实验性脑出血后水通道蛋白4的表达变化

背景:水通道蛋白4可能是导致脑水肿形成的重要调节因素之一,但水通道蛋白4是否参与脑出血后脑水肿的形成尚未见报道。目的:观察出血性脑水肿病理过程中水通道蛋白4的表达情况,探讨其与脑水肿形成的关系。设计:随机对照动物实验。单位:广西壮族自治区人民医院神经内科和重庆医科大学神经生物学研究室。材料:实验于2003-04/2003-10在重庆医科大学生物学实验室完成。选择健康Wistar大鼠120只,雄性,体质量250～300g,由重庆医科大学实验动物中心提供。方法:实验分为4部分,每部分(n=30)均随机分为对照组(n=5)和手术组(n=25),并将手术组进一步分为出血后6h,1d,3d,5d,7d共5个时相组(n=5)。手术组大鼠麻醉后将定量胶原酶注入脑左侧尾状核建立脑出血模型;对照组只进针不注胶原酶。造模成功标准:将大鼠尾巴提起,瘫痪侧前肢回收后屈曲于腹下,正常侧前肢向地面伸展。实验分为以下4个部分:①采用免疫组化检测水通道蛋白4蛋白的表达。②采用原位杂交法检测水通道蛋白4mRNA的表达。③采用反转录-聚合酶链反应检测水通道蛋白4mRNA的表达。④应用电镜观察大鼠脑水肿的病理改变。主要观察指标:①各组大鼠水通道蛋白4mRNA及其蛋白的表达水平。②造模大鼠脑水肿区的病理改变。结果:手术组大鼠均造模成功,全部大鼠均进入结果分析,无脱失。①各组大鼠水通道蛋白4mRNA及其蛋白的表达水平比较:对照组大鼠水通道蛋白4的表达无明显改变。与对照组相比,手术组大鼠脑出血后6h,水通道蛋白4mRNA和蛋白在脑水肿区表达增强;至第3天,水通道蛋白4mRNA和蛋白的表达达到高峰;1周后,水通道蛋白4的表达仍显著高于对照组(t=12.65,P<0.01)。②脑水肿形成过程中水通道蛋白4mRNA和蛋白的关系:水通道蛋白4mRNA和蛋白的表达呈高度正相关(r=0.8281～0.9821,P<0.01)。③手术组大鼠脑水肿区相应的病理改变:在脑出血后1～3d内为逐渐加重的细胞内水肿,到第3天,脑水肿进一步加剧,出现血管源性水肿,而且有部分组织变性和坏死。结论:脑出血后水通道蛋白4表达明显增强,提示水通道蛋白4可能参与了出血性脑水肿的发生发展过程。抑制水通道蛋白4的表达可能是防治脑水肿的一种有效途径。     

脑出血后水蛭素干预对水通道蛋白4表达的影响

目的:在脑出血后不同时段应用凝血酶抑制剂水蛭素干预,观察其对脑水肿、水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)及其mRNA表达的影响。方法:将40只健康雄性大鼠随机分为4组,每组10只,采用自体动脉血注入尾状核法制成大鼠脑出血模型,其中1组作为对照组,造模后不予水蛭素干预,另3组分别于造模后6h、12h、18h在血肿内注入水蛭素进行干预,32h后提取脑组织,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AQP4mRNA在脑水肿组织的表达,并采用Western blot和免疫组化检测AQP4蛋白在脑水肿组织中的表达,同时用干重、湿重法计算脑组织含水量来表示脑水肿程度。结果:与对照组相比,凝血酶抑制剂水蛭素能减轻脑出血后脑组织的水肿程度,并降低脑组织中AQP4mRNA及AQP4蛋白的表达,在6h和12h干预组中其抑制作用最为明显(P<0.05),且AQP4mRNA及AQP4蛋白的表达减少与脑水肿变化趋势一致。18h干预组的脑水肿程度、AQP4mRNA及AQP4蛋白的表达虽有低于对照组的趋势,但差异无统计学意义。结论:脑出血后,凝血酶抑制剂水蛭素能减少脑组织水肿的程度、降低AQP4mRNA和AQP4蛋白的表达,水蛭素干预组中以6h及12h干预组的作用最为明显。     

