斑马鱼内毒素炎症模型构建及及中药抗内毒素炎症活性筛选

革兰阴性菌外膜结构成分脂多糖(LPS)即内毒素,是其主要致病因子,具有广泛而复杂的生物学效应,可直接或间接引起机体发热、代谢改变、免疫功能紊乱,多器官功能损害、休克乃至死亡等许多病理生理过程。这些效应主要是通过LPS与细胞表面的受体结合,激活细胞内信号转导系统,促进细胞因子及炎症介质的大量合成与释放,导致机体失控性炎症反应。在现代医学对由内毒素触发全身炎症反应综合征的治疗仍然一筹莫展的今天,不断有中药、复方或其所含成分被证明对受内毒素攻击的动物有保护作用。我们先期的研究结果亦证明,中医经典复方凉膈散具有良好的抗内毒素炎症活性,从中药寻找抗内毒素治疗措施呈现良好的前景,抗内毒素中药活性筛选成为关注的热点。然而,对于中药或复方来说,由于成分复杂,影响因素众多,限制了细胞筛选体系和分子筛选体系的应用,特别是在以有效部位、提取物甚至水煎剂为研究对象时则更加困难。若用哺乳动物模型进行大规模筛选,则费时、费力、费物资,代价难以承受。斑马鱼被广泛用作研究人类疾病的动物模型,利用斑马鱼模型来筛选药物已成为发现候选药物的关键技术。近年来,转基因、诱导突变和反义morpholino knockdown等技术的使用,结合活体成像技术,使斑马鱼成为研究人类炎症免疫疾病相关的病理生理学及在活体内进行高通量药物筛选的良好模式生物。近年在国家自然科学基金资助下,开展了斑马鱼内毒素炎症模型构建及基于该模型的中药抗内毒素炎症活性筛选研究。采用LPS卵黄囊注射诱导成功建立斑马鱼内毒素炎症模型。以LPS诱导的中性粒细胞及巨噬细胞的迁移聚集、斑马鱼死亡率、生存时间可作为评价抗内毒素炎症活性参考指标。利用斑马鱼内毒素炎症模型开展了凉膈散方提取物(不同极性提取部位)抗内毒素活性筛选,凉膈散方中单味中药提取物(不同极性提取部位)抗内毒素活性筛选及凉膈散方所含活性单体抗内毒素活性筛选。研究证明该模型用于中药抗内毒素活性评价是可行的。鉴于有效成分组方是创新中药研发的新形式、新方法,我们利用斑马鱼内毒素炎症模型开展了抗内毒素中药有效成分组方的配伍与配比研究,获得优化配方并申请专利保护。利用LPS诱导的马鱼内毒素炎症模型,建立适宜于不同层次(中药单体成分、单味中药及复方不同提取部位或组分)中药形式抗内毒素活性筛选方法,为抗内毒素中药筛选提供一个介于体外初筛与哺乳动物验证之间的快速、低成本和活体筛选新方法,具有良好的应用前景。     

斑马鱼炎症模型及其在中药抗炎领域的应用

中药抗炎在近年来已成为一个重要的研究领域,中药制剂的抗炎临床研究已经取得了一定进展,但具体活性成分及作用机制仍需进一步明确。斑马鱼由于其独特的生物学优势,目前已被广泛应用于中药抗炎活性的筛选。综合近年来国内外有关斑马鱼模型在中药抗炎领域的报道,从已构建的斑马鱼炎症模型、斑马鱼模型中的炎症介质、斑马鱼模型在中药抗炎药物筛选中的应用3个方面对斑马鱼炎症模型及其在中药抗炎领域的研究进展进行综述,以期为模式生物斑马鱼在中药抗炎领域的研究应用提供新思路,为抗炎中药的开发与利用提供借鉴参考。     

