人phb1基因在哺乳动物细胞株中的转染定位和表达

目的 构建带Flag标签的phb1真核表达载体,将其转染至COS7细胞中观察phb1蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其表达.方法 以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,连接至T载体,构建pUCm-T-phb1,Kpn Ⅰ和EcoR I双酶切后插入真核表达载体pCDNA3中,将重组表达质粒pCDNA3-Flag-phb1转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.转染至HEK2931、细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测.结果 经测序鉴定,成功构建了真核表达载体pCDNA3-Flag-phb1,转染后荧光显微镜观察phb1在COS7细胞中主要定位于胞质;经Western blot检测phb1基因在HEK293T细胞中能够有效表达.结论 实验结果为进一步了解phb1的功能打下了基础.     

PAM14的细胞转染表达和定位

目的构建带GFP标签的PAM14表达载体,将其转染至HEK293T细胞检测其表达,转染至COS7细胞观察PAM14蛋白在细胞内的定位。方法以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pACT2-PAM14为模板,用PCR方法扩增PAM14全长序列,然后插入带GFP标签的载体pCDGFP中构建表达载体pCDGFP-PAM14,将构建的质粒转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western-blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了表达载体pCDGFP-PAM14,此表达载体在HEK 293T细胞中能够有效表达,转染表明PAM14在COS7细胞主要在核内表达,胞质内也有少量表达。结论实验结果为进一步了解PAM14的功能提供了一定的基础。     

人COX6B1在哺乳动物细胞株中转染表达与定位的初步研究

目的构建带FLAG标签的人野生型细胞色素氧化酶亚基COX6B1表达载体,转染至HEK 293T、COS7细胞观察COX6B1蛋白在细胞内表达与定位。方法以含人COX6B1全长cDNA序列的质粒为模板,通过上游带有FLAG标签的引物,PCR方法扩增出COX6B1全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3.1中构建pCDNA3.1-FLAG-COX6B1表达载体。将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了pCD-NA3.1-FLAG-COX6B1表达载体,其在HEK 293T细胞中能有效地表达;在COS7细胞中呈斑点状分布,且主要在胞质内分布,细胞核中未见其明显表达。结论 COX6B1在HEK293T、COS7细胞中均有表达,且主要分布在胞质内,这为进一步了解COX6B1的功能提供了一定的基础。     

PAM14缺失突变体在哺乳动物细胞中的表达和定位

目的 构建带HA标签(标签序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇)的PAM14缺失突变体PAM14-N和PAM14-C的真核表达载体,将其分别转染至COS7细胞中观察PAM14-N和PAM14-C蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其是否表达.方法 以含人PAM14全长cDNA序...     

人MT2A基因在哺乳动物细胞株中的定位与表达

目的 用基因克隆方法构建带FLAG-tag的人金属硫蛋白2A(MT2A)真核表达载体,用其转染HEK 293T,COS-7细胞观察MT2A在增殖细胞内的表达和定位.方法 设计带FLAG-tag的引物,以人MT2A全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增MT2A全长序列,然后插入pCDNA 3.1中构建pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;脂质体法转染至COS-7细胞,荧光显微镜下观察MT2A表达的蛋白在细胞内定位.结果 正确构建了pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;其在HEK 293T细胞中能有效地表达;免疫荧光实验表明在COS-7细胞中,MT2A主要分布在细胞质内.结论 该研究结果为了解MT2A 在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础.     

孕酮诱导的蜕膜蛋白Depp在哺乳细胞株的转染表达与定位

目的 将孕酮诱导的蜕膜蛋白Depp基因构建到pCDGFP表达载体中,分析其在哺乳细胞株中的表达和定位情况.方法 用PCR方法扩增Depp全长序列,插入真核表达载体pCDGFP中,将构建好的质粒转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位;转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,利用GFP抗体进行Western bl...     