七叶皂苷对心肺复苏后大鼠脑水肿期脑水通道蛋白4 mRNA变化的作用

目的：观察大鼠心肺复苏后脑水肿期大脑皮质水通道蛋白4（AQP4）mRNA表达的变化及七叶皂苷的治疗作用。方法：采用窒息法制备心搏骤停大鼠模型，制备成功后进行相应复苏（复苏组）；达到自主循环恢复（ROSC）标准后，药物组即刻经颈动脉插管推注七叶皂苷（药物组）；对照组除不进行窒息／复苏外，其余操作同复苏组。于ROSC后0．5、3、6和12h用干／湿比重法测定各组脑组织含水量；用半定量逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）测定各组大脑皮质AQP4mRNA变化。结果：复苏组ROSC后AQP4mRNA表达随脑组织含水量的增加而上升，与对照组比较差异均有显著性（P〈O．05或P〈O．01），且两者呈正直线相关（r=0．681，P〈0．01）；药物组脑组织含水量和AQP4mRNA表达在ROSC后0．5h和3h显著增高（P〈O．05或P〈O．01），但在6h和12h明显回落，与对照组比较差异均无显著性（P均〉0．05）。结论：心肺复苏后脑水肿的发生与AQP4mRNA表达上调有关；七叶皂苷具有减轻复苏后脑水肿、调节AQP4mRNA表达的作用，可能是其抗脑水肿作用的机制之一。     

大鼠脑内注射凝血酶后水通道蛋白4的表达变化

目的：观察大鼠脑内注射凝血酶后水通道蛋白4表达及脑水肿的变化以及水通道蛋白4表达与血脑屏障通透性之间的关系，分析凝血酶对水通道蛋白4表达的影响。方法：实验于2005-01／1l在哈尔滨医科大学第一临床医学院中心实验室完成。取雄性Wistar大鼠90只应用数字表法随机分为6组（n=15），注凝血酶6，24，72h，5，7d组及假手术组：除假手术组外，各组大鼠脑右尾状核内注射凝血酶10U（50μL）。各组大鼠在相应时间点处死，假手术组在术后2h处死，分别进行注射点周围免疫组织化学染色和血脑屏障通透性、脑组织含水率的测定。应用伊文思蓝测定血脑屏障通透性，应用干湿重法测定脑含水率，免疫组织化学染色结果应用阳性细胞计数法评估。 结果：90只大鼠全部进入结果分析。①水通道蛋白4染色阳性细胞数：注凝血酶6h组即高于假手术组[（39．53&;#177;2．07），（18．40&;#177;1．24）个／视野，P〈0．011，注凝血酶24h组达到高峰，为（51．93&;#177;1．67）个／视野，随后下降，注凝血酶7d组仍高于假手术组[（21．60&;#177;1．45）个／视野，P〈0．01]。②脑组织含水率：注凝血酶6h组即高于假手术组（P〈0．01），注凝血酶24h组达到高峰，随后下降，注凝血酶7d组仍高于假手术组（P〈0．01）。③脑组织伊文思蓝含量：注凝血酶6h组即高于假手术组（P〈0．01），注凝血酶24h组达到高峰，随后下降，注凝血酶7d组仍高于假手术组（P〈0．01）。 结论：脑内注射凝血酶，可导致注射点周围水通道蛋白4表达的增加，其变化趋势与脑组织含水率、血脑屏障通透性的变化相一致。提示水通道蛋白4参与了大鼠脑内注射凝血酶后的脑水肿形成，其变化可能是凝血酶破坏了血脑屏障完整性的结果。     

地塞米松对大鼠脑水通道蛋白4表达的影响

脑出血在临床上有极高的病死率，主要死因为大脑水肿后引起颅内压增高导致脑疝，因此，及时治疗脑水肿对降低脑出血病死率有重要意义。目前许多研究表明，水通道蛋白4（AQP-4）与脑水肿的发生发展密切相关，脑出血后周围水肿区的AQP-4蛋白表达增加，3d达到高峰后逐渐下降。而临床上用糖皮质激素（GC）治疗脑水肿一直存在争议。     