基于模式生物斑马鱼模型的中药药效物质筛选技术及应用

目的作为一个复杂成分体系,中药药效物质的精准辨识和筛选是中药现代化研究的一个瓶颈问题,探索新的实验技术十分重要。方法斑马鱼是新兴的模式生物,具有体外受精、胚胎透明,不需要解剖可方便在显微镜下观察组织器官的发育等生物学优势,可在细胞板中完成实验,需要样品量少,已被欧洲替代法验证中心推荐为新的替代动物。斑马鱼全基因组测序结果显示斑马鱼与人的基因组相似性达87%,大量的研究表明斑马鱼对药物反应与临床反应也高度相似,为斑马鱼应用于研究人类疾病与药物筛选奠定了理论和实践基础。本实验室利用斑马鱼模型构建了较为齐全的中药药效物质筛选的技术体系,并对甘草、阿胶、栀子、乳香等传统中药进行药效或毒性成分的筛选辨识研究。结果本实验室利用斑马鱼模型建立了可涵盖肿瘤、心血管、神经系统、骨骼、皮肤、重要器官等的活性/毒性筛选技术平台。从前期大规模的筛选中,发现甘草具有一定的抗肿瘤作用,进一步利用斑马鱼活性跟踪技术和高速逆流色谱分离技术,发现了2个未报道的抑制血管生成的活性成分。新阿胶是山东福胶集团的独家品种,是以猪皮为来源,作为阿胶的替代品,但是现代药理学数据缺乏导致市场认可度低,因此我们利用斑马鱼模型系统开展了新阿胶的化疗损伤后的"扶正"与"生血"的作用机制。中药栀子临床发现具有防治血栓的功效,但是抗血栓的药效标志物并不清楚,作者采用斑马鱼模型整合代谢组学技术,发现3个代表性的抗血栓成分。乳香在历代典籍中具有"孕妇慎服"记载,但是原因不明,我们利用斑马鱼模型构建发育毒性模型,并结合灰色关联度分析法,证明乳香具有一定的发育毒性,并发现了潜在的毒性靶器官,并发现了主要的毒性效应成分。结论斑马鱼作为一种新型的模式生物,在中药药效物质筛选、活性评价、毒性预警方面都具有广阔的应用前景。     

基于脂多糖诱导斑马鱼炎症模型研究何首乌多糖抗炎活性

目的 探究何首乌中水溶性多糖(water-extractedPolygonum multiflorum polysaccharides,WPMP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致斑马鱼系统性炎症的保护作用。方法 WPMP经分离纯化后得到2种组分(WPMP-1和WPMP-2),收集斑马鱼胚胎于28.5℃中培养箱中孵育,设置空白组、LPS诱导模型组,通过孵化率、心率、卵黄囊面积、活性氧生成率、NO生成率等指标确定LPS最佳诱导炎症浓度,确定炎症模型后,加入不同组分的WPMP,并以上述相同指标评价WPMP的抗炎效果。结果 不同浓度WPMP (10,50,100 μg·mL^-1)对LPS引起的斑马鱼炎症具有保护作用,呈现浓度依赖性,能够恢复卵黄囊正常大小,显著降低心率、活性氧生成率以及NO生成率,且在相同多糖浓度下,WPMP-2的抗炎活性高于WPMP-1。结论 PMP具有较好的抗炎作用,为WPMP作为一种天然的抗炎成分提供了科学依据。     

中药化学成分抗内毒素研究现状

目的：综述中药化学成分抗内毒素研究现状。方法：用文献查阅法，对有抗内毒素作用的中药化学成分的来源、抗内毒素研究方法、实验结果及结论等分别介绍。结果：绞股蓝总皂苷等9个中药化学成分分别从降低内毒素致实验动物死亡率；逆转内毒素引起的心血管功能紊乱，低血压弥散性血管内凝血(DIC)及血尿素氮和血浆肌酐升高；抑制肿瘤坏死因子(TNFα)、一氧化氮(NO)、血小板活性因子(PAF)及乳过氧化物酶(LPO)等的合成和过度释放等多种途径发挥其抗内毒素活性。结论：绞股蓝总皂苷等中药化学成分有抗内毒素作用，对抗内毒素系列中药研究开发有指导作用。     

