人T-bet基因的表达、纯化及其免疫原性分析

目的：利用载体pQE30在大肠埃希菌（M15）原核表达人T-bet基因全长序列，并对表达产物进行纯化、免疫动物和制备多克隆抗体。方法：利用PCR技术从克隆载体pGEM-T／T-bet获得人T-bet的全长编码序列，并将其亚克隆至原核表达载体pQE30，形成重组表达质粒pT-bet；酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌JM109，测序鉴定后转化M15，经IPTG370C诱导4h后，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色判断以包涵体形式存在的带有6×His标签的融合蛋白（表达产物），用Ni^2＋ -IMAC层析柱对融合蛋白进行纯化；将纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠，制备人T-bet的多克隆抗体。结果：成功表达和纯化了人T-bet，并制备了多克隆抗体，ELISA和Western blot结果显示了血清抗体的高效价（1：100000）和高度特异性。结论：成功构建了原核表达载体pT-bet，并在工程菌M15中获得大量表达，经纯化后获得高纯度的人T-bet蛋白，制备了效价和特异性良好的多克隆抗体，为进一步研究T-bet的生物学功能奠定了的基础。     

人外周血CD8＋T细胞Runx3的基因克隆及其原核表达

目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础.方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13 F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定.利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG 30%诱导4 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定.结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1 248 bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白.     

小鼠LIGHT胞外段基因原核表达质粒的构建及表达

目的 构建含有LIGHT胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法 从由小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增LIGHT胞外段,克隆至原核表达载体pEF-24a( )中,构建重组表达质粒pET24-LIGHYECD.重组质粒经酶切鉴定及序列测定后,转化E. coli BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果 RT-PCR扩增出了525 bp LIGHT胞外段的cDNA,经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出相对分子质量为20 000的LIGHT胞外段蛋白.结论 成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达,为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

小鼠GITRL融合蛋白的表达、纯化及免疫原性的研究

目的:构建含小鼠GITRL基因原核表达载体,经转化E.coli以表达GITRL融合蛋白,纯化蛋白并制备相应的抗血清.方法:将GITRL-pMD18-T重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收目的基因,与原核表达载体PET32a连接,应用电转法转化BL21(DE3)菌.阳性克隆经鉴定后用IPTG诱导GITRL蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot进行特异性鉴定,CD4+CD25+T细胞免疫抑制试验验证其生物学功能.采用弗氏完全佐剂常规免疫方案,制备抗GITRL抗血清,抗血清的效价和特异性测定采用双向琼脂免疫扩散法.结果:经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在40 kD处呈现单一蛋白条带,该蛋白具有阻断CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的作用,双向免疫扩散结果显示兔抗小鼠GITRL抗血清效价为1∶16.结论:成功构建GITRL原核表达质粒,制备和纯化的GITRL融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,制备并获得特异性抗血清,可用于GITRL融合蛋白生物学活性的进一步研究.     

我国地方品种姜曲海猪TLR5基因的克隆、表达及鉴定

目的:克隆我国地方品种姜曲海猪TLR5基因,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性,为进一步研制TLR5单克隆抗体(mAb)提供免疫原。方法:从全血中提取姜曲海猪的基因组,设计特异性引物,利用PCR方法扩增得到TLR5基因片段,PCR产物克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒pET-TLR5,将重组表达质粒转化E.coli BL21,0.5 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白活性。结果:成功扩增出猪TLR5基因片段,大小为2 571 bp。酶切鉴定结果表明,猪的TLR5基因成功克隆入原核表达载体pET30a(+)中,重组质粒pET-TLR5在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出相对分子质量(Mr)大小约95 200;Western blot结果表明,表达产物与兔抗小鼠TLR5 mAb具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达具有较好免疫原性的猪TLR5分子,为其mAb的制备提供生物材料。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a( )中, 构建重组表达质粒pET32a( )-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.     

