自噬在氧糖剥夺诱导星形胶质细胞损伤中的作用机制

目的 探讨自噬在氧糖剥夺(OGD)诱导星形胶质细胞损伤中的作用机制。方法 培养大鼠原代星形胶质细胞,分为对照组和OGD组。OGD组体外建立OGD损伤模型,OGD作用0.5、1、3、6和12 h,采用免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞纯度,Western blot法检测微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)蛋白表达。另设OGD+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,予自噬抑制剂3-MA 10 mmol/L,OGD作用3 h。免疫荧光检测细胞中LC3蛋白表达,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤程度。结果 原代星形胶质细胞纯度可达95%以上。与对照组比较,OGD作用1、3 h时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,且作用3 h时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值更高(P<0.01)。OGD组可见较多LC3绿色荧光散在分布于细胞质内,OGD+3-MA组细胞质内LC3荧光强度减弱。OGD组LDH漏出率高于对照组(P<0.01),OGD+3-MA组LDH漏出率低于OGD组(P<0.05)。结论 自噬参与并促进OGD诱导星形胶质细胞损伤。     

新型P2Y样G蛋白偶联受体GPR17在脑缺血损伤中的作用

目的探讨新型P2Y样G蛋白偶联受体GPR17对脑缺血及缺氧缺糖(OGD)诱导皮层混合培养细胞中神经元损伤及小胶质细胞激活的影响。方法①以线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型,采用免疫组织化学、Western blotting、RT-PCR以及免疫荧光等方法观察脑内GPR17的时空表达及细胞分布特点。大鼠侧脑室埋管给予GPR17 siRNA靶向沉默脑内GPR17表达,观察其对脑缺血急、慢性期神经元损伤和小胶质细胞激活的影响。②以OGD诱导大鼠皮层混合培养细胞的缺血性损伤,以GPR17 siRNA靶向沉默GPR17的表达,观察其对OGD诱导的原代皮层混合培养细胞中神经元损伤和小胶质细胞激活的影响。结果①缺血中心区,GPR17 mRNA及蛋白水平在再灌注24 h和7,14 d表达上调;缺血周边区,再灌注7,14 d表达上调。在正常大鼠脑组织,GPR17主要表达于神经元、少突胶质细胞。在缺血中心区,再灌注24 h GPR17主要表达于损伤的神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞,再灌注14 d主要表达于增生激活的小胶质细胞,部分表达于少突胶质细胞;而在缺血周边区,再灌注24 h以及14 d,GPR17主要表达于神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。星形胶质细胞不表达GPR17。大鼠侧脑室给予GPR17 siRNA成功抑制脑内GPR17表达,显著改善再灌注24 h神经症状、减少脑梗死体积以及神经元损伤;同样,也改善再灌注14 d的脑萎缩和周边区的神经元损伤,并显著抑制小胶质细胞的增生激活。②大鼠原代皮层混合培养细胞中,OGD 1 h恢复24 h(OGD/R)诱导细胞活性降低,LDH释放增加,PI染色结果显示细胞坏死增加,以神经元死亡为主。GPR17 siRNA处理后减轻OGD/R诱导的细胞活性下降以及LDH释放,并减轻细胞坏死,以减轻神经元死亡为主;GPR17siRNA处理后能够改善小胶质细胞激活的形态变化。结论大鼠局灶性脑缺血后,脑内GPR17表达上调,介导缺血后急性神经元损伤以及亚急性/慢性期的小胶质细胞激活。GPR17还介导OGD诱导的大鼠皮层混合培养细胞中的神经元损伤和小胶质细胞激活。     

