Nrf2/ARE通路与PI3K/AKT通路相互作用对胰岛细胞半胱天冬酶-3表达的影响

目的 探讨核因子相关因子2 (Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路相互作用对2型糖尿病(T2DM)大鼠胰岛细胞凋亡和半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表达的影响及其可能机制.方法 将60只雄性Wistar大鼠分为正常对照组(NC组,n=20)、糖尿病模型组(DM组,n=20)和叔丁基对苯二酚干预组(tBHQ组,n=20),干预8周后处死所有大鼠,TUNEL检测胰岛细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清及胰腺组织中丙二醛(MDA)水平,Western blot检测AKT、p-AKT、总Nrf2、核Nrf2、血红素氧合酶1(HO-1)、Caspase-3在胰岛细胞中蛋白表达水平.结果 与NC组比较,DM组胰岛细胞凋亡率显著增加(P=0.000),而tBHQ组胰岛细胞凋亡率明显低于DM组(P=0.000).DM组血清及胰腺组织中MDA水平较NC组明显升高(P=0.000),而tBHQ组血清及胰腺组织中MDA水平明显低于DM组(P=0.000).DM组p-AKT、总Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表达水平均较NC组显著降低(P=0.000),Caspase-3蛋白表达水平较NC组明显升高(P=0.000);与DM组比较,tBHQ组p-AKT、总Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表达水平均明显增加(P=0.000),Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P=0.017);AKT蛋白表达水平在3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Nrf2/ARE通路与PI3K/AKT通路相互作用对抑制胰岛细胞Caspase-3的表达及延缓胰岛细胞凋亡进程产生重要的保护作用.     

黄芪甲苷对高糖环境下人肾小球系膜细胞损伤保护作用及其机制研究

目的 探讨黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对高糖(HG)环境下人肾小球系膜细胞(HMCs)增殖和氧化应激损伤保护作用及其可能机制.方法 采用MTT方法检测高糖作用不同时间点时及不同浓度AS-Ⅳ干预后HMCs增殖情况;采用实时荧光定量PCR(qPCR) 、Western blot方法分别检测不同浓度AS-Ⅳ干预高糖环境下HMCs 48 h后核因子E2相关因子2 (Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA及其蛋白表达;采用过氧化氢(H2O2)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)试剂盒分别检测不同浓度AS-Ⅳ干预高糖环境下HMCs 48 h后细胞上清液中H2O2、T-SOD、GSH-Px、MDA含量变化.结果 MTT法结果显示,与正常(NG)组比较,高糖环境下HMCs呈过度增殖趋势(P<0.05),不同浓度AS-Ⅳ干预48 h后,与HG组比较,各用药组明显地抑制了高糖环境下HMCs过度增殖且呈剂量依赖性(P<0.01);qPCR及Western blot法结果显示,与HG组比较,各用药组明显地增加了Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达(P<0.01),减少了iNOS与ICAM-1 mRNA及蛋白表达(P<0.05).各试剂盒测试结果显示,与HG组比较,各用药组明显地降低了HMCs上清液中H2O2、MDA的含量(P<0.05),增加了HMCs上清液中T-SOD、GSH-Px的含量(P<0.01).结论 AS-Ⅳ能够明显地抑制HG环境下HMCs过度增殖.对HG环境下HMCs损伤保护作用的部分机制可能是通过激活Nrf2通路并上调Nrf2、HO-1 mRNA及其蛋白其表达,下调iNOS、ICAM-1 mRNA及其蛋白表达,增加HMCs上清液中T-SOD、GSH-Px的含量,降低HMCs上清液中H2O2、MDA的含量.     

