Smad4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建Smad4基因RNAi慢病毒载体. 方法:针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shSmad4慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定. 用LV-shSmad4,pCMV-dR8.74和pMD2G 3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度. 结果:PCR和测序证实,成功构建Smad4 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad4. 包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×1010 pfu/L. 结论:成功构建人Smad4基因RNAi慢病毒载体.     

凋亡蛋白抑制因子Livin shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定凋亡蛋白抑制因子Livin基因短发夹状干扰RNA(shRNA)慢病毒我体,以便进一步研究Livin的功能.方法 针对已经筛选确定的Livin基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接、转化,产生pLV-shLivin慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用pLV-shLivin,pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功构建Livin shRNA的慢病毒栽体LV-shLivin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×108TU/ML.结论 成功构建Livin基因sbRNA慢病毒栽体,为应用RNAi研究Livin功能奠定基础.     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

人高迁移率族蛋白组A1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建和鉴定人高迁移率族蛋白组A1(HMGA1)基因RNA干扰慢病毒表达载体。方法:针对已经筛选确定的HMGA1基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体(含U6启动子和绿色荧光蛋白)连接产生LV-sh HMGA1慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV-sh HMGA1慢病毒载体、pHelper 1.0和pHelper 2.0等3种质粒共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果:PCR和测序证实,成功构建LV-shHMGA1的慢病毒载体,病毒滴度达5×107TU/ml。结论:人HMGA1基因RNA干扰慢病毒载体的成功构建为进一步应用RNAi技术研究HMGA1基因的功能打下了基础。     

MMP-2基因RNAi重组慢病毒的构建

目的 构建MMP-2基因RNAi重组慢病毒,以便客观研究该基因的作用.方法 筛选确定的MMP-2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pLVTHM载体连接产生LV2siMMP-2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV2siMMP-2,pCMV2dR8.74和pMD2G3质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功构建MMP-2 siRNA的慢病毒载体LV2siMMP-2,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为8×1010 TU/L.结论 成功构建人MMP-2基因RNAi慢病毒载体,为后期研究MMP-2基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗奠定基础.     

Construction, exogenous selection and identification of lentiviral vector targeting human fibrinogen-like protein 2 gene

目的 拟构建人纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)凝血酶原酶基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人FGL2凝血酶原酶表达水平提供有利的工具.方法 根据人FGL2凝血酶原酶基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP 载体连接产生FGL2慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Western blot 技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列.用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度.结果 PCR扩增和测序结果显示,人FGL2凝血酶原酶核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定一条干扰效率高的有效靶序列.利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109 TU/ml.结论 证实实验成功构建了FGL2基因RNA干扰慢病毒载体.     

PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定。方法：针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ 酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用shPAK4i-LV载体、pHelper1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度。 结果：PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了PAK4-shRNA慢病毒载体shPAK4i-LV。包装并浓缩慢病毒,滴度为2E+9 TU•mL^-1。将病毒感染SACC-83细胞,real-time PCR检测PAK4的mRNA表达下调70%以上。结论：成功构建了shPAK4i-LV病毒载体并建立了SACC-83-shPAK4i细胞模型,为PAK4在肿瘤信号转导通路中的研究提供工作基础。     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.     

FGL2基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

目的拟构建人纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)凝血酶原酶基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人FGL2凝血酶原酶表达水平提供有利的工具。方法根据人FGL2凝血酶原酶基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生FGL2慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Western blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度。结果 PCR扩增和测序结果显示,人FGL2凝血酶原酶核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定一条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/ml。结论证实实验成功构建了FGL2基因RNA干扰慢病毒载体。     