半胱氨酰白三烯受体2通过介导小胶质细胞激活诱导缺血性神经元损伤

目的探索半胱氨酰白三烯(CysLT)受体在大鼠皮层神经元缺氧缺糖损伤中的调节作用及作用机制。方法培养大鼠原代皮层神经元或大鼠原代皮层混合培养细胞,以缺糖缺氧(OGD)模拟脑缺血损伤,以MTT还原法/LDH释放检测确定神经元存活/损伤,以免疫组化做神经元(抗MAP2)、星形胶质细胞(抗GFAP)、小胶质细胞(抗Iba1)特异性染色,观察各细胞数量变化,以PI/Hoechst染色确定细胞凋亡/坏死。以受体激动剂LTD4,NMLTC4,CysLT1拮抗剂孟鲁司特、CysLT2拮抗剂HAMI3379/CysLT1-siRNA及CysLT2-shRNA为药理学干预/基因干扰工具。结果 LTD4(0.1～1000 nmol·L-1),NMLTC4(0.1～1000 nnmol·L-1)不能诱导单纯神经元损伤;CysLT1-siRNA及CysLT2-shRNA不能减轻OGD诱导的神经元损伤;LTD4(1～1000 nnmol·L-1),NMLTC4(0.1～1000 nnmol·L-1)能诱导皮层混合细胞损伤;HAMI3379(0.001～1μmol·L-1)和CysLT2-shRNA能减轻OGD,LTD4或NMLTC4诱导的皮层混合细胞损伤及其诱导的小胶质细胞激活,CysLT1-siRNA无此作用。结论 CysLT2受体可能参与OGD诱导神经元损伤的调节,CysLT2拮抗剂可通过减轻小胶质细胞激活而减轻OGD诱导的神经元损伤。     

苦参碱对缺血性脑中风小鼠神经元及星形胶质细胞的保护作用

目的：观察苦参碱（Matrine）对缺血性脑中风小鼠的神经保护作用及对缺氧缺糖诱导的神经元和星形胶质细胞损伤的减轻作用,并初步探讨可能的作用机制。方法：采用原代培养小鼠大脑皮层神经元及星形胶质细胞缺氧缺糖模型（Oxy-gen and glucose deprivation,OGD）,MTT法和测定乳酸脱氢酶（LDH）观察Matrine对OGD神经元及星形胶质细胞的损伤是否有减轻作用;建立小鼠永久性大脑中动脉阻塞（Permanent mid-dle cerebral artery occlusion,pMCAO）模型,观察Matrine 10min、1h、3h及6h四个不同时间点给药后,脑梗死面积和神经症状的改善情况及其分子机制是否与抑制神经元及星形胶质细胞NF-κB信号通路有关。结果：经OGD诱导后,原代培养小鼠大脑皮层神经元及星形胶质细胞活力明显下降,与OGD模型组比较,给予Matrine（50μmol/L）干预后,神经元及星形胶质细胞的存活率明显提高（P〈0.01）;与此同时,OGD可使小鼠大脑皮层星形胶质细胞LDH漏出量增高（P〈0.01）,Matrine（50μmol/L）与模型组比较,LDH漏出量明显降低（P〈0.01）;Matrine（37.5mg/kg）10min、1h两个给药时间点的脑梗死面积与模型组比较明显减少（P〈0.01）;与模型组比较,Martine 10min、1h两个给药时间点术后24h的神经症状评分明显降低（P〈0.01）;Matrine可降低pMCAO缺血区IκBα与IKK蛋白的表达水平（P〈0.01,P〈0.05）,同时降低细胞核NF-κB蛋白的表达（P〈0.01）。结论：Matrine可通过直接保护神经元及星形胶质细胞改善缺血性脑中风症状,其作用时间窗可能在发病1h以内,Matrine保护作用可能与NF-κB信号通路有关。     

