聚糖纳米微泡超声造影剂的制备及其超声显影效果

目的 制备聚糖纳米微泡超声造影剂,观察其基本特征及动物超声显影效果.方法 高速剪切法制备纳米微泡超声造影剂,光学显微镜和透射电镜观察纳米微泡大小、形态,马尔文粒度分析仪测粒径分布,细胞计数板计数纳米微泡,Zeta电位仪测表面电位,对比超声观察大鼠肾、心脏超声显影效果并测量声强度.结果 纳米微泡呈空心球形结构,分散均匀,形态规则,平均粒径(617±12)nm,浓度(7.2±0.6)×109/ml,Zeta电位(52.9±1.3)mV.24 h、45 d和90d三个时间点浓度、平均粒径和表面电位无明显差异(P＞0.05).用其可使小鼠肾、心脏超声显影明显增强,最大视频强度分别达(15.6±1.1)GU、(27.3±2.5)GU,可视增强持续时间(10±2)min.结论 聚糖纳米微泡稳定性和显像效果良好,有可能成为可穿过血管内皮间隙的新一代超声造影剂.     

新型液态氟碳纳米脂质微球超声造影剂的制备及显像实验研究

目的 制备液态氟碳(perfluorooctylbromide,PFOB)纳米脂质微球并探讨其对大鼠肝脾实质的超声显像效果、安全性及相关机制.方法 采用高压均质技术制备PFOB纳米脂质微球,用透射电镜观察微球形态、分布,用激光粒度和电位分析仪测定微球粒径及表面电位.经大鼠尾静脉注射微球后行超声显像,同时监测大鼠生命体征变化.肝脾实质为感兴趣区,应用DFY超声图像定量分析系统评价造影效果,建立时间一强度曲线.大鼠肝脾冰冻切片探讨微球增强肝脾超声显像的相关机制.结果 PFOB微球为实心球形结构,粒径极小且分布均匀;造影后约10 S肝实质回声增强,达峰时间约在注射微球后3～4min,持续增强约1 h;脾实质较肝实质增强时间更长,效果更显著,第2 d仍持续增强;实验过程中大鼠生命体征未见明显变化;微球在肝脾组织内大量分布聚集可能是其增强肝脾显影的机制之一.结论 PFOB微球是一种安全有效的新型超声造影剂,有潜在的开发应用价值.     

载多西紫杉醇脂质微泡超声造影剂的制备及其性质

目的 制备载多西紫杉醇脂质微泡并测定性质及观察其体内显像效果.方法 制备载多西紫杉醇脂质微泡,测定粒径、包封率等性质;观察60Co射线灭菌前后微泡性质的差异,观察超声辐照后载药微泡药物的释放,并观察其对兔VX2肝癌的显像效果.结果 载多西紫杉醇微泡的浓度为2.2×109～3.2×109个/ml;粒径分布范围为473.4～706.6 nm,平均粒径为623.1 nm;微泡的包封率为70%以上,载药量为(17.5±0.8)%;Zeta电位为-(3.1±0.9)mV;超声辐照微泡溶液后,药物可释放;静脉注射此微泡后,兔肝实质见良好、持续的增强显像,肝癌病灶可见明显的"快进快出"显影表现.结论 载多西紫杉醇脂质微泡包封率较高,性质较佳,体内显像效果好,提高了超声在肝癌等肿瘤诊断中的价值,超声辐照能促使微泡中的药物释放,有望在实时监控下体内定点靶向给药,实现对肿瘤的靶向治疗.     

去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向纳米脂质超声造影剂的制备及体外实验

目的 以肝细胞膜特异性受体去唾液酸糖蛋白受体为靶向受体,利用共价结合的原理,制备出肝靶向性液态氟碳纳米超声造影剂,观察该造影剂的一般特性、与人肝细胞L02的靶向结合及体外聚集显像效果.方法 利用还原胺法制备去唾液酸糖蛋白特异性配体半乳糖化多聚赖氨酸(Gal-PLL);利用旋转蒸发及声振法制备液态氟碳纳米脂质超声造影剂;培养人肝细胞L02,于不同时间点观察与L02细胞的靶向结合;Philips iU 22超声诊断仪L12-5探头对比观察靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂的体外显像效果.结果 靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂粒径极小,分布均匀,形态呈圆球形,且能与L02有效结合;体外乳胶囊显示:脱气水侧呈现无回声,靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂侧呈现高回声.结论 以去唾液酸糖蛋白受体为靶向受体,自制的携半乳糖化多聚赖氨酸的靶向液态氟碳纳米脂质超声造影剂能有效与人肝细胞LO2靶向结合,该靶向超声造影剂能在体外聚集显影.该靶向超声造影剂粒径极小,是细胞水平上肝靶向性超声分子显像的一种理想的超声分子探针.

