人脐静脉血管内皮细胞分离与原代培养体会

目的:探讨分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和原代培养的可靠方法与经验.方法:利用0.1%胶原酶消化、分离、体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化及对乙酰化LDL高摄取试验进行内皮细胞鉴定.结果:脐静脉血管内皮细胞的体外原代培养、传代生长均良好,呈典型的铺路石样形态学表现,Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化显示阳性反应,及Dil-Ac-LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力,从而鉴定为血管内皮细胞.结论:本方法获得的HUVEC量多,方法简单、可靠,为血管内皮细胞的研究提供实验模型.     

人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5～7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

血管内皮细胞体外培养方法的实验研究

目的:研究人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定的方法.方法:胰蛋白酶消化脐静脉,脐静脉内皮细胞培养液,贴壁法,37℃,5%CO2细胞培养箱中原代培养,培养2周后免疫组织化学染色鉴定内皮细胞.结果:培养的内皮细胞的形态学观察到脐静脉内皮细胞一般2 h就能贴壁,24 h后,变成梭形.形成数量不等的细胞群.48～72h后生长最快,约5～7 d细胞融合成单层,呈典型的镶嵌状铺路石样.内皮细胞鉴定示90%以上vWF胞浆内阳性显色.结论:脐静脉来源的内皮细胞数量,可以满足实验研究需要.     

胶原海绵促进人脐静脉血管内皮细胞生长的体外实验研究

目的探讨胶原海绵促进人脐静脉血管内皮细胞生长的疗效与机制。方法实验组在细胞培养孔中加入含8 U胶原酶的0.2 ml PBS 2 mm×2 mm×2 mm正方体胶原海绵;对照组仅加入含8 U胶原酶的0.2 ml无菌的PBS液体。培养24 h后测血管内皮细胞增殖(MTT实验)、迁移(划痕实验)、及免疫蛋白印迹检测血管生成素1(Ang1)、血管内皮生长因子(VEGF)与整合素(Integraαv)。结果细胞培养后24 h,实验组可以显著促进HUVEC的增殖,增殖率达86%;实验组血管内皮细胞细胞迁移加快,12 h细胞迁移完成,显著高于对照组(P0.01);实验组VEGF、Ang1及Integraαv蛋白表达明显高于控制组,其中以整合素аv蛋白表达增加尤为显著,增加了80%。结论胶原海绵促进血管内皮细胞增殖与迁移,其中促进迁移的作用较强,机制之一为提高了血管内皮细胞中VEGF、ANG1、Integraαv蛋白表达。     

与人脐动脉平滑肌细胞共培养的人脐静脉内皮细胞的生物学特性

目的：通过共培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical Venous endothelial tells，HUVEC)与人脐动脉平滑肌细胞(human umbilical arterial smooth musele cells，HUASMC)，初步探讨观察共培养的HUVEC的形态和增殖特性及经皮冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)后再狭窄的机制。方法：用共培养装置将体外同时培养在一个培养孔中的HUVEC和HLASMC分离。在倒置显微镜下观察单独培养和共培养HUVEC的生长状态和形态；采用免疫荧光法标记细胞，流式细胞仪测定荧光强度和细咆周期结果：共培养的HUVEC逐渐转变为长梭形；单独培养的HUVEC仍保持鹅卵石样。单独培养的和共培养的HUVEC处于细胞周期G0／G1期和G2+S期的百分率为：(70&;#177;3)％和(81&;#177;5)％；(22&;#177;4)％和(14&;#177;4)％。二者均有Cyclin D的表达，但后者的表达显著低于前者。结论：共培养的HUVEC低血清干预48h形态逐渐变为长梭形，更接近于在体形状；而单独培养的HUVEC仍保持原鹅卵石状。此外，前者的增殖活性也显著低于后者。     

人脐静脉内皮细胞体外分离培养的改进及其鉴定

[目的]优化建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外原代及传代培养的方法,并对培养的细胞进行鉴定,为组织工程血管提供种子细胞。[方法]改进的胶原酶Ⅰ型灌注法分离HUVEC,用含胎牛血清及内皮细胞生长因子的RPMI—1640培养基培养,光镜、免疫组化法进行生物学鉴定。[结果]分离的HUVEC体外培养7～10d左右可长成单层,光镜下为多角形,呈铺路石状排列,人第Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测阳性。[结论]改进的胶原酶Ⅰ型灌注法所分离细胞数量多,易成活,且为具有细胞生物学功能的HUVEC。     