星形胶质细胞多巴胺D2受体通过β-arrestin 2偏爱型通路调控神经炎症

目的帕金森病(Parkinson disease,PD)的主要病理特征为黑质致密部多巴胺(DA)能神经元进行性丢失,并伴有α-突触核蛋白(α-syn)沉积和神经炎症反应。前期研究发现星形胶质细胞多巴胺D_2受体(D_2R)具有抑制神经炎症作用,近年来又发现D_2R可以通过激活接头蛋白β-arrestin2(arrb2)相关的,而非cAMP依赖的非经典通路调控细胞功能。因此,揭示D_2R对α-syn诱导的神经炎症的影响并阐明arrb2在星形胶质细胞D_2R抗炎效应中的作用,具有重要的科学意义。结果本课题应用Drd2敲除(Drd2~(-/-))、arrb2敲除(arrb2~(-/-))和突变型α-syn转基因(A53T~(tg/tg))小鼠,研究发现不同D_2R激动剂(Quinpirole,Quinelorane,Bromocriptine)均可浓度依赖性地抑制LPS+ATP,LPS+MSU,LPS+Nigericin等方式诱导的星形胶质细胞NLRP3炎症小体激活,但对α-syn诱导的炎症无效。进一步研究发现D_2R激动剂促进arrb2与NLRP3分子直接结合,减少ASC与NLRP3的结合,抑制NLRP3炎症小体激活;Arrb2敲除则取消了D_2R激动剂抑制NLRP3炎症小体活化和保护DA神经元的作用。α-Syn通过干扰星形胶质细胞arrb2与炎性分子的相互作用,从而取消了D_2R激动剂的抑炎效应。结论上述结果从全新的角度阐明了α-syn干扰β-arrestin 2分子的抑炎功能、阻断D_2R激动剂的作用通路,为诠释晚期PD患者应用D_2R激动剂无效提供了直接的理论依据。此外,本研究揭示了选择性激活arrb2偏爱的信号转导在PD抗炎治疗和神经保护中的重要意义,为PD临床治疗学的突破提供了新的思路。     

星形胶质细胞Drd2受体通过β-arrestin2抑制NLRP3炎症小体活化

帕金森病(PD)的主要病理特征为黑质致密部多巴胺(DA)能神经元进行性丢失,并伴有α-突触核蛋白(α-syn)沉积和神经炎症。前期研究发现,星形胶质细胞多巴胺D_2受体(D_2R)具有抑制神经炎症作用,近年来又发现D_2R可以通过激活接头蛋白β-arrestin2(arrb2)相关而非cAMP依赖的非经典通路调控细胞功能。因此,揭示D_2R对α-syn诱导的神经炎症的影响及其arrb2在星形胶质细胞D_2R抗炎效应中的作用具有重要的科学意义。应用Drd2敲除(Drd2~(-/-))、arrb2敲除(arrb2b2~(-/-))和突变型α-syn转基因(A53Ttg/tg)小鼠的研究发现,不同D_2R激动剂(quinpirole,quinelorane,bromocriptine)均可浓度依赖性地抑制LPS+ATP,LPS+MSU和LPS+Nigericin等方式诱导的星形胶质细胞NLRP3炎症小体的激活,但对α-syn诱导的炎症则无效。进一步研究发现,D_2R激动剂促进arrb2与NLRP3分子直接结合,减少ASC与NLRP3的结合,进而抑制NLRP3炎症小体激活;arrb2敲除则取消了D_2R激动剂抑制NLRP3炎症小体活化和保护DA神经元的作用。研究表明,α-Syn通过干扰星形胶质细胞arrb2与炎性分子的相互作用,从而取消了D_2R激动剂的抑炎效应。上述结果从全新的角度阐明了α-syn干扰β-arrestin 2分子的抑炎功能、阻断D_2R激动剂的作用通路,为诠释晚期PD患者应用D_2R激动剂无效提供了直接的理论依据。此外,本研究揭示了选择性激活arrb2偏爱的信号转导在PD抗炎治疗和神经保护中的重要意义,为PD临床治疗学的突破提供了新的思路。     