Abstract：

Objective To prepare the liver targeting nano-liquid perfluorocarbon ultrasound contrast agent and observe its general characteristics;to observe the targeting combined effects of the human liver cells L02 and the targeted ultrasound contrast agent ;to evaluate the gathering imaging effects of the targeted ultrasound contrast agent. Methods Amine method was used to prepared asialoglycoprotein Gal specific ligand polylysine (Gal-PLL), rotary evaporator and sonicated liquid fluorocarbon were used to prepare nano lipid ultrasound contrast agent. Human liver cell L02 were cultured, the combined effects were observed according to the reacting time of the cells and the targeted nano-lipid ultrasound contrast agent. The nanolipid ultrasound contrast agent and the degassed_ water_ were loaded into cysts and their ultrasound imaging effects were observed by ultrasound diagnostic apparatus Philips iU22. Results The particle size of the liquid fluorocarbon nano-targeted lipid ultrasound contrast agent was extremely small, uniform, cylindrical and spherical. The cysts in vitro showed that the side of the targeted liquid perfluorocarbon nano-lipid ultrasound contrast agent showed high echo. Conclusions The targeted liquid perfluorocarbon nano-lipid ultrasound contrast agent can be effectively targeted to the human liver cells L02 due to carrying home-made Gal-PLL. The targeted ultrasound contrast agents can be imaging by ultrasound and be confirmed in vitro.The size of the contrast agent was small, therefore, it can be considered an ideal ultrasonic molecular probe and achieve the ultrasound molecular imaging in cell level.     

纳米级超声微泡造影剂的制备及其性状的初步研究

目的制备适用于超声诊断的纳米级超声微泡造影剂,并对其性状进行初步研究。方法通过低速离心分级分离法制备纳米级的脂膜超声微泡,检测微泡大小形态、表面电位、粒径、分布,测试其与抗体结合情况,体外初步测试其增强显像效果。结果微泡呈圆形,分布均匀,粒径均值为623.4nm;微泡表面电位均值1.3mV,与抗体结合情况良好,体外初步测试能明显增强显像效果。结论通过低速离心分级分离法可以制备纯度较高的纳米级超声微泡,为超声造影剂的小型化和靶向性发展提供重要的工作平台。     

自制脂质体超声纳米微泡的特性和显影效果

目的　测定自制纳米级脂质体超声微泡造影剂(nano-liposomal bubble,NB)的基本特性.方法　采用逆向蒸发法制备脂质体,用声震法制备NB后观察其形态,检测其平均粒径、表面电位及浓度等物理特性;在脱气水中分别注入生理盐水、NB及SonoVue (200μl),观察显影效果;分别经兔耳缘静脉团注生理盐水、NB及SonoVue (2.0 ml/kg),动态观察兔心脏及肝的增强情况.结果　镜下观察,NB粒径范围133.1～199.5 nm,平均粒径为(171.60±30.82)nm,平均电位为- (1.92±0.65)mV,分布均匀,浓度为(3.8～5.6)×108/ml.常温下造影剂放置1周、1月后观察,基本特性无明显改变.体外显影结果显示:NB与SonoVue一样具有显著的显影效果.体内造影后观察:NB与SonoVue均能明显增强兔心脏及肝的二维灰阶显像.结论　NB性质稳定,形态好,粒径均一,具有良好的显影效果.由于其粒径小且基于脂质体基础上易被修饰,因此在超声分子影像及基因/药物传递方面具有广阔的应用前景.     