人脐静脉内皮细胞原代培养失败分析

目的：总结人脐静脉内皮细胞原代培养失败经验,帮助同行提高操作成功率。方法：不断改进实验技术,促进实验成熟。结果：历经28次实验失败,获得人脐静脉内皮细胞原代培养成功。结论：人脐静脉内皮细胞原代培养只要细心摸索实验条件,掌握该技术并不难。     

血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞生长增殖的影响

背景:在体外构建组织工程材料的过程中,快速获得足够数量且纯度高的种子细胞极为重要,但目前人脐静脉间充质干细胞原代培养的增殖率仍较低.目的:观察血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞原代生长、增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 03/07在辽宁医学院解剖学实验室完成.材料:正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由锦州市凌河区妇幼保健院及辽宁医学院附属第一医院提供.方法:采用胶原酶消化法分离人脐静脉间充质干细胞,以1×105L-1的密度接种于24孔培养板,设立2组,实验组加入150 g/L 血管内皮细胞生长因子,对照组不加入任何细胞因子.主要观察指标:观察细胞形态变化,MTT法检测细胞生长曲线,免疫细胞化学法鉴定细胞CD166的表达.结果:接种后6 h细胞开始贴壁,48 h后细胞完全贴壁生长,出现呈椭圆形、多角形的内皮细胞,以及呈梭形的成纤维样细胞,有的形成漩涡状生长集落;原代培养1周后细胞以梭形为主;传代后24 h细胞基本完成贴壁,48 h细胞开始分裂增殖,5～7 d可见多核的成纤维样细胞贴壁,呈长杆状、三角形、梭形等.与对照组比较,实验组细胞生长状态较好,增殖较快,单位时间内获得的细胞数量明显增加(t=2.235,P＜0.05),CD166阳性细胞率显著升高(t=-1.638,P＜0.01).结论:血管内皮细胞生长因子可促进入脐静脉间充质干细胞贴壁,且更有利于间充质干细胞的增殖和纯化.     

人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离原代培养的方法,并总结对培养的细胞鉴定方法。方法通过胰酶灌注法从人脐带获取内皮细胞进行分离培养,并采用免疫组化法及光镜和透射电镜观察超微结构鉴定所获得的细胞系。结果分离的HUVEC在体外7-10天左右可长成单层,光镜下胞体为单层铺路石状排列。第VⅢ因子相关抗原的检测为阳性。透射电镜下观察培养的内皮细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。结论用胰酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的有效方法。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

背景:传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限.目的:尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源.方法:采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示:CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明:(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示:CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%.结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化.     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的:建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法:采用1.25g/L胰蛋白酶(2.5g/L胰蛋白酶:0.2g/LEDTA=1∶1V/V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第VIII因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

原代脐静脉内皮细胞与脐静脉内皮细胞株的培养方法及生物特性的比较

目的建立一套成功率高,细胞污染率少,获得较多的细胞数的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的体外分离方法,并且将原代脐静脉内皮细胞与EA.HY926人脐静脉内皮细胞株生物特性进行对比研究,为细胞培养及相关的医学基础研究提供依据。方法在新鲜(健康剖宫产产妇分娩后立即取新生胎儿脐带,长度15～20 cm,取标本时间≤4h)脐静脉内注0.1%的Ⅱ型胶原酶消化获得内皮细胞,用M199生长液(含25%的内皮细胞生长因子)进行培养,EA.HY926细胞株用M199生长液。比较两组细胞的形态、超微结构、细胞纯度检测CD31抗体表达。结果①形态:原代HUVEC体外生长3～4 d可铺满单层,细胞呈梭形、饱满,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;EA.HY926细胞株胞质多颗粒,2～3可铺满单层,可长成复层。②超微结构:透射电镜下,原代HUVEC里可发现较多的横切与纵切的韦伯潘力小体,在EA.HY926细胞株里较少。③细胞纯度检测:CD31抗体的表达率原代HUVEC细胞大于EA.HY926细胞株,两种细胞CD31表达差异有统计学意义(P﹤0.001)。结论脐静脉注Ⅱ型胶原酶消化法配合M199生长液可迅速获取大量内皮细胞,其生物学特性明显优于HUVEC株,而细胞株则以细胞数量多,培养方法简单,成活率高为特点,两者均是组织工程及相关医学基础研究较好的细胞来源。     

Toxicity of sitosterol to human umbilical vein endothelial cells in vitro.