半胱氨酰白三烯受体拮抗剂对脑缺血的保护作用

炎症是影响脑缺血急性损伤严重程度以及慢性期恢复的主要因素之一,而半胱氨酰白三烯是体内最重要的炎症介质之一,通过半胱氨酰白三烯受体(CysLT1R和CysLT2R)调节脑缺血后炎症等病变。目前,已证实CysLT1R拮抗剂对脑缺血动物模型急性和亚急性/慢性损伤的保护作用,其神经元保护作用可能是间接通过调节胶质细胞,对星形胶质细胞增殖及胶质疤痕形成则有明确的抑制作用。CysLT2R拮抗剂还有待深入研究,但可能与神经元和星形胶质细胞损伤、小胶质细胞激活等有密切关系。CysLT1R和Cys-LT2R拮抗剂是抗脑缺血损伤潜在的新型治疗药物。     

CircRNA4736通过“海绵状”吸附miR-206调控Seipin介导的线粒体自噬在缺血性脑卒中再灌注损伤的分子机制

目的缺血性脑卒中神经元损伤主要有2种形式:迟发性神经元坏死和凋亡。线粒体损伤和功能紊乱是脑缺血再灌注中导致神经元死亡的重要因素。因此,清除损伤的线粒体并避免对神经元造成更严重危害是缺血性脑卒中溶栓治疗后的再灌注损伤神经细胞保护的重要策略之一。内质网蛋白Seipin介导的线粒体自噬能够清除受损线粒体,但机制不清。本研究旨在探索circRNA4736是否竞争性吸附miR-206,解除miR-206对Seipin的抑制作用,从而上调Seipin蛋白的表达,促进Seipin介导的线粒体自噬,最终抑制神经元凋亡。方法通过RNA-seq检测PC12细胞正常组与OGD/R处理组中差异表达circRNA和miRNA的筛选及验证;构建circRNA4736和Seipin敲除、脑缺血再灌注的动物和细胞模型;检测目标circRNA4736、miR-206与靶基因Seipin内源性表达水平及其相关性;分析miR-206沉默对氧糖剥夺PC12细胞的影响;在PC12细胞中分析过表达circRNA4736通过充当"分子海绵"吸附miR-206,从而抑制miR-206对Seipin的阻碍作用;分析外源性circRNA4736对缺血再灌注损伤的神经细胞的保护作用。结果在Seipin-KO小鼠的MCAO模型发现,线粒体自噬水平较野生型小鼠MCAO模型显著降低;在Seipin敲低的PC12细胞经OGD/R处理后,线粒体自噬水平较野生型PC12细胞显著下降;PC12细胞Seipin缺失导致Akt-m TOR信号活性增加;通过全转录组测序分析获得了差异表达倍数最高的circRNA4736;同时我们发现,miR-206表达水平与circRNA4736呈负相关;双荧光素酶报告基因检测发现miR-206与circRNA4736和Seipin之间均具有相互结合位点,并且过表达circRNA4736或下调miR-206能够恢复Seipin表达及其介导的线粒体自噬;在PC12细胞的OGD/R模型中抑制miR-206水平,Seipin蛋白的表达得到回复,细胞纯化线粒体蛋白中P62和BNIP3的表达及Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著上调,即线粒体自噬增强;过表达circRNA4736能够有效促进OGD/R模型的PC12细胞Seipin的表达上调及显著抑制PC12细胞凋亡。结论 Seipin及其介导的线粒体自噬可能作为缺血性脑卒中溶栓治疗后导致的缺血再灌注损伤的潜在研究靶点,外源性circRNA4736通过"海绵状"竞争性结合miR-206,解除miR206对Seipin的3'UTR区的抑制作用,从而重新激活Seipin蛋白生物学功能,进而促进Seipin介导的线粒体自噬,最终抑制神经元的凋亡。     

京尼平苷对LPS诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应的抑制作用

目的明确京尼平苷对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应的抑制作用。方法以LPS诱导原代培养的星形胶质细胞为细胞模型,随机分为对照组、LPS组、LPS+白藜芦醇组和LPS+不同浓度京尼平苷组,采用Western Blot法检测星形胶质细胞活化标记物GFAP水平及NF-κB p65水平,ELISA法检测致炎细胞因子水平。结果京尼平苷可显著抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化,降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,同时NF-κB p65蛋白的表达也明显降低。结论京尼平苷能通过NF-κB途径抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化,并抑制致炎细胞因子水平。     