内毒素致病机理与抗内毒素药物研究概况

本文报告了国内外抗内毒素药物的研究进展。内毒素致病机理研究；药物抗内毒素作用机理及抗内毒素药物设计。分析了多粘菌素B九肽、类脂A结构拮抗剂、抗脂多糖抗体及免疫治疗、抗内毒素多肽以及中药对内毒素的作用。对新药筛选研制和临床内毒素引发疾病治疗有一定意义。     

转基因斑马鱼模型应用于索拉非尼抗肝癌活性筛选的方法研究

目的 使用斑马鱼 (Danio rerio) 肝癌模型进行药物筛选,确定筛选方法和最适条件。方法 用不同浓度盐酸多西环素 (Dox) 处理转基因斑马鱼胚胎,诱导其肝脏异常增生,通过综合评价诱导效应与毒性效应,确定适合的诱导浓度;选择适宜的诱导浓度,对索拉非尼抑制肝部异常增生的能力进行评估。结果 确定了盐酸多西环素的最适诱导浓度为30~60mg/L,索拉非尼对斑马鱼模型的肝部异常增生有显著的抑制作用,同时也观察到药物的毒副作用。结论 该模型适用于索拉非尼及其类似物抗肝癌活性的评价与筛选,是评估化合物体内生物活性的快速筛选模型,同时也可以观测毒副作用,在其它抗肝癌药物及与Ras下游信号通路相关靶点的药物的筛选等方面具有广阔的应用前景。     

几种中药化学成分抗内毒素研究现状

目的：探讨粉防已碱等中药化学成分抗内毒素研究现状。方法：用文献检索法检索中文期刊中已报道有抗内毒素作用的中药化学成分，并对其抗内毒素作用的研究方法，研究成果作介绍。结果；粉防已碱等中药化学成分通过抑制内毒素刺激机体释放炎性因子TNFα、IL－8、NO、PAF，抑制TXA2合成，保护内皮细胞，减少内毒素致小鼠死亡率，降低内毒素致兔发热反应温度，缓解休克期肺血管收缩、改善肺循环灌注状态，破坏内毒素化学结构等多种途径拮抗内毒素。结论：粉防已碱等中药化学成分有抗内毒素作用，可作为含该类化学成分抗内毒素中药的质控制指标成分。     

抗菌药物诱导内毒素释放及抗内毒素药物研究进展

不同种类抗菌药物诱导内毒素释放情形不同。主要作用于青霉素结合蛋白(PBP)的抗菌药物有β 内酰胺类，可杀灭菌体而释放大量内毒素(LPS)，而非作用于PBP的抗菌药物有氨基苷类、喹诺酮类、大环内酯类，使细菌释放内毒素较少。在保证有效杀菌的前提下，选择致内毒素释放较少的抗菌药物，并合用抗内毒素药物对减轻机体损伤及预防多脏器功能衰竭的发生可能有益。     

以Lipid A为靶点拮抗内毒素中药的筛选

目的利用生物传感器跟踪技术从抗炎中药中筛选出具有拮抗内毒素的中药,为进一步对中药拮抗内毒素活性成分的分离纯化提供实验依据。方法将革兰阴性细菌的脂质A(Lipid A)包被于生物传感器的非衍生板建立靶点,跟踪测定赤芍、大黄、黄芩等78种中药的水提物和醇提物与Lipid A的结合活性,再将筛选出的中药去鞣质后与定量的内毒素(LPS,20、50ng·ml-1)37℃孵育30min后,测定孵育后的样品与Lipid A的结合情况,以评价样品内的活性物质含量。结果在所筛选的78种中药中有12种中药的水提物与Lipid A具有较高的亲和活性,在这12种中药中有6种中药的醇提物与Lipid A也具有较高的亲和活性;通过对所筛选出的12种中药的水提物去除鞣质后与LPS的消耗实验,发现所筛选出的12种中药均含有除鞣质以外的与lipid A具有特异性结合的物质,并且12种中药中能与Lipid A发生特异性结合作用的活性物质含量存在较大的差异。结论生物传感器跟踪技术是一种快速、准确、有效的筛选平台,筛选出的12种中药均含有非鞣质类能与lipid A发生特异性结合作用的物质,为进一步对12种中药抗内毒素有效部位或单体的分离提供了重要的实验依据。     