结核分枝杆菌Zmp1基因原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建结核分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zmp1)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增Zmp1基因;定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Zmp1;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot法鉴定。结果PCR法扩增出Zmp1基因;重组表达质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;表达的重组Zmp1融合蛋白相对分子质量(Mr)约为94 000,大小与预期融合蛋白一致;重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Zmp1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。     

人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表达

目的构建pQE80L-GLIPR-2载体,并检测融合蛋白RGS·His-GLIPR-2在原核中的表达水平。方法采用RTPCR方法,将克隆人GLIPR-2(glioma pathogenesis related-2,GLIPR-2)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pQE80L中,经IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白RGS·His-GLIPR-2的表达水平。超声破壁后,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物的表达形式。结果成功构建pQE80L-GLIPR-2载体;经IPTG的诱导,GLIPR-2可与RGS·His以融合蛋白的形式高效表达。经Western blot鉴定,pQE80L-GLIPR-2在原核内表达产物相对分子质量为18000,与预期融合蛋白大小一致。对表达产物可溶性分析表明,表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达。结论成功构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达可溶性目的蛋白,为进一步研究GLIPR-2基因的功能和意义奠定了基础。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

普氏立克次体120kDa表面抗原C段基因的克隆与表达

采用PCR方法 ,从普氏立克次体基因组中扩增出 1 2 0kDa表面抗原C段基因片断 ,并将其克隆于原核表达载体pQE30 ,构建重组质粒pQE30 6 7,将重组质粒转入大肠杆菌M1 5 ,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达。SDS PAGE分析发现重组质粒转化菌产生了一 6 7kDa重组蛋白 ;在免疫印迹分析中 ,该 6 7kDa重组蛋白与普氏立克次体免疫血清发生特异反应 ,显示 6 7kDa重组蛋白具有普氏立克次体 1 2 0kDa表面抗原特性     

结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTB)lhp和基因原核表达载体并进行表达。方法：用PCR扩增MTB lhp基因，并克隆入pQE30质粒。测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建pQE30—CFP10和pET32a( )—CFP10重组体。结果：以重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—CFP10未表达目的蛋白；而pET32a( )—CFP10则表达出Mr为20000左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高：表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的38%，用Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为93%的重组蛋白。结论：成功地构建原核表达载体pET32a( )—CFP10，并获得重组CFP10蛋白，为MTB重组抗原的应用奠定了基础。     

HCV复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性分析

目的构建丙型肝病炎病毒（HCV）截短C基因和多表位基因重组原核表达质粒，表达纯化融合蛋白，分析其免疫原性和抗原性。方法PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCVE2区模拟表位与NS3～NS57个表位基因Em；分别将Ct、Em克隆人原核表达质粒pQE30，筛选阳性重组质粒pQE30-CtEm，转化E．coli M15，IPTG诱导融合蛋白表达，薄层扫描分析表达蛋白；可溶性分析后用Ni^2＋-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白；Westernblot分析纯化蛋白的特异性和抗原性；纯蛋白免疫小鼠后分析其免疫原性。结果成功构建了HCV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pQE30-CtEm，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni^2＋-NTA纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论HCV复合多表位抗原基因融合蛋白可高效表达并得到纯化，该融合蛋白可作为HCV诊断抗原，也为丙型肝炎新型疫苗的研究提供了靶抗原。     

HPV-16 E1蛋白的表达、纯化及其抗体制备

目的:在原核细胞中表达、纯化人乳头状瘤病毒16型(HPV-16)E1蛋白并制备HPV-16 E1特异性抗体。方法:PCR扩增HPV-16 E1基因,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度与IPTG浓度优化HPV-16 E1蛋白可溶性表达的条件,并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下及足垫免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot检测血清效价和特异性。结果:酶切和测序结果表明HPV-16 E1基因已克隆入pMAL-p2x。经优化筛选出HPV-16 E1融合蛋白诱导表达的最佳条件为28℃,IPTG浓度0.5 mmol/L。经麦芽糖亲和层析法纯化获得了HPV-16 E1可溶蛋白,纯度达到95.7%。West-ern blot检测证明制备的抗血清能与HPV-16 E1蛋白特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到1∶640 000以上。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得了HPV-16 E1蛋白,该蛋白免疫新西兰白兔制备了高效价的HPV-16 E1蛋白抗血清,为HPV-16 E1功能研究提供了抗原和检测用抗体。     