急性脑缺血/再灌注后细胞病理改变及星形胶质细胞活化规律

目的 观察脑缺血/再灌注后不同时间点细胞病理改变及星形胶质细胞活化的规律。方法 本实验共采用85只SD雄性SPF级大鼠,将其随机分为假手术组、大脑中动脉闭塞90 min再灌注不同时间点组,后者分为再灌注3、6、12、24、48 h组。HE染色观察细胞病理改变,采用透射电镜观察脑缺血/再灌注后星形胶质细胞的亚显微结构,免疫印迹联免疫荧光法检测脑缺血/再灌注损伤后的GFAP表达。结果 脑缺血/再灌注后不同时间点可导致神经细胞发生不同程度的缺血/再灌注损伤,再灌注后24 h细胞损伤最为严重。透射电镜结果提示星形胶质细胞亚显微结构发生改变,细胞出现不同程度肿胀,线粒体嵴断裂等。脑缺血/再灌注后在缺血区GFAP表达呈时间依赖性逐渐升高,再灌注48 h后表达最高,而在梗死区表达逐渐减少。结论 脑缺血/再灌注后24 h神经细胞损伤最重,缺血半暗带区的星形胶质细胞形态发生变化,星形胶质细胞激活,伴随再灌注的推移,梗死区、缺血区边界逐渐清晰,可能出现胶质瘢痕。     

脑缺血后活化星形胶质细胞所致损伤因子的探讨

脑缺血损伤时,活化星形胶质细胞产生一系列细胞因子,其中一氧化氮、内皮素、磷脂酶A2、肿瘤坏死因子等通过各种机制对缺血后神经细胞产生毒性作用,引起神经细胞坏死、凋亡。深入了解活化星形胶质细胞对缺血性神经细胞损伤的作用机制,对脑缺血的治疗具有重要意义。     

星形胶质细胞在脑缺血中的变化和作用

星形胶质细胞作为中枢神经系统数量最多的细胞,它在脑缺血中发生增殖、肥大,特异性标记物胶原纤维酸性蛋白和波形蛋白表达明显增加。星形胶质细胞在缺血状态下具有较强的耐受力,可通过多种途径保护神经元。并且它也通过产生兴奋性氨基酸、炎症介质,降低缝隙连接等损伤神经元。因此,星形胶质细胞在脑缺血中起着损伤和保护脑组织的双重作用。明确星形胶质细胞在脑缺血中的作用及其机制,可能将为脑缺血的治疗提供新的靶点。     

Gadd45g基因对垂体瘤AtT-20细胞的增殖、凋亡和自噬的影响

目的 探讨生长阻滞及DNA损伤诱导基因45g(Gadd45g)过表达及靶向沉默对垂体瘤AtT-20细胞及小鼠原代星型胶质细胞的增殖、凋亡及自噬等影响.方法 构建 Gadd45g 基因的CDS区序列克隆至真核表达质粒 p3XFLAG-Gadd45g及其shRNA真核表达质粒pLKO .1-sh-Gadd45g ,将p3XFLAG-Gadd45g转染至小鼠垂体瘤AtT-20细胞中.其shRNA真核表达质粒pLKO .1-puro-sh-Gadd45g进行慢病毒包装,病毒感染小鼠星形胶质细胞;Western blot检测FLAG-Gadd45g融合蛋白的表达及RT-PCR检测shRNA沉默效率,CCK-8检测细胞增殖活力 ,Western blot检测其对凋亡蛋白、自噬蛋白的影响.结果 Gadd45g及其特异性shRNA真核表达质粒构建成功.构建的p3XFLAG-Gadd45g质粒在垂体瘤AtT-20细胞中能够表达;Gadd45g shRNA具有沉默效率.在垂体瘤AtT-20细胞中过表达Gadd45g ,可明显抑制细胞增殖 ,并能诱导Caspase-3表达,降低Beclin 1表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值(P＜0 .05).与之相反,在原代培养的星形胶质细胞中,shRNA干扰Gadd45g表达,可促进细胞增殖,并降低Caspase-3表达,而增加Beclin 1表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值(P＜0 .05).结论 垂体瘤中Gadd45g的表达缺失可能使得垂体瘤A t T-20细胞凋亡受阻及自噬作用增强 ,从而促进垂体瘤的发生、发展.恢复垂体瘤细胞中Gadd45g的表达及抑制垂体瘤细胞自噬作用有望成为垂体瘤治疗的新方法.     