靶向纳米脂质超声造影剂制备及其体外寻靶能力实验研究

目的 制备一种靶向乳腺癌的纳米脂质超声造影剂,并观察其体外寻靶能力.方法 制备生物素化抗人乳腺癌细胞单克隆抗体Neu(F-11),并检测其生物素化程度和活性;通过生物素-亲和素系统制备靶向纳米脂质超声造影剂,用免疫荧光染色定性检测造影剂与抗体的连接情况,通过靶向造影剂与不同细胞的结合实验检测其寻靶能力.结果 每分子抗体可结合的生物素数目平均为7个,生物素化抗体的活性与游离单抗相比未见明显降低;免疫荧光染色显示靶向纳米脂质超声造影剂表面可见明亮的红色环状荧光,细胞结合实验显示其可与乳腺癌细胞特异性牢固结合.结论 生物素-亲和素系统可使造影剂与抗体牢固结合,所制得的靶向纳米脂质超声造影剂在体外具有较强的寻靶能力.     

以HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂的制备及实验研究

目的 制备以HER2受体为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,并观察其体外寻靶能力及体外超声显像效果.方法 制备生物素化Herceptin单抗,检测其生物素化程度及生物学活性;薄膜水化-声振法制备生物素化纳米微泡,以生物素-亲和素为桥梁制备HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,观察其对SKOV3卵巢癌细胞的体外寻靶能力及靶向结合的体外超声显像.结果 平均每分子Herceptin单抗可与16个生物素分子结合;与游离单抗相比,生物素化抗体的活性未见明显降低(P＞0.05).体外寻靶实验观察:靶向纳米微泡组SKOV3细胞表面有明显的红染纳米微泡与其牢固结合,沿细胞表面排列较规则;非靶向组SKOV3细胞表面未结合红染的纳米微泡.靶向纳米微泡体外超声显像:细胞爬片与靶向纳米微泡孵育后可明显增强超声显像效果,对照组均未见明显超声显像.结论 应用生物素-亲和素系统成功构建了以HER2为靶点的纳米级超声造影剂,与SKOV3细胞结合后有明显超声显像效果.     

纳米级脂质微泡超声造影剂肿瘤被动靶向研究

目的 观察纳米微泡通过肿瘤血管内皮间隙实现被动靶向的可行性.方法 20只SKOV3细胞皮下种植荷瘤裸鼠分为A组(超声显像组10只)及B组(冰冻切片组10只,再分为B1组及B2组).制备DiI标记的纳米微泡及微米微泡并调整至相同浓度.A组:各裸鼠先后经尾静脉注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(35μl/只,间隔1.5h),分别进行超声显像观察.B组;B1组及B2组各裸鼠分别注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(约10μl/只),1.5h后对裸鼠进行心脏灌注后切取肿瘤组织及肌肉组织进行冰冻切片、Hoechst核染,激光共聚焦显微镜下观察不同微泡在两组织中的滞留情况.结果 超声显示:纳米微泡组达峰时间及消退时间均长于微米微泡组,而峰值强度低于微米微泡组.冰冻切片观察;纳米微泡组肿瘤细胞周围见明显红色荧光聚集,微米微泡组肿瘤、肌肉组织中及纳米微泡组肌肉组织中均未见明显红色荧光.结论 纳米级脂质微泡可通过肿瘤血管内皮间隙,即实现了肿瘤被动靶向.     

超声微泡对射频消融效果影响的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂对射频消融效果的影响及应用价值.方法 对20只活体兔肝分别以无造影剂及术中造影行射频消融术,评价气化区显示效果和消融时间,并测量气化区、术后造影缺损区及大体病理的大小,分析其相关性.结果 加入微泡造影剂不影响射频消融的范围,但气化区形态更规则稳定,而且与凝固灶范围呈高度相关,同时可使施加射频时间明显缩短.结论 射频消融中加入微泡造影剂有助于识别消融区范围,可预防消融区周围脏器及血管受损.     

超声造影剂在肝癌基因治疗中的靶向性实验研究

目的 探讨结合了肝细胞配体的超声造影剂在超声辐照下介导目的 基因转染肝癌细胞的可行性,寻找一种新的基因靶向导入方法.方法 制备肝细胞表面特异性配体半乳糖基化多聚赖氨酸(GPLL),并对产物进行红外光谱分析.将c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)、G-PLL与SonoVue微泡三者偶联,在超声波介导下,促使c-myc ASODN转染人肝细胞癌SMMC-7721细胞及肺腺癌A-549细胞(作对照),实验结束后行半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以观察不同组问c-myc基因的表达情况.结果 超声介导微泡破裂可增加c-myc ASODN在SMMC-7721细胞和A-549细胞中的表达;SMMC-7721细胞加入G-PLL组中c-myc基因表达水平显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01),而A-549细胞中加入与未加入G-PLL组间c-myc基因表达量的差异无统计学性意义(P＞0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂的方法可促进基因的转染,而超声联合肝细胞受体介导的微泡造影剂则更具有肝细胞靶向性,能有效地促进目的 基因在肝癌细胞中的表达,为肝癌基因治疗提供了新的途径.     

