（Danio rerio）作为一种重要的模式生物,不仅具有与人类高度保守的大脑组织区域,且具有丰富的社会学行为,成为研究CNS疾病和药物研发的重要工具。本文综述了近年来斑马鱼在CNS疾病研究中的相关研究进展,同时也介绍了一些小分子化合物在斑马鱼疾病模型中的研究应用,为今后CNS疾病的研究和相关药物的研发提供了基础。     

中药赤芍抗内毒素活性的实验观察

目的：通过提取中药赤芍中抗内毒素（LPS）活性的有效成分,进行药理学观察,探讨赤芍抗内毒素活性的内在机制。方法：将常规中药化学分离技术与生物传感器相结合,分离赤芍抗LPS的有效成分,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和鲎试验法检测该有效成分对LPS的中和作用。结果：赤芍中抗LPS的有效成分具有较强的中和LPS的活性．该有效成分能够在体外实验中显著抑制由LPS介导的培养细胞系释放TNF-α。结论：中药赤芍中存在高活性的抗LPS有效成分．该成分可以LPS为靶点,应用常规中药化学分离技术与生物传感器相结合的方法进行快速、有效地提取分离。     

几种中药化学成分抗内毒素研究现状

目的：探讨粉防已碱等中药化学成分抗内毒素研究现状。方法：用文献检索法检索中文期刊中已报道有抗内毒素作用的中药化学成分，并对其抗内毒素作用的研究方法，研究成果作介绍。结果；粉防已碱等中药化学成分通过抑制内毒素刺激机体释放炎性因子TNFα、IL－8、NO、PAF，抑制TXA2合成，保护内皮细胞，减少内毒素致小鼠死亡率，降低内毒素致兔发热反应温度，缓解休克期肺血管收缩、改善肺循环灌注状态，破坏内毒素化学结构等多种途径拮抗内毒素。结论：粉防已碱等中药化学成分有抗内毒素作用，可作为含该类化学成分抗内毒素中药的质控制指标成分。     

用CD40高表达细胞膜色谱模型筛选抗动脉粥样硬化中药的活性成分

目的：细胞膜色谱（Cell Membrane Chromatograph。CMC）技术是一种研究药物与靶体（包括受体）相互作用的亲和色谱分析技术。它是将活性细胞膜固定在特定载体表面,制备成细胞膜固定相（CMSP）,用液相色谱的方法研究药物或化合物与固定相上细胞膜及膜受体的相互作用。所以特别适用于中药药物有效部位及活性成分的筛选。但是CMC法使用的自然生物膜中存在多种活性蛋白,化合物可能与多种受体或通道蛋白结合,所以缺乏特异性、靶向性。而CD40-CD40L是As疾病相关基因,阻断CD40-CD40L炎症信号通路为抗As药物作用靶点,因此建立CD40高表达的CMC模型,其方法更具有应用价值。我们建立了CD40高表达细胞膜色谱模型,对经典抗As中药丹参进行特异性、靶向性筛选,以期发现其活性抗动脉粥样硬化成分。从而为中药筛选提供了方法和途径,为中药现代化提供了新思路。方法：构建CD40高表达的内皮细胞（ECV-304）,制备细胞膜固定相,应用CD40高表达的内皮细胞膜色谱模型筛选丹参中抗动脉粥样硬化的有效成分。     

模式生物斑马鱼在中药研究中的应用

斑马鱼作为一种新的模式动物,已经在生物医学的诸多研究领域得到了广泛的应用。近年来,基于斑马鱼的中药相关研究越来越多。本文重点综述了斑马鱼应用于中药药理、毒理研究方面的成果和前景。     

抗菌药物诱导内毒素的产生及抗内毒素药物的研究进展

内毒素是革兰阴性菌的主要致病成分,抗菌药物在杀/抑菌的同时会诱导内毒素的产生,增加了疾病的治疗难度。体外实验、动物实验证实,抗菌药物诱导内毒素的产生与多种因素有关,提示在临床选用抗菌药物时应对药敏实验结果及其诱导内毒素释放的特性进行综合考虑。抗内毒素药物的研究近年取得了一些成效,其中中药制剂也显示了很好的抗内毒素作用,相信这类药物会有广阔的发展前景。     

抗内毒素多肽对内毒素休克模型家兔的治疗作用

目的:研究杀菌性/通透性增加蛋白模拟肽(BNEP)对内毒素休克家兔重要器官功能的影响。方法:家兔在静脉注射内毒素(LPS)500μg·kg-1后,立即注射BNEP5mg·kg-1,测定、分析不同时相点平均动脉压(MABP)、脉压差、血浆LPS、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)的变化,观察8h死亡率。结果:BNEP组MABP下降速率减慢,并均在攻毒6h后恢复到攻毒前的80%以上。而LPS对照组平均动脉压、脉压差在攻毒后维持在低水平。BNEP组攻毒后各时相点血浆LPS浓度均显著低于单纯攻毒组,脉压差在2、4、6h时相点、CK-MB在4、6h时相点、Cr在6h时相点显著低于LPS组,且8h死亡率显著低于单纯攻毒组。但两组间ALT差别不显著。结论:BNEP具有较强的中和LPS能力,对内毒素休克家兔心血管系统、肾功能改善和恢复具有一定的效果。作为严重感染的辅助治疗手段可能具备较好的应用前景。