PPARγ激动剂干预对激活星形胶质细胞Jagged1的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂吡格列酮干预对激活星形胶质细胞产生Jagged1的影响。方法采用脂多糖(LPS)刺激纯化的星形胶质细胞,将不同梯度浓度吡格列酮(0.01,0.1,1.0,10.0μm)和转化生长因子β1(10 ng/ml)共刺激星形胶质细胞6 h,提取细胞RNA。结果吡格列酮呈浓度依存性抑制LPS激活星形胶质细胞中Jagged1的mRNA表达(P<0.05)。结论吡格列酮抑制星形胶质细胞Jagged1的产生,Jagged1/Notch通路的激活可能随之减弱,有利于多发性硬化的髓鞘修复。     

西罗莫司抗缺血性脑卒中的自噬机制

目的观察神经元氧糖剥夺(OGD)后自噬的动态变化,并探讨西罗莫司对缺血性脑卒中的保护作用及自噬机制。方法利用OGD神经元,观察神经元氧糖剥夺后不同时间点自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和β-arrestin的变化,并观察10-6 mol·L-1西罗莫司对正常对照或OGD 6h后神经元LC3-Ⅱ的影响及抗凋亡作用。30只小鼠随机分为模型组、西罗莫司1μg·kg-1组和10μg·kg-1组(均n=10),观察西罗莫司对大脑中动脉阻塞(MCAO)模型小鼠半暗带脑组织LC3-Ⅱ和脑梗死面积的影响。结果神经元OGD 2 h后,自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和β-arrestin表达均减少,随OGD时间延长,LC3-Ⅱ和Beclin-1表达呈明显下降趋势(P<0.01);西罗莫司能促进神经元OGD 6h后LC3-Ⅱ的表达,并明显减少神经元的凋亡(P<0.01)。MCAO小鼠脑缺血6 h后,西罗莫司10μg·kg-1组梗死面积百分比(37.8±6.3)%显著小于模型组的(48.0±6.7)%(P<0.05)。结论西罗莫司对缺血性脑卒中有保护作用,其机制可能与促进自噬有关。     