黄芪甲苷对乌拉坦诱导肺癌小鼠的防治作用及其机制

目的探讨黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对乌拉坦诱导的肺癌小鼠的防治作用及其机制。方法将100只美国癌症研究所小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组,每组20只。模型组、低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠腹腔注射乌拉坦600 mg·kg-1,每周1次,持续10周,建立肺癌模型;对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。造模当天,低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠分别给予AS-Ⅳ12.5、25.0、50.0 mg·kg-1灌胃,对照组和模型组小鼠给予等量蒸馏水灌胃,每日1次,连续19周。记录各组小鼠的体质量、自主活动次数,每2周1次。各组小鼠乙醚麻醉后脱臼处死,取肺组织,计算肺癌发生率和肺肿瘤数;苏木精-伊红染色观察各组小鼠肺组织病理学变化。采用酶联免疫吸附法检测各组小鼠血清中癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)水平,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组小鼠肺组织中Wnt-1、β-连环蛋白(β-catenin)、C-myc、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1) mRNA表达水平,Western blot法检测各组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1蛋白表达水平。结果造模后第1、3周,5组小鼠体质量和自主活动次数比较差异无统计学意义(P> 0.05)。造模后第5～19周,模型组小鼠体质量显著低于对照组(P <0.05),低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠体质量分别从第5、7、11周开始高于模型组(P <0.05)。造模后第5～19周,模型组小鼠自主活动次数显著少于对照组(P <0.05),中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠自主活动次数从第11周开始多于模型组(P <0.05),低剂量组小鼠自主活动次数从第13周开始高于模型组(P <0.05)。低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺癌发生率和肺肿瘤数低于模型组(P <0.05),中剂量AS-Ⅳ组、高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺癌发生率和肺肿瘤数低于低剂量AS-Ⅳ组(P <0.05),高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺癌发生率和肺肿瘤数低于中剂量AS-Ⅳ组(P <0.05)。对照组小鼠肺组织形态正常,无增生和炎症细胞浸润;模型组小鼠肺组织被大量肿瘤细胞浸润,出现明显瘤区,失去原有肺组织形态;低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织结构基本清晰,较少出现细胞核密集增生和炎症细胞浸润。模型组、低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠血清中CEA和CA125水平高于对照组(P <0.05),低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠血清中CEA和CA125水平低于模型组(P <0.05),中剂量AS-Ⅳ组、高剂量AS-Ⅳ组小鼠血清中CEA和CA125水平低于低剂量AS-Ⅳ组(P <0.05),高剂量AS-Ⅳ组小鼠血清中CEA和CA125水平低于中剂量AS-Ⅳ组(P <0.05)。模型组、低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相对表达量高于对照组(P <0.05),低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相对表达量低于模型组(P <0.05),中剂量AS-Ⅳ组、高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相对表达量低于低剂量AS-Ⅳ组(P <0.05),高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相对表达量低于中剂量AS-Ⅳ组(P <0.05)。模型组、低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相对表达量高于对照组(P <0.05),低剂量AS-Ⅳ组、中剂量AS-Ⅳ组和高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相对表达量低于模型组(P <0.05),中剂量AS-Ⅳ组、高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相对表达量低于低剂量AS-Ⅳ组(P <0.05),高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相对表达量低于中剂量AS-Ⅳ组(P <0.05),高剂量AS-Ⅳ组小鼠肺组织中C-myc蛋白相对表达量高于对照组(P <0.05),高剂量AS-Ⅳ组与对照组小鼠肺组织中Wnt-1、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达量比较差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 AS-Ⅳ可显著抑制乌拉坦诱导的小鼠肺癌发生,其作用机制可能与减少Wnt-1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1蛋白表达及抑制Wnt/β-catenin信号通路活化有关。     

Ⅰ型糖尿病大鼠胰岛素水平与胰岛β-细胞中端粒酶逆转录酶表达及端粒长度关系的研究

目的 通过1型糖尿病(TIDM)大鼠胰岛素(insulin,Ins)水平变化与胰岛β-细胞中端粒酶逆转录酶(TERT)表达及端粒长度关系的分析,探讨TERT及端粒长度变化在T1DM发病机制中的作用.方法 T1DM大鼠模型组与正常对照组各48只,分别测定Ins,同时分离胰岛β-细胞,原位杂交法检测胰岛β-细胞TERT的表达,用Southern Blot法检测端粒长度,并进行对比研究.结果 T1DM组Ins水平显著低于对照组(P<0.01),T1DM组β-细胞中TERT的表达显著高于对照组(P<0.01),而端粒长度显著低于对照组(P<0.05);T1DM组的Ins水平下降与TERT活性表达增强呈高度负相关(r=-0.8942,P<0.01),与端粒缩短呈正相关(r=0.9238,P<0.01).结论 T1DM大鼠Ins水平降低与TERT活性增强、胰岛β-细胞端粒缩短密切相关.提示胰岛β-细胞中TERT的活性增强,可能是抑制胰岛β-细胞对Ins分泌的病理机制,TERT活性表达及端粒缩短也可作为T1DM病情监测的指标.     