跨膜蛋白CMTM2在人睾丸和精子中的表达及定位

目的：通过研究跨膜蛋白CMTM2在睾丸和精子中的表达来探讨CMTM2蛋白在男性生殖系统中潜在的功能。方法：Western blot方法检测CMTM2在人睾丸及精子中的表达,免疫组织化学及组织免疫荧光方法检测CMTM2在人睾丸组织中的定位,TRITC-CMTM2及FITC-Hoechst免疫荧光双染法检测CMTM2在人精子顶体反应前后的定位。结果：CMTM2在人睾丸及精子中均有表达,在睾丸组织中CMTM2定位于各级生精细胞的细胞膜,睾丸组织冰冻切片免疫荧光检测的结果与免疫组织化学一致,进一步证实CMTM2存在于睾丸各级生精细胞的细胞膜,在精子中则定位于核后区附近。以TRITC-CMTM2及FITC-Hoechst免疫荧光双染法检测CMTM2在人精子顶体反应前后的定位,在顶体反应前后,CMTM2在人精子的定位及表达量未发生改变。结论：CMTM2在人睾丸和精子中均有表达,其表达定位具有细胞特异性和区域特异性,提示其可能在人睾丸精子发生和精卵融合过程中发挥作用,是男性不育研究的靶基因。CMTM2在男性生殖系统中的表达呈现细胞与生精区域的特异性,提示其高度参与生精功能,但目前针对CMTM2在男性生殖系统与精子生成过程中的作用仍未明确,今后可以采用体外受精 胚胎移植等技术进一步研究CMTM2的作用。     

人cystatin B基因在哺乳动物细胞株中的定位与表达

目的用基因克隆方法构建带FLAG-tag的人cystatinB真核表达载体,用其转染COS-7和HEK 293 T细胞观察cystatin B在增殖细胞内的定位;转染HEK 293 T细胞检测其表达。方法设计带FLAG-tag的引物,以人cystatin B全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增cystatin B全长序列,然后插入pCDNA 3中构建pCDNA 3-cystatin B-FLAG(CSTBF)质粒;脂质体法转染至COS-7、HEK 293 T细胞,荧光显微镜下观察其在细胞内定位;转染至HEK 293 T细胞,提取细胞总蛋白进行Western blot。结果正确构建了pCD-NA 3-cystatin B-FLAG质粒;定位实验表明在COS-7和HEK293 T细胞中,cystatin B主要分布在细胞核内,核膜处更集中,胞浆内也有广泛分布;Western blot结果表明该质粒能在细胞中有效表达。结论该研究结果为了解cystatin B在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础。     

人FKBP3在哺乳动物细胞系中的转染表达与定位

以含cDNA序列的质粒为模板,下游引物带有FLAG标签,PCR扩增,插入pcDNA3.1,成功构建C端带FLAG标签的人野生型肽基脯氨酰顺反异构酶FKBP3的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-FKBP3-FLAG.转染HEK 293T细胞,Western blot检测;转染COS-7细胞,荧光显微镜观察.FKBP3在HEK 293T、COS-7细胞中均有表达,且定位在COS-7细胞的细胞质和细胞核,胞质分布较多,为进一步研究FKBP3的相互作用蛋白和功能奠定了一定的基础.     

Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立

目的建立稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,研究Sed-lin蛋白在细胞内的分布。方法扩增SEDL基因全长编码序列,经双酶切后克隆至真核表达载体pCDGFP中,将重组表达质粒转染至HEK293细胞,用G418筛选阳性克隆,荧光显微镜和Western blot检测Sedlin蛋白的表达,并观察Sedlin蛋白在HEK293细胞中的分布。结果经测序鉴定,成功构建了SEDL基因的真核表达载体,转染HEK293细胞后,Western blot检测,证明SEDL基因能够稳定有效的表达,荧光观察显示,Sedlin蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。结论成功建立了稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,Sedlin蛋白广泛分布于整个细胞中。     

Human COX6B1 was transfected foR expression and location of the preliminary study in mammalian cell lines

目的 构建带FLAG标签的人野生型细胞色素氧化酶亚基COX6B1表达载体,转染至HEK 293T、COS7细胞观察COX6B1蛋白在细胞内表达与定位.方法 以含人COX6B1全长cDNA序列的质粒为模板,通过上游带有FLAG标签的引物,PCR方法扩增出COX6B1全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3.1中构建pCDNA3.1-FLAG-COX6B1表达载体.将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.结果 成功构建了pCDNA3.1-FLAG-COX6B1表达载体,其在HEK 293T细胞中能有效地表达;在COS7细胞中呈斑点状分布,且主要在胞质内分布,细胞核中未见其明显表达.结论 COX6B1在HEK 293T、COS7细胞中均有表达,且主要分布在胞质内,这为进一步了解COX6B1的功能提供了一定的基础.     