痘苗病毒致炎兔皮提取物治疗缺血性脑卒中的机制

目的缺血性脑卒中(IS)是世界范围内重大的脑血管疾病,具有发病率和致残致死率高的特点,目前尚缺乏治疗或延缓脑缺血损伤的有效方法,发病机制涉及氧化应激、炎症细胞因子损害和自噬等。其中炎症细胞因子损害在缺血性脑损伤病理过程中起重要作用。小胶质细胞是脑内炎性反应的主要执行者,脑缺血后小胶质细胞被激活,形状由分枝状变成阿米巴状,其一方面发挥脑内吞噬细胞的作用,以及释放和分泌一系列免疫应答分子、细胞因子、神经毒性物质等产生细胞毒性效应;另一方面有利于神经元再生和死亡周边区神经元的存活,所以小胶质细胞具有神经毒性和神经保护双向作用。痘苗病毒致炎兔皮提取物(AGC)是从牛痘病毒致炎的日本大耳白兔的兔皮组织中提取的一种生物活性制剂,前期在大鼠大脑中动脉栓赛(MCAO)实验中发现,AGC在有效治疗时间窗内(脑缺血90 min再灌注15 min内)给药,可明显抑制MCAO大鼠脑组织的炎症反应,同时促进应激损伤修复分子的产生而发挥脑组织保护作用。这可能是治疗缺血性脑卒中的药理学机制之一。因此,本实验探讨AGC对缺血再灌注损伤炎症反应的抑制作用及促炎症因子上游信号通路的影响。方法 (1)采用CCK8法检测AGC对小鼠小胶质细胞(BV-2)细胞活力的影响;(2)采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)构建氧糖剥夺模型(OGD)缺氧缺糖1,1.5,2,3,4和6 h,复氧1,2,3和6 h后加入AGC。利用CCK8法检测AGC对OGD/R细胞活力的影响,从而确定OGD/R细胞模型建立的实验条件;(3) ELISA法检测AGC对BV-2细胞OGD/R后促炎因子表达的影响;(4) Western蛋白质印迹法检测AGC对BV-2细胞OGD/R后TLR9及其下游信号通路蛋白表达变化的影响。结果 (1) AGC在0.25～1 k U·L-1范围内对BV-2细胞活力无影响;(2)根据CCK8法检测Na2S2O4引起的氧糖剥夺再恢复(OGD/R)后BV-2细胞的活力的结果,OGD/R细胞模型建立的条件为10 mmol·L-1的Na2S2O4的条件氧糖剥夺1.5 h,复氧3 h;(3) AGC 0.25,0.5和1.0 k U·L-1抑制了BV-2细胞OGD/R后TNF-α和IL-6的表达;(4) AGC 0.25,0.5和1.0 k U·L-1抑制了BV-2细胞OGD/R后TLR9,TRAF6和NF-κB的表达。结论 AGC可通过抑制TLR9/TRAF6/NF-κB信号通路,降低氧糖剥夺再恢复后炎性细胞因子的表达,从而减轻脑缺血后的炎症反应,发挥脑保护作用。     

自噬在脑缺血性损伤中的作用

自噬是一种细胞内成分自我降解的过程,包括自噬的诱导、自噬体膜的形成、自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及内容物的降解。自噬若适度激活,则促进细胞存活;若过度激活,则可加重细胞损伤,甚至导致细胞裂解和促进细胞死亡。该文主要从自噬的形成过程及分子机制、脑缺血后自噬的诱发因素、自噬参与脑缺血的信号转导通路及自噬在脑缺血损伤中的作用进行综述,为进一步研究自噬与脑缺血性损伤及其药物调控提供参考。     

青蒿素抑制星形胶质细胞炎症通路的分子机制研究

目的 分别以P2X7、外泌体以及瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)为作用靶点,研究青蒿素(ART)抑制星形胶质细胞炎症通路的分子机制。方法 培养小鼠原代星形胶质细胞,利用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞的纯度;MTT法检测ART对细胞活性的影响;脂多糖(LPS)处理原代星形胶质细胞,构建细胞炎症模型;分为空白对照组,ART组,外泌体抑制剂组,P2X7受体抑制剂组,TRPV1受体抑制剂组,TRPV1受体激动剂组,通过ELISA法和吸光光度法检测细胞上清液中炎症因子的含量(TNF-α、IL-1β、IL-6及NO)。结果 GFAP阳性细胞数达95%表明成功分离培养小鼠原代星形胶质细胞;300 ng/mL的LPS处理12 h是刺激星形胶质细胞构建炎症模型的最佳浓度和时间;10μmol/mL的ART处理12 h可以达到最佳的抗炎效果,并且当浓度小于20μmol/mL时,对细胞活性基本无影响;抑制P2X7受体的表达和外泌体的释放均能降低细胞中炎症因子TNF-α的含量,但不能与ART产生协同降低的效果;抑制TRPV1受体增加了细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6以及N...     