Prokaryotic expression, purification and identification of VEGFR2 D3.4/GST fusion protein in E.coli

AIM: To construct a prokaryotic expression vector for the expression of VEGFR2 D3.4/GST fusion protein, Express and purify the fusion protein. METHODS: The coding sequence of the third and fourth extracellular domain of human VEGFR2 gene fragment was synthesized and subcloned into pGEX4T-1 vector downstream of the GST fragment, an E.coli expression vector, to construct a recombinant plasmid pGEX4T-VEGFR D3.4. Then the plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) pLysS and induced to express fusion protein VEGFR2 D3.4/GST with IPTG. The expressed protein was purified by washing in urea and detected by SDS-PAGE and Western blot. RESULTS: SDS-PAGE analysis showed that a novel protein with the expected molecular mass (M(r);) about 46 000 was expressed with the inducement of IPTG. And it existed mostly in the form of inclusion body. Grayscale scanning showed that the expressed VEGFR2 D3.4/GST fusion protein accounted for 38.6% of the total bacterium protein. After the purified product was washed by urea, its purity reached 87.1%. Western blot confirmed the recombinant protein was VEGFR2 D3.4/GST fusion protein. CONCLUSION: High purification VEGFR2 D3.4/GST fusion protein is obtained through the E.coli expression system.     

血管生成抑制因子arresten基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中进行表达。方法:利用聚合酶链式反应(PCR), 由我们构建的重组质粒pGEM-Arr中扩增出arresten基因;采用基因重组技术, 将该基因定向克隆于原核表达载体pRSET中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 用IPTG诱导表达, 并对表达产物行SDS-PAGE分析。结果:酶切鉴定和DNA测序证实arresten基因正确地插入表达载体中。重组arresten在大肠杆菌中获得高效表达, 其分子量约为26kD, 表达量约占菌体总蛋白量的30%。结论:Arresten基因原核表达载体的成功构建和重组arresten蛋白在大肠杆菌中的高效表达, 为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白原核载体的构建及表达

目的：构建蛋白质转导结构域（protein transduciton domain,PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶（targeted ribonuclease,TR）融合蛋白的原核表达载体。并在大肠杆菌中表达。方法：将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因，乙肝病毒核心蛋白（HBVcore protein,HBVc)基因，人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素（human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因，克隆入含PTDTAT的pTAT原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）LysS内，以I：PTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果：成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体，并在IPTG诱导下获得特异性表达。结论：Tat-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建。为体内应用靶向核酸酶治疗乙型肝炎奠定了基础。     

人类组氨酰tRNA合成酶类似物的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人类组氨酰tRNA合成酶类似物蛋白，制备多克隆抗体。 方法： 设计引物扩增其开放阅读框，重组入原核表达载体pQE30,并在大肠杆菌M15中诱导表达; 应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔。 结果： ①成功构建人类组氨酰tRNA合成酶类似物的原核表达载体；②经Ni亲和层析获得纯度较高的重组蛋白；③制备了高滴度的兔抗人类组氨酰tRNA合成酶类似物蛋白的多克隆抗体。 结论： 原核表达载体的构建、重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备为今后研究该蛋白的功能提供了良好的基础。     

HPV16 L1基因的原核表达及免疫反应性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白L1，并鉴定其免疫反应性。方法：将HPV-16L1基因克隆人原核表达载体pThioHisC中，构建重组表达载体。以重组载体分别转化大肠杆菌Top10和DH5α，在IPTG诱导下表达外源基因，用SDS—PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析。结果：构建了HPV—16L1基因的原核表达质粒pThioHisC／HPV—16L1，并在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)约为70800的蛋白。表达的蛋白能与抗HPV—16L1抗体发生特异性反应。结论：在原核细胞中成功地表达HPV—16L1基因，为HPV—16L1疫苗的研制提供了必要的基础。