中药联合胰岛素泵对2型糖尿病患者胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗的影响

目的观察中药联合胰岛素泵(CSII)治疗2型糖尿病(T2DM)的临床效果,精确评价联合用药对胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗(IR)的作用。方法对10例初诊T2DM患者(联合组)采用中药联合CSII治疗,匹配空腹血糖值相同者(对照组)单纯CSII治疗,疗程1个月,检测血糖(PG)、糖化血红蛋白(HbA1C),高葡萄糖钳夹评价胰岛β细胞功能和IR情况。结果①治疗后2组双相胰岛素分泌均有升高,其联合组2相(2PH)胰岛素分泌均值和最大值高于对照组,差异有显著统计意义,P0.05;②联合组胰岛素敏感指数(ISI)升高,t=-4.837,P=0.001;对照组ISI变化不显著,t=-1.655,P=0.132;2组ISI净升高值存在显著差异,t=4.364,P=0.002。结论中药联合CSII治疗T2DM可获得良好血糖控制,其机理可能是通过恢复胰岛β细胞对葡萄糖刺激的敏感性和改善IR而实现的。     

乌司他丁在大鼠胰岛分离中的抗凋亡作用

目的 探讨乌司他丁在大鼠胰岛分离过程中抑制胰岛细胞凋亡的作用.方法 将20只SD大鼠平均分为两组,处理组在胰岛分离全过程中加用胰蛋白酶抑制剂乌司他丁进行干预,对照组则不加乌司他丁处理,采用Ficoll非连续密度离心纯化后对两组胰岛细胞的凋亡、胰岛产量及活力进行比较.结果 加用乌司他丁处理组的胰岛细胞凋亡率显著低于对照组(P＜0.01),处理组胰岛产量和胰岛素释放水平均显著高于对照组(P＜0.01).结论 胰岛分离过程中加用胰蛋白酶抑制剂对胰岛具有抑制凋亡、提高胰岛产量及保护胰岛活力的作用.     

离体肝脏保存-再灌注损伤的发生机制及丹参的保护作用的实验研究

目的探讨羟自由基(·OH)与细胞凋亡、Bcl-2蛋白表达在大鼠肝脏不同保存时相再灌注过程中的变化规律及相互关系,阐明丹参对肝脏保存再灌注损伤的影响.方法以大鼠肝脏非循环灌注为模型,用高效液相色谱(HPLC)紫外检测法测定·OH生成物二羟苯甲酸(DHBA)含量,用原位末端标记法及电子显微镜观察细胞凋亡,用免疫组织化学法检测Bcl-2蛋白表达,观察了正常组(未保存)、对照组(乳酸林格液即LR液)及丹参组(LR液 丹参)保存鼠肝不同时相的效果.结果随着保存时间延长(18h内),·OH水平及细胞凋亡指数(AI)呈进行性升高,且两者呈显著正相关(r=0.81),相同保存时间丹参组明显低于对照组(P《0.05);而Bcl-2蛋白表达指数(BI)呈进行性降低,BI与·OH水平及AI呈显著负相关(r=-0.84),相同保存时间丹参组BI显著高于对照组(P《0.05).丹参组ATP含量及分泌胆汁量明显高于对照组,丹参组流出液天门冬氨酸转氨酶(AST)明显低于对照组,差异有显著性(P《0.05).结论 ·OH及细胞凋亡同时参与肝脏保存-再灌注损伤,丹参对该损伤具有明显的保护作用,其作用机制与抗氧自由基、抑制细胞凋亡、提高Bcl-2蛋白表达及改善低温保存肝脏的能量代谢作用有关.     