百可利通过调控自噬抗帕金森病的作用机制

目的帕金森病是以运动障碍为主的多巴胺能神经元退行性疾病,其特征性病变是神经元内可见路易小体,α-突触核蛋白聚集形成难以清除的寡聚体。细胞自噬有助于清除胞内损伤的细胞器与蛋白,维持细胞稳态,而α-突触核蛋白寡聚体的清除能力下降可能与胞内自噬障碍有关。百可利通过调节氧化应激与炎症反应、促进寡聚体清除等多种途径发挥神经保护作用,而这种保护作用可能与调控自噬过程有关。方法建立鱼藤酮损伤SH-SY5Y细胞模型,考察百可利对SH-SY5Y细胞的保护作用。Western蛋白印迹法考察鱼藤酮损伤与百可利作用后细胞内α-syn变化,并探究不同时间点下自噬标志性蛋白LC3B表达变化。选取适宜的损伤时间,提取不同组别细胞总蛋白,观察不同浓度的百可利对LC3B表达的影响。通过免疫荧光直接观察细胞中LC3B荧光的表达含量,并考察百可利对LC3B荧光强度的调节作用。进一步探究不同组别细胞蛋白中自噬上游AMPK、m TOR与自噬过程中ULK表达变化,考察自噬上游过程是否被激活。结果百可利对鱼藤酮损伤后的SH-SY5Y细胞具有保护作用,不仅提高细胞生存率,还抑制LDH过度释放,抑制细胞内α-突触核蛋白寡聚物积聚。在鱼藤酮损伤的SH-SY5Y细胞模型中,自噬标志性蛋白LC3B表达量随损伤时间增加而增加。鱼藤酮损伤24 h时,受损细胞中LC3B表达明显增加,给予百可利的细胞中LC3B含量显著下调。免疫荧光结果也证明鱼藤酮促进LC3B荧光强度增加,而百可利不仅抑制核损伤,还能降低过度增加的荧光含量。同时,鱼藤酮损伤细胞中自噬调节蛋白AMPK/m TOR/ULK均明显上调,而百可利有助于恢复至正常水平。结论百可利通过提高细胞生存率,降低LDH表达,减少α-突触核蛋白毒性发挥神经保护作用。鱼藤酮损伤促进细胞内自噬过程的活化,百可利在抑制细胞凋亡的同时,还通过调控自噬活化发挥神经保护作用,而这种保护作用与对自噬体与溶酶体合成过程的调控有待进一步探究。     

百可利对鱼藤酮损伤模型小鼠自噬的影响

目的研究百可利对模型小鼠纹状体中自噬的影响。方法小鼠ip给予鱼藤酮建立帕金森病损伤模型,于造模2周开始给予百可利(300 mg·kg-1),实验终点前进行行为学评价。取小鼠纹状体,检测自噬相关蛋白表达情况。结果实验终点时,模型组小鼠在转棒实验中爬行时间较对照组短,运动能力较弱,而给予百可利治疗的小鼠运动时间显著增加;在旷场实验中,模型小鼠自主活动能力下降,运动范围减小,百可利治疗组小鼠运动距离明显增加。模型组小鼠纹状体中α-突触核蛋白表达增高,酪氨酸羟化酶明显减少,而百可利治疗后的模型小鼠纹状体中α-突触核蛋白合成被抑制,多巴胺合成的关键酶酪氨酸羟化酶表达上调。通过检测自噬标志性蛋白发现,随着模型建立时间不断增加,模型小鼠纹状体中LC3BⅡ/LC3BⅠ也随之增加。在给药结束后,百可利治疗组小鼠纹状体中LC3BⅡ/LC3BⅠ降低。同时,模型组调控自噬起始的蛋白ULK1表达增加,用于募集其他自噬相关蛋白的beclin-1表达上调,调控自噬体形成的蛋白ATG5被激活,而百可利能抑制以上过度活化的蛋白。结论百可利对鱼藤酮模型动物的运动障碍具有一定改善作用,可能与其抑制鱼藤酮诱导的自噬过度活化有关。