单味中药及活性成分体外抗内毒素实验研究

目的：研究单味中药及活性成分抗内毒素作用。方法：采用鲎试剂试管凝集反应进行体外抗内毒素的实验研究。结果：所研究单味中药及活性成分均有不同程度的抗鲎试剂试管凝集反应现象。结论：所研究单味中药及活性成分对细菌内毒素有直接的破坏降解作用。     

斑马鱼模型在中枢神经系统疾病中的研究进展

中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）疾病严重损伤人的身心健康,在全球范围内造成巨大的疾病负担,且患病人数逐年呈增长趋势。由于CNS疾病的复杂性、多因素性及多基因调控性,导致相关疾病的发病机制尚不明确,市场上也严重缺乏针对该类疾病的有效药物。因此,探索CNS疾病的病理机制对药物的开发十分重要,急需一种模式生物来构建CNS疾病模型。斑马鱼（Danio rerio）作为一种重要的模式生物,不仅具有与人类高度保守的大脑组织区域,且具有丰富的社会学行为,成为研究CNS疾病和药物研发的重要工具。本文综述了近年来斑马鱼在CNS疾病研究中的相关研究进展,同时也介绍了一些小分子化合物在斑马鱼疾病模型中的研究应用,为今后CNS疾病的研究和相关药物的研发提供了基础。     

模式生物斑马鱼在中药研究中的应用

斑马鱼作为一种新的模式动物,已经在生物医学的诸多研究领域得到了广泛的应用。近年来,基于斑马鱼的中药相关研究越来越多。本文重点综述了斑马鱼应用于中药药理、毒理研究方面的成果和前景。     

肺热普清散对斑马鱼炎症模型的抗炎作用及机制研究

目的 探讨藏药肺热普清散对斑马鱼炎症模型的作用及机制。方法 挑选受精后 72 h 斑马鱼随机移入 24 孔板中,分为对照组、模型组和肺热普清散低、中、高质量浓度(3、10、30 mg·L^-1)组,对照组与模型组不加药,肺热普清散与斑马鱼共孵育 1 h 后,除对照组外,其余各组用 20 μmol·L^-1硫酸铜处理 2 h 制备炎症模型。在荧光显微镜下观察绿色荧光标记中性粒细胞的 Tg(Lyz:EGFP)系斑马鱼体内炎症细胞迁移情况;实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测野生型斑马鱼核因子κB2(NF-κB2)、白细胞介素(IL)-1b、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-8 mRNA 水平;Western blotting 实验检测野生型斑马鱼 NF-κB、TNF-α 蛋白表达水平;免疫荧光法检测各组鱼尾 NF-κB 表达。结果 对照组斑马鱼荧光细胞主要分布于头部和主动脉部,躯干部位主动脉以上荧光细胞稀少;模型组荧光细胞在各区域均增加,显示出炎症细胞向血管外迁移的明显趋势,躯干侧线以上荧光细胞计数较对照组显著增加(P<0.001);肺热普清散 10、30 mg·L^-1组躯干部荧光细胞计数与模型组比较显著降低(P<0.01、0.001)。与模型组比较,肺热普清散 3、10、30 mg·L^-1 组 IL-1b、TNF-α、IL-8 的 mRNA 水平显著下调(P<0.05、0.01),10、30 mg·L^-1 组 NF-κB2 mRNA 水平显著下调(P<0.01);10、30 mg·L^-1 组 NF-κB、TNF-α 蛋白表达水平显著降低(P<0.01、0.001)。免疫荧光结果显示,模型组躯干部位和鱼鳍 NF-κB 白色荧光点较对照组明显增加,经 10 mg·L^-1肺热普清散处理后的相同部位荧光点减少。结论 肺热普清散对硫酸铜诱导的斑马鱼炎症模型具有抗炎作用,机制与抑制 NF-κB、TNF-α 表达有关。     