黄芪甲苷抑制NLRP3/IL-1β轴改善高糖诱导的血管平滑肌细胞炎症反应

目的:探讨黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对高糖诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)炎症反应的作用及机制。方法:①采用不同浓度的葡萄糖(5.5、10、15、25 mmol/L)刺激VSMCs细胞24 h,或高浓度葡萄糖(25 mmol/L)处理VSMCs不同时间(0、6、12、24 h)。Western blot检测NOD样受体蛋白3(NLRP3)蛋白表达;ELISA检测白介素-1β(IL-1β)含量。②采用不同浓度(0、10、20、40μg/ml)AS-Ⅳ干预VSMCs细胞24 h后,CCK8法检测并计算细胞活力。③将VSMCs细胞分为对照组、高糖组、AS-Ⅳ组和AS-Ⅳ+高糖组。先给予AS-Ⅳ组和AS-Ⅳ+高糖组20μg/ml AS-Ⅳ预孵育2 h后,再向高糖组和AS-Ⅳ+高糖组加入25 mmol/L葡萄糖刺激24 h。Western blot检测NLRP3蛋白表达;ELISA检测IL-1β含量。④构建si-NLRP3 RNA转染的VSMCs细胞。将细胞分为对照组、高糖组、si-NLRP3组和si-NLRP3+高糖组。细胞转染6 h后,高糖组和si-NLRP3+高糖组细胞加入25 mmol/L葡萄糖刺激24 h。PCR检测NLRP3 mRNA表达;ELISA检测IL-1β含量。⑤应用转染技术构建NLRP3过表达的VSMCs细胞。将细胞分为对照组、AS-Ⅳ组、NLRP3过表达组和NLRP3过表达+AS-Ⅳ组。细胞转染6 h后,AS-Ⅳ组和NLRP3过表达+AS-Ⅳ组加入20μg/ml AS-Ⅳ干预24 h。PCR检测NLRP3 mRNA表达;ELISA检测IL-1β含量。结果:①高糖刺激能够上调VSMCs细胞NLRP3和IL-1β蛋白表达(P0.01),且呈一定的浓度/时间依赖性,故选取25 mmol/L葡萄糖作用24 h进行后续研究。②10、20μg/ml AS-Ⅳ作用VSMCs细胞24 h后,细胞活力无显著变化(P0.05),选择20μg/ml浓度进行后续实验。③与对照组相比,AS-Ⅳ组细胞NLRP3蛋白表达量显著下调(P0.05),IL-1β含量显著降低(P0.05);与高糖组相比,AS-Ⅳ+高糖组NLRP3蛋白表达量显著减少(P0.01),IL-1β含量显著降低(P0.01)。④与对照组相比,si-NLRP3组细胞NLRP3 mRNA表达量显著降低(P0.01),IL-1β含量没有明显变化;与高糖组相比,si-NLRP3+高糖组NLRP3 mRNA表达量显著减少(P0.01),IL-1β含量显著降低(P0.01)。⑤与AS-Ⅳ组相比,NLRP3过表达+AS-Ⅳ组NLRP3 mRNA表达量显著增多(P0.01),IL-1β含量显著升高(P0.01)。结论:黄芪甲苷可能通过抑制NLRP3/IL-1β轴改善高糖诱导的VSMCs炎症反应。     

牙周非手术治疗对肥胖大鼠血清炎症指标及代谢水平的影响

目的 探讨牙周非手术治疗对肥胖大鼠血清炎症因子及代谢水平的影响.方法 选取16只已成功建立肥胖复合牙周炎模型的大鼠,随机分为治疗组及未治疗组(对照组),治疗组大鼠接受牙周非手术治疗,对照组未做任何处理,所有大鼠于牙周治疗后2周处死.牙周治疗前及治疗后2周两组大鼠均行口服糖耐量试验,眼眶静脉取血、检测空腹血糖及空腹胰岛素,运用酶联免疫吸附法检测血清C-反应蛋白(CRP).结果 牙周治疗后2周,治疗组的空腹血糖(t=2.445,P=0.034)及β细胞功能指数显著低于对照组(t=-2.543,P=0.027);经牙周治疗后,治疗组CRP水平显著降低,并低于对照组(t=2.388,P=0.028);口服糖耐量试验中,曲线下面积显著下降,并低于对照组(t=12.053,P=0.000).结论 牙周非手术治疗可以下调肥胖复合牙周炎大鼠的CRP水平,改善肥胖大鼠的糖代谢状况.     

比伐卢定对大鼠胰岛细胞凋亡的影响

目的 探讨比伐卢定(直接凝血酶抑制剂)在大鼠胰岛分离过程中保护胰岛细胞的作用.方法 将SD大鼠分为比伐卢定处理组和对照组,处理组在胰岛分离全过程中加用比伐卢定进行干预,对照组则不加比伐卢定处理,采用Ficoll非连续密度离心纯化后对两组胰岛细胞的凋亡(采用原位末端核苷酸标记法及流式细胞仪检测)、胰岛产量及活力方面进行比较性研究.结果 比伐卢定5000U处理组的胰岛细胞凋亡计数(5±4)个/HPF、凋亡率(16.5±3.6)％、Fas-1基因表达水平(4.6±1.9)％均显著低于对照组(P＜0.01),胰岛产量(315.3±6.1)IEQ、胰岛素释放水平(179.11±2.18)mIU/L和Bcl-2基因表达水平(10.5±1.2)％均显著高于对照组(P＜0.01),差异有统计学意义.结论 胰岛分离过程中加用比伐卢定对胰岛具有抑制凋亡、提高胰岛产量和保护胰岛活力的作用.