水通道蛋白4基因沉默与体外培养星形胶质细胞的形态生长及其增殖效应

目的：研究短发夹环质粒载体对体外培养的星形胶质细胞水通道蛋白4表达的基因沉默效果。 方法：实验于2003-12／2005-05在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。实验动物为SPF级Wistar新生3d大鼠20只，进行大鼠星形胶质细胞分离、培养。实验使用传至第三代的星形胶质细胞。构建特异性抑制水通道蛋白4表达的短发夹环质粒载体水通道蛋白4RNAi pGenesil-2，将体外培养的星形胶质细胞分为水通道蛋白4基因沉默组、水通道蛋白4基因沉默对照组、脂质体组和正常对照组，运用脂质体法转染质粒载体，分别于转染后2，3，5，7d通过观察细胞形态和数量的改变，应用反转录-聚合酶连反应、免疫组织化学分别检测水通道蛋白4mRNA和蛋白的表达，水通透实验验证水通道蛋白4基因沉默后星形胶质细胞的水通透功能。 结果：星形胶质细胞水通道蛋白4基因沉默后，水通道蛋白4mRNA及蛋白的表达呈进行性减少，至第7天水通道蛋白4mRNA和蛋白表达水平分别减少了（80．12&;#177;1．01）％和（80．2&;#177;2.54）％，细胞数量减少约60％，星形胶质细胞从扁平和多角形变成类纤维形胶质细胞。水通透实验证实经水通道蛋白4基因沉默的星形胶质细胞体积增大的速度慢于正常星形胶质细胞。 结论：构建的水通道蛋白4基因沉默pGenesil-2质粒载体可抑制星形胶质细胞水通道蛋白4的表达；水通道蛋白4参与星形胶质细胞快速水转运过程；水通道蛋白4也对维持体外培养的星形胶质细胞形态、生长、增殖起重要作用。     

水通道蛋白4在创伤性脑水肿中的表达及其对血脑屏障通透性的影响

目的探讨水通道蛋白4（AQP-4）在大鼠创伤性脑水肿中的表达及其对血脑屏障（BBB）通透性的影响。方法按照改进的Feeney自由落体撞击法建立大鼠创伤性脑损伤（TBI）模型,用磁共振成像（MRI）对大鼠脑水肿进行检测,干／湿比重法和伊文思蓝（EB）测定法观察大鼠TBI后不同时相脑组织含水量和BBB通透性的变化,并采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测AQP-4 mRNA的表达,蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测AQP-4蛋白的表达。结果TBI后MRI表现为T1WI的低信号或等信号、T2WI高信号。TBI后4h伤区脑组织含水量及EB含量开始增多,AQP-4 mRNA、AQP-4蛋白表达开始增高并逐渐上升,24h达到高峰,随后逐渐下降,伤后72h仍维持在较高水平（P〈0．05）。AQP-4 mRNA、AQP-4蛋白表达与脑组织的含水量及EB含量呈正相关。结论创伤性脑损伤后早期AQP-4 mRNA、AQP4蛋白表达的变化与血脑屏障通透性的改变及脑水肿的形成和发展密切相关。可能通过上调水通道蛋白AQP-4的表达,增加血脑屏障的通透性,参与脑水肿的形成。     