板蓝根有机酸等中药成分抗内毒素研究现状

细菌内毒素 (Endotoxin ,ET)是由脂多糖 (LPS)和蛋白质复合而成的 ,其致病性及其危害性已引起医药学界的普遍关注 ,ET拮抗剂的研究已成为生命科学的热门课题。西药方面多从抗ET抗体研究着手 ,且取得了一定成果 ,但因抗体使用价昂 ,加之特异性强 ,故中药 (天然 )药物成分抗ET研究日益受到重视。近几十年来已发现近百种单味中药、中药复方及中药化学成分有抗ET作用。本文拟对板蓝根等中药化学成分抗ET研究现状作一综述 ,以期对今后的研究和临床应用有所裨益。1板蓝根有机酸板蓝根有抗大肠杆菌O111B4 ET作用[1],吴晓云等[2]将从板蓝根…     

抗菌药物联合中药对细菌释放内毒素的影响研究

目的 探讨抗菌药物与清热解毒中药联用对细菌释放内毒素的影响,为临床中、西抗菌药联用治疗严重感染提供理论依据.方法 将穿琥宁、喜炎平分别与头孢噻肟、左氧氟沙星、阿米卡星抗菌药物混合,以1倍、10倍及100倍最小抑菌浓度(MIC)作用于敏感的肺炎克雷伯菌,测定作用4h之后释放内毒素的量,并做阴性对照.结果 3种抗菌药物中,头孢噻肟钠诱导细菌释放内毒素量最大,左氧氟沙星次之,阿米卡星较低;2种中药注射液与抗菌药物联用比单用抗菌药物诱导细菌释放的内毒素量少,单用与联用抗菌药细菌释放内毒素量均为1倍MIC＞10倍MIC＞100倍MIC.结论 穿琥宁和喜炎平注射液与头孢噻肟钠、左氧氟沙星、阿米卡星3种抗菌药物联用,能减少细菌诱导释放内毒素,提示临床选用中药与抗菌药物联用时应参考细菌释放内毒素的特性.     

抗菌药物联合中药对细菌释放内毒素的影响研究

目的探讨抗菌药物与清热解毒中药联用对细菌释放内毒素的影响,为临床中、西抗菌药联用治疗严重感染提供理论依据。方法将穿琥宁、喜炎平分别与头孢噻肟、左氧氟沙星、阿米卡星抗菌药物混合,以1倍、10倍及100倍最小抑菌浓度(MIC)作用于敏感的肺炎克雷伯菌,测定作用4h之后释放内毒素的量,并做阴性对照。结果 3种抗菌药物中,头孢噻肟钠诱导细菌释放内毒素量最大,左氧氟沙星次之,阿米卡星较低;2种中药注射液与抗菌药物联用比单用抗菌药物诱导细菌释放的内毒素量少,单用与联用抗菌药细菌释放内毒素量均为1倍MIC>10倍MIC>100倍MIC。结论穿琥宁和喜炎平注射液与头孢噻肟钠、左氧氟沙星、阿米卡星3种抗菌药物联用,能减少细菌诱导释放内毒素,提示临床选用中药与抗菌药物联用时应参考细菌释放内毒素的特性。     