不同剂量微泡造影剂在高强度聚焦超声消融活体羊肝组织中的增效效应

目的 探讨不同剂量超声造影剂对高强度聚焦超声(HIFU)消融活体羊肝组织的增效效应.方法 南疆黄羊20只,随机分为4组.第1组为HIFU联合0.01 ml/kg SonoVue.第2组为HIFU联合0.03 ml/kg SonoVue,第3组为HIFU联合0.05 ml/kg SonoVue,第4组为单纯HIFU组.麻醉状态下,微泡造影剂于HIFU辐照前静脉团注,20 s后开始HIFU辐照.每组采用定点辐照,所用辐照参数为频率0.8 MHz、声强19 100 W/cm2、辐照深度30 mm、辐照时间15 s.HIFU辐照结束后1周处死动物.观察并测量凝同性坏死大小,对凝固性坏死作组织病理分析.结果 在相同声辐照参数下,1、2、3组凝同性坏死区域均大于第4组,差异有统计学意义(P<0.05),且凝固性坏死体积随SonoVue剂量的增加而逐渐增大,差异有统计学意义(P<0.05).组织病理学检查发现凝同性坏死区内无正常组织残留.除实验3组出现消融灶邻近组织和皮肤损伤外,其余各组均未出现明显并发症.结论 微泡造影剂在HIFU消融过程中的增效效应与微泡造影剂的剂量有关,微泡造影剂的剂量越大,所形成的凝固性坏死的体积越大,增效越明显.     

超声造影评价肝纤维化的实验研究

目的 探讨超声造影评价大鼠肝纤维化的价值.方法 应用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化,在反相脉冲谐波模式下,经尾静脉团注超声造影剂,记录造影剂到达肝动脉时间(hepatic artery arrival time,HAAT)、到达门静脉时间(portal vein arrival time,PVAT)、到达肝静脉时间(hepatic vein arrival time,HVAT),并与免疫组化结果进行相关性分析.结果 S0～S4期HAAT、PVAT两两比较差异无统计学意义;S3期、S4期HVAT较So～S2期缩短(P＜0.05).HVAT与C-Ⅳ、LN免疫组化染色阳性反应面积百分比呈负相关,相关系数分别为-0.680,-0.639.结论 超声造影对于评价肝纤维化有一定的价值.     

脂质超声造影剂携半乳糖化多聚赖氨酸靶向结合HepG2细胞的实验研究

目的 探讨连接以半乳糖化多聚赖氨酸作为配体的脂质微泡超声造影剂的细胞靶向能力,为体内靶向显影及治疗肝癌寻求新方法.方法 用还原胺化法将多聚赖氨酸进行半乳糖化,人工合成小分子量的靶向配体,在室温下与自制脂质微泡发生化学结合制备成靶向脂质微泡,于荧光显微镜下观察体外靶向效果.结果 半乳糖与多聚赖氨酸在摩尔比为1:100,室温下反应24 h时,能进行高效连接;靶向脂质微泡粒径平均为2.05弘m,大小均一;激光共聚焦荧光显微镜见HepG2肝癌细胞能与靶向造影剂特异性结合.结论 连接有以半乳糖化多聚赖氨酸为靶向配体的脂质微泡在HepG2肝癌细胞的内吞作用下能与之有效结合.     