慢病毒介导基于microRNA系统的HBs RNAi技术抑制HBV复制

目的:构建HBs基因RNAi慢病毒载体,观察其对HBV复制和抗原表达的作用。方法:针对已经筛选确定的HBs基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluⅠ和ClaⅠ酶切后的pGCLM-GFP载体连接产生慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pGCLM-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。培养HepG2.2.15细胞系,用慢病毒（MOI=1和MOI=10）对肝癌细胞进行感染,感染后细胞培养上清进行ELISA、Western印迹、HBV DNA定量分析。结果:PCR和测序结果证实,成功构建HBs shRNA的慢病毒载体。包装慢病毒后浓缩病毒悬液的滴度为5×108~2×109 TU /ml。慢病毒HBs RNAi后,对HBV复制和抗原表达的抑制作用显著。感染4 d后,抑制效应开始出现,一直持续到第9天,抑制效应达到高峰(P<0.05)。相对于阴性对照,HBs shRNA作用后细胞上清中HBsAg分泌量下降70％以上(P<0.05),而Western印迹和real-time PCR结果进一步证实了上述结果,在蛋白水平和mRNA水平都得到了进一步验证。经HBV DNA定量,发现慢病毒RNAi后DNA水平也显著下降(P<0.05)。结论:成功构建HBs基因RNAi慢病毒载体,以HBs基因为靶点的慢病毒介导的基于microRNA系统的RNAi技术能有效抑制HBV的复制和抗原表达。     

小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测

目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?     

解整合素金属蛋白酶10基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体,为进一步体内外实验研究提供基础。方法:筛选确定ADAM10基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与LentiLox3.7载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒转导传代心肌细胞(H9C2),通过Western blotting检测心肌细胞ADAM10的蛋白表达。结果:获得的载体插入ADAM10的shRNA核苷酸链序列正确,包装的慢病毒颗粒转导心肌细胞,与对照组比较ADAM10 shRNA转染成功抑制ADAM10蛋白表达。结论:成功构建AD-AM10 shRNA慢病毒载体,为其在扩张型心肌病(DCM)中的生物学功能研究奠定基础。     

HIF-1α慢病毒干扰载体构建及GL261小鼠胶质瘤稳定沉默细胞系的建立

目的 研究短发夹状RNA（shRNA）干扰慢病毒表达载体对小鼠胶质瘤GL261细胞系中乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的沉默效应。方法 构建针对小鼠胶质瘤GL261细胞HIF-1α mRNA的不同干扰靶点的4个shRNA表达载体,筛选出HIF-1α基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA,构建pLenti6.3-shRNA3慢病毒载体感染靶细胞GL261,获得稳定沉默HIF-1α细胞株,利用实时定量PCR和Western blot方法检测稳定细胞株HIF-1α的沉默效应。结果 成功构建了具有HIF-1α沉默效应的慢病毒干扰载体,通过倍比稀释测定干涉病毒滴度为1.15×108TU/mL。实时定量PCR和Western blot实验均证实慢病毒转染后,GL261细胞株中HIF-1α表达水平明显降低。结论 针对HIF-1α基因不同位点的不同shRNA具有干扰效率的差异。特异性的shRNA可稳定地介导HIF-1α基因沉默。     

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。     

DPC4 RNAi慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的：构建DPC4基因tLNA干扰慢病毒载体及其基因沉默效应。方法：针对DPC4基因序列,利用网站设计程序按照RNA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,根据设计经验和设计软件进行评估测定,选择最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程;生工生物合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端．直接连入酶切后的IKNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆进行酶切鉴定,挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性克隆即为构建成功的目的基因1KNA干扰慢病毒载体。结果：经过Western blot方法检测和测序证实,成功构建了DPC4shRNA慢病毒栽体LVshSmad4,并成功制备了DPC4 shRNA慢病毒,3株病毒感染细胞后均具有有效的基因沉默,其中SHI序列最为显著。结论：DPC4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备,而且具有显著的基因沉默效果。     

shRNA转染对异位内膜细胞survivin基因的靶点抑制作用

目的 构建靶向人survivin基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对异位内膜细胞survivin基因的抑制作用.方法 设计干扰人survivin基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pGCL-GFP载体,PCR鉴定和测序分析及阳性克隆质粒抽提,在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和survivin基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度.感染人异位子宫内膜细胞,采用RT-PCR测定细胞中survivin mRNA的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果 慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为8×10 8U/ml.Survivin shRNA慢病毒载体感染人异位内膜细胞后,Survivin mRNA水平为0.15±0.03,明显低于阴性对照组0.42±0.06和空白对照组0.48±0.08(P<0.01);而阴性对照组与空白对照组相比无统计学差异.结论 成功构建针对survivin基因的shRNA慢病毒载体,体外感染人异位内膜细胞后可有效抑制survivin基因的表达,为研究子宫内膜异位症分子病冈和基因治疗提供了新的平台.