人谷胱甘肽硫转移酶P1基因真核表达体系的构建及在A549细胞中的表达

目的:构建人谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)基因的真核表达载体,转染A549细胞,实现其真核表达.方法:以本室保存的重组质粒(pMAL-C2x-GSTP1)为模板;根据GSTP1全基因组序列设计GSTP1 PCR引物,扩增GSTP1片段;限制性内切酶酶切PCR产物和pcDNA3.0空质粒,T4 DNA连接酶连接酶切产物,重组质粒转化E.coli DH5α;提取质粒经酶切、PCR和序列测定后,用Primer Premier 5.0进行序列分析.测序正确的重组质粒和空质粒用脂质体转染法分别转染A549细胞,经G418筛选,获得阳性克隆,运用RT-PCR、Western Blot等技术进行鉴定,同时观察细胞的生长变化.结果:质粒酶切电泳和特异PCR均可见0.63 kb的目的基因片段,测序结果与GenBank中人GSTP1序列一致,基因登录号:BC010915.成功转染A549细胞,实现表达,获得GSTP1蛋白.结论:成功构建pcDNA3.0-GSTP1真核表达细胞系,为进一步研究其在解毒致癌原、预防肺癌发生及其与职业性肺癌的关系奠定了基础.     

FKBP25缺失突变体在细胞中的表达与定位

目的研究FKBP25缺失突变体蛋白在细胞内的表达和定位。方法以人 FKBP25全长 cDNA序列的质粒为模板, PCR方法分别扩增出FKBP25缺失突变体序列,然后插入真核表达载体pcDNA3.1中,通过Western blot方法和免疫荧光方法检测其在细胞株中的表达和定位。结果成功构建了FKBP25缺失突变体的真核表达载体,经Western blot检测FKBP25缺失突变体在HEK 293T细胞中能够有效表达,免疫荧光显微镜结果显示 FKBP25缺失突变体在COS7细胞中分布于细胞核和细胞质。结论 FKBP25缺失突变体在HEK 293T、COS7细胞中能够表达,为了解FKBP25缺失突变体的功能提供了一定基础。     

pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

基于基因转染法的胸苷磷酸化酶高表达结肠癌细胞株的建立

目的：构建表达高度胸苷磷酸化酶（TP）活性并可以稳定传代的结肠癌细胞株。方法合成包含TP cDNA 全长的真核细胞表达载体,用慢病毒包装后转染人结肠癌细胞株 SW480、LOVO、HT29和 LS174T,流式细胞仪检测转染效率,实时荧光定量 RT －PCR 方法检测 TP 的 mRNA 表达,蛋白印迹法（Western blot）检测 TP 蛋白表达。结果转染 TP cDNA 后,SW480、LOVO、HT29与 LS174T 在传代5代后转染效率仍稳定在95％左右。与未转染 TP 基因的亲代细胞相比,SW480－TP、LOVO －TP、HT29－TP 与 LS174T －TP 的 TP mRNA 的表达分别提高了（694．56±171．53）、（282．46±86．85）、（8．45±0．15）和（2615．02±253．97）倍,差异有统计学意义（P ＜0．05）;并且 TP 蛋白的表达水平也显著提高。结论慢病毒载体能够高效地将 TP cDNA 转染至人结肠癌细胞 SW480、LO－VO、HT29和 LS174T 中,所得克隆能够稳定传代,并能显著提高4株结肠癌细胞 TP 的 mRNA 和蛋白表达水平。     

HPC2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的HPC2真核表达载体，并分析其在HEK293细胞中的表达。方法 从重组pcDNA3／HPC2载体上将HPC2cDNA序列亚克隆至带有flag标记的真核表达载体pcDNA3-flag上，经PCR、酶切和测序鉴定，将重组质粒pcDNA3-flag／HPC2用脂质体瞬时转染HEK293细胞，细胞裂解后，用Western blot分析并观察HPC2在HEK293细胞中的表达情况。结果 PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-flag／HPC2构建正确，并可在HEK293细胞内高效表达。结论 成功构建了pcDNA3-flag／HPC2真核表达载体，该载体能在哺乳动物细胞中有效表达，为进一步研究HPC2的功能提供了重要的实验材料。