Analysis of different contrast enhancement patterns after microbubble-based contrast agent injection in liver hemangiomas with atypical appearance on baseline scan

Background We describe different possible enhancement patterns in liver hemangiomas with atypical appearance on baseline ultrasound after microbubble-based contrast agent injection. Methods From a series of 253 consecutive lesions that were indeterminate on baseline ultrasound and then scanned after injection of air-filled microbubble contrast agent, 65 focal liver lesions were retrospectively selected on the basis of a diagnosis of liver hemangioma on multiphase contrast-enhanced computed tomography (n = 23), magnetic resonance imaging (n = 27), or histology (n = 15). Each lesion was scanned during arterial phase (30 s after microbubble injection) and late phase (5 min after injection). On-site sonologists performed retrospective assessment of contrast-enhancement patterns by consensus. Results Centripetal fill-in preceded (n = 50) or not preceded (n = 3) by peripheral nodular/rim-like enhancement was the prevalently observed contrast-enhancement pattern, equivalent to the typical enhancement pattern of liver hemangiomas on contrast-enhanced computed tomography or magnetic resonance imaging. In the remaining lesions, additional enhancement patterns (diffuse contrast enhancement with rapid fill-in and a late hyper-isoechoic appearance, n = 6; peripheral nodular enhancement with a late hypoechoic appearance, n = 3; or persistent heterogeneous and hyperechoic appearance, n = 3) were observed. Conclusion Different contrast-enhancement patterns are possible in atypical liver hemangiomas after microbubble injection. Typical centripetal fill-in is the prevalent pattern and its evidence allows diagnosis.     

自制纳米级超声微泡体外基本特性和肿瘤造影增强显影的实验研究

目的 探讨自制纳米级超声微泡的体内基本特性及体内造影增强显影效果.方法 机械振荡与低速离心法结合制备纳米级微泡,并对微泡粒径大小、分布、微观形态和稳定性进行研究.同时在裸鼠肝、肾及前列腺癌皮下移植瘤进行超声造影实验,与常规微米级造影剂对比造影效果.结果 所制备的微泡形态圆整,大小均一性较好,分布均匀无聚集,平均粒径(580.6±36.3)nm.该纳米级微泡能显著增强裸鼠肝肾及皮下移植瘤显影,与常规造影剂比较,不但增强强度相当,且显影时间显著延长.结论 自制纳米级超声微泡造影剂各项物理特性符合纳米级超声造影剂的要求,体内增强效果和稳定性较强,为下一步纳米级微泡在肿瘤显像和治疗中的应用提供实验依据.     

纳米级超声造影剂制备及成像的实验研究

目的 探讨纯度较高的纳米级超声微泡造影剂的理化性质及体内成像效果.方法 机械振荡法与低速离心法结合制备纳米级微泡,观察微泡形态,检测其平均粒径,并观察其增强正常兔肝显影的情况,并与微米级微泡造影剂进行比较.结果 光镜以及透射电镜观察,微泡呈圆形,分布均匀,无聚集现象.Zeta SIZIER 3000测定微泡粒径均值为623.4 nm,微泡表面电位均值1.3 mV.注射纳米级造影剂于新西兰大白兔体内能持续增强肝的显像效果,与微米级造影剂对比无明显差异.结论 纳米级的微泡造影剂大小合理,分布均匀,显像效果强,为下一步研制小型化靶向造影剂奠定了基础.     

应用超声造影评估慢性肝炎患者肝纤维化分期的研究

目的 探索超声造影无创评估肝纤维化分期的可行性,并评价相关指标的诊断价值.方法 对86例慢性肝炎患者行肝超声造影,以肝穿刺活检作为金标准进行对照.取部分肝实质为感兴趣区,通过时间强度曲线计算门静脉-肝动脉曲线下面积比(Qp/Qa)、门静脉-肝动脉灌注强度比(Ip/Ia)、肝实质灌注下降速率(β)和门静脉主干灌注时间(Tp).用单因素方差分析研究不同肝纤维化分期患者上述参数的变化,Spearman秩相关分析上述参数与肝纤维化分期的关系,ROC曲线分析各参数的诊断价值.结果 随着肝纤维化程度增加,Tp、β逐渐增加,Ip/Ia和Qp/Qa逐渐减少,各组间差异有统计学意义(P＜0.05),且上述参数与肝纤维化分期显著相关(P＜0.05).分期为≥S1,≥S2,≥S3,S4时Ip/Ia的ROC曲线下面积分别为0.931,0.884,0.820,0.846.分期为≥S1,≥S2,≥S3,S4时Qp/Qa的ROC曲线下面积分别为0.914,0.813,0.845,0.869.结论 根据肝实质超声造影时间强度曲线计算的参数Tp、Ip/Ia、Qp/Qa和β与肝纤维化分期相关,其中Ip/Ia和Qp/Qa可作为超声造影无创评估肝纤维化分期的新指标.