顿抑心肌中腺嘌呤核苷酸转运体基因的动态表达

目的：通过观察大鼠心肌缺血再灌注模型中腺嘌呤核苷酸转运体（adenine nucleotide translocator，ANT）的动态表达情况，初步探讨顿抑心肌中ANT各单体的表达变化对心肌能量代谢的影响及其与心肌细胞凋亡的联系。 方法：实验于2003—11／2004-04在解放军南京军区南京总医院心脏内科实验室和动物实验中心完成。将60只雄性SD大鼠随机分为对照组（n=8）和手术组（n=52）。将手术组大鼠冠状动脉左前降支结扎闭塞20min，然后剪断结扎线再灌注。按缺血后再灌注4h、1,3，7d4个时相分4组进行观察（n=13）。用反转录-聚合酶链反应计算机凝胶成像分析系统测定心肌中ANT1，ANT2 mRNA相对含量。对照组大鼠不干预。 结果：60只大鼠进入结果分析。（DANT1 mRNA含量在缺血后再灌注4h达高峰（P〈0．05）。在再灌注1d开始降低，再灌注3d时明显下降（P〈0．05），逐渐恢复到对照水平（P〉0．05），再灌注7d的结果与再灌注3d相似。②ANT2mRNA含量在再灌注4h时无明显增加，在再灌注1d开始升高并达峰值（P〈0.01），从再灌注3d开始明显下降（P〈0．01），并恢复到对照水平（P〉0．05）。再灌注7d结果与再灌注3d相似。 结论：①顿抑心肌中ANT的含量增加，顿抑心肌中能量短缺的现象可在缺血后再灌注3d内得以纠正。②心肌缺血可以导致细胞凋亡，心肌细胞凋亡主要发生在缺血再灌注早期（24h内），而且在体内存在时间短暂（缺血后再灌注3d内恢复）。     

大黄素对重症急性胰腺炎大鼠小肠水通道蛋白3表达的调节作用

目的探讨重症急性胰腺炎（SAP）大鼠小肠水通道蛋白3（AQP3）的表达及大黄素的调节作用。方法将80只SD雄性大鼠随机分成假手术组（n=20）、模型组（n=30）、大黄素治疗组（n=30）。采用胰胆管逆行匀速注入牛磺胆酸钠（1ml／kg）方法制作SAP模型;假手术组给予等量生理盐水,大黄素组于制模后予大黄素灌胃（20mg&#183;kg-1&#183;d,分两次给予）,模型组及假手术组给予等量生理盐水。各组分别于制模后24、72、120h处死大鼠,留取标本,采用苏木素-伊红（HE）染色、麦芽糖苷法、免疫组化法、蛋白质免疫印迹法（Western blotting）、实时定量聚合酶链反应（PCR）技术测定胰腺病理评分、血淀粉酶、AQP3蛋白及mRNA表达。结果模型组大鼠胰腺病理评分及血淀粉酶水平均较假手术组明显升高,差异均有统计学意义（均P〈0．05）;大黄素能明显降低SAP大鼠胰腺病理评分及血淀粉酶水平（均P〈0．05）。SAP大鼠回肠黏膜AQP3蛋白及mRNA表达均较假手术组明显上调,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,且以24h时更为显著;大黄素治疗可明显下调AQP3的蛋白及mRNA表达,蛋白表达于24、72、120h,mRNA表达于24h、72h与模型组比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论AQP3可能参与了SAP的病理生理改变;大黄素治疗可通过下调AQP3的蛋白及mRNA表达,明显改善SAP病情。     

中药脑溢安改善脑出血大鼠神经元有氧化谢的药效机制

目的 通过观察脑出血大鼠诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）在星形胶质细胞中的表达及中药脑溢安的影响，探讨脑出血的机制和中药的脑保护作用。方法 100只动物按数字表法随机分成假手术组（25只）、手术组（75只）。其中手术组造模后又随机分入模型组、脑溢安治疗组、AG治疗组，每组25只。采用胶原酶复制大鼠脑出血模型，以免疫荧光双标组化法和蛋白质印迹法观察脑出血后iNOS的表达情况。结果 脑出血后，模型组大鼠表达iNOS的反应性星形胶质细胞主要是分布在基底核血肿上部周边；蛋白印迹结果明显，模型组大鼠基底核区iNOS从12h，1d阳性信号逐渐增强（t=15.3，P&;lt;0.01），4d达峰值（t=36.4，P&;lt;0.01），7d信号稍弱（t=27.73，P&;lt;0.01）；脑溢安组和氢基胍组的阳性信号较前者弱。结论 脑出血后，患侧基底核反应性星形胶质细胞中的iNOS表达增强；脑溢安可能通过抑制星形胶质细胞中的iNOS表达，实现其脑保护作用。