The pathogenesis of the early development of atherosclerosis in sitosterolaemia is unknown. The effect of sitosterol on vascular endothelial cells in vitro was investigated by culturing human umbilical vein endothelial cells in the presence of up to 0.7 mmol l-1 of sitosterol. Liposomes were used to supply the high sterol concentrations. Exposure to 0.7 mmol l-1 of sitosterol for 72 h caused contraction of the endothelial cells and increased release of intracellular lactate dehydrogenase. After 96 h incubation the cells were partly detached from the substrate. At this time-point 0.35 mmol l-1 of sitosterol also caused perturbation of the endothelial cells. However, we could not confirm previous reports that tissue plasminogen activator production was enhanced by sitosterol.     

高糖对人脐静脉内皮细胞c-Jun表达影响

目的:观察高糖对人脐静脉内皮细胞c-Jun表达的影响.方法:提取、分离人脐静脉内皮细胞,体外培养至第3代,分别用5.5,11.0,22.0,44.0 mmol/L葡萄糖培养液培养内皮细胞,并设22.0 mmol/L 甘露醇培养液培养者为对照组.以22.0 mmol/L葡萄糖分别作用0,0.5,1.0,2.0 h,应用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测c-Jun mRNA和蛋白表达水平.结果:高搪以浓度依赖方式上调人脐静脉内皮细胞c-Jun mRNA的表达,22.0 mmol/L葡萄糖达到最强刺激效应,与5.5 mmol/L 葡萄糖组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01).22.0 mmol/L葡萄糖刺激0.5 h c-JunmRNA表达升高,刺激1.0 h达高峰,2.0 h开始下降.22.0 mmol/L葡萄糖刺激2 h后,人脐静脉内皮c-Jun蛋白表达增加.结论:高糖可上调人脐静脉内皮细胞c-Jun mRNA和蛋白表达.     

血管抑素对人脐静脉内皮细胞及体外微血管模型的作用

目的:观察血管抑素对人脐静脉内皮细胞及体外微血管模型的抑制作用。方法:实验于2005-01/2006-12在中国医科大学基础医学院实验病理研究室(省部级)完成。①采用改进的Jaffe式培养法体外培养人脐静脉内皮细胞。②MTT法检测不同质量浓度(1,2,4,8,16,32mg/L)、不同时间(24,48,72h)血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。③流式细胞仪检测不同质量浓度(2,4,8,16,32mg/L)的血管抑素对人脐静脉内皮细胞生长周期的影响。④建立肿瘤微血管体外生成模型,培养4,8,12h倒置显微镜观察血管网形成情况;血管网未形成之前加16mg/L血管抑素观察对血管形成的影响;肿瘤微血管体外生成模型经24h培养形成血管网后加16mg/L血管抑素观察对新生血管的影响。结果:①血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响:8,16,32mg/L血管抑素能明显抑制人脐静脉内皮细胞的生长(P<0.01),血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞24,48,72h后细胞明显受抑制(P<0.01),这种作用具有剂量-时间依赖性。②血管抑素对人脐静脉内皮细胞生长周期的影响:血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞后能诱导细胞凋亡。③血管抑素对体外血管模型的影响:光镜下血管抑素可抑制新生血管的形成,且能破坏新生的血管网。结论:血管抑素可能抑制人脐静脉内皮细胞增殖,从而破坏新生血管形成,抑制肿瘤的生长和转移。     

人脐静脉内皮细胞分离鉴定及其膜分子的表达

背景：肿瘤微环境作用于血管内皮细胞,影响其膜表面分子的表达,与肿瘤的生长、转移及免疫逃逸作用相关,但迄今相关机制尚不完全清楚。目的：分析肿瘤微环境下血管内皮细胞的膜表面分子表达量变化。方法：原代分离培养人脐静脉内皮细胞,采用不同肿瘤培养上清,用不同时间进行诱导。记录培养血管内皮细胞形态;利用免疫组织化学方法,鉴别Ⅷ因子相关抗原;荧光实时定量PCR法测定其膜表面分子mRNA表达量。结果与结论：肝癌smmc7721细胞培养上清处理后,内皮细胞抗原提呈会随着时间延长减弱,黏附白细胞能力随着时间延长而变化。胃癌SGC7901细胞培养上清处理后内皮细胞后,抗原提呈能力无明显变化;黏附能力有关分子中,CD31和细胞间黏附分子1表达降低,CD62E表达增高。说明肿瘤微环境可能通过上述黏附分子和抗原提呈分子表达的变化影响血管内皮细胞的相应功能。