基于斑马鱼模型的中药来源化合物血管抑制活性筛选

目的 利用斑马鱼高通量模型,对10种中药来源化合物进行筛选。方法 选取受精后转基因血管荧光Fli-1品系斑马鱼对10个中药来源的化合物进行筛选,用不同的药物浓度分别作用于斑马鱼,观察对斑马鱼体血管的影响。以斑马鱼肠下血管面积为主要指标,斑马鱼肠下血管出芽数为次要指标进行定量分析,考察各化合物对斑马鱼血管生成的抑制作用。结果 木犀草素(87.34 μmol·L^–1)、洋川芎内酯A(52.02 μmol·L^–1)、盐酸小檗碱(537.91 μmol·L^–1)、和厚朴酚(9.39 μmol·L^–1)、齐墩果酸(10.95 μmol·L^–1)组斑马鱼肠下血管面积与正常对照组相比肠下血管面积显著减少(P<0.01或P<0.001);木犀草素、洋川芎内酯A、盐酸小檗碱、齐墩果酸、和厚朴酚对肠下血管面积的抑制作用分别为12%,17%,18%,15%,24%;各化合物与正常对照组相比斑马鱼肠下血管出芽数无显著性差异;阳性对照组(索拉非尼5 μmol·L^–1)斑马鱼肠下血管面积与正常对照组比较显著性减少(P<0.05),其对血管新生的抑制作用为22%,肠下血管出芽数与正常对照组相比显著性减少(P<0.05)。结论 木犀草素、洋川芎内酯A、盐酸小檗碱、齐墩果酸、和厚朴酚具有抑制血管新生作用。     

青蒿素等中药化学成分抗内毒素研究现状

中药药理作用的物质基础是化学成分 ,中药制剂应有 2 0 %(注射剂 2 5 % )为已知成分。现已发现有抗细菌内毒素(ｅｎｄｏｆｏｘｉｎ ,ＥＴ)作用的中药及其复方近百个 ,但对其化学成分研究仍较薄弱 ,对这方面的现状介绍 ,定会促进今后的研究。1　青蒿素青蒿素 (ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ)为我国首次从黄花蒿中提出的抗疟有效成分。谭余庆等[1 ] 对其抗内毒素作用进行了系列研究 ,大鼠腹腔注射脂多糖 (ＬＰＳ) 1ｍｇ·ｋｇ 1 1ｈ后 ,3种浓度青蒿素溶液灌胃 ,给药后 9ｈ眼眶取血检测。结果 ,与ＬＰＳ组比较 ,超氧化物歧化酶 (ＳＯＤ)含量显著升高 …     

头孢他啶诱导大肠埃希菌内毒素释放及常用中药注射剂抗内毒素作用的体外研究

目的探讨头孢他啶对不同浓度大肠埃希菌内毒素释放的影响及常用清热解毒中药注射剂体外抗内毒素活性。方法采用二倍稀释法测定头孢他啶对大肠埃希菌的MIC,并确定清开灵、双黄连和喜炎平注射剂临床常用剂量对MIC的影响;50×MIC头孢他啶对处于对数生长期不同浓度大肠埃希菌内毒素产生的影响;清开灵、双黄连和喜炎平注射剂与头孢他啶联合应用时抗内毒素作用的研究。结果头孢他啶对大肠埃希菌的MIC为0.125μg/ml,清开灵、喜炎平注射剂对头孢他啶的MIC无影响,双黄连注射剂可显著提高头孢他啶MIC;头孢他啶于高菌液浓度时可诱导内毒素释放,在低菌液浓度时抑制内毒素释放;中药注射剂与头孢他啶联合应用时,加药顺序对内毒素的产生有一定影响,当清开灵、喜炎平注射剂在头孢他啶之后应用时,可显著降低内毒素含量,喜炎平的效果优于清开灵注射液。结论头孢他啶对大肠埃希菌内毒素释放的影响与菌液浓度有关。清开灵、喜炎平注射剂具有抗内毒素作用,与头孢他啶联用时,用药顺序对内毒素的消除有一定影响。