人脐静脉血管内皮细胞分离与原代培养体会

目的:探讨分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和原代培养的可靠方法与经验.方法:利用0.1%胶原酶消化、分离、体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化及对乙酰化LDL高摄取试验进行内皮细胞鉴定.结果:脐静脉血管内皮细胞的体外原代培养、传代生长均良好,呈典型的铺路石样形态学表现,Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化显示阳性反应,及Dil-Ac-LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力,从而鉴定为血管内皮细胞.结论:本方法获得的HUVEC量多,方法简单、可靠,为血管内皮细胞的研究提供实验模型.     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的：建立人血管内皮细胞的培养模型，为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法：采用1．25g／L胰蛋白酶(2．5g／L胰蛋白酶：0．2g／LEDTA：1：1V／V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞，并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长，光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列；免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；电镜下可见胞浆中有W-P小体，证实培养的细胞为内皮细胞。结论：用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞，细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

原代人脐静脉内皮细胞分离培养方法的探讨及其鉴定

目的通过比较两种原代人脐静脉内皮细胞的分离培养方法并对细胞特异性抗原进行鉴定,探索提高原代内皮细胞体外培养存活率及纯化率的方法。方法采用一次性无菌注射器向人脐静脉灌注消化液,消化液的浓度和消化时间分别0.25%（质量体积比）胰蛋白酶,10min和0.1%（质量体积比）胶原酶Ⅱ,15min。通过在倒置显微镜下观察细胞的形态特点和用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,比较两种消化方法的优劣。结果 0.1%胶原酶Ⅱ,15min的消化方法较0.25%胰蛋白酶,10min对原代人脐静脉内皮细胞有更好的分离效果,活细胞数量多且细胞纯度较高。免疫荧光染色结果表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达。结论胶原酶Ⅱ可以有效分离脐静脉内皮细胞,最佳消化条件是0.1%胶原酶Ⅱ,37℃,15min。     

人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5～7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的:建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法:采用1.25g/L胰蛋白酶(2.5g/L胰蛋白酶:0.2g/LEDTA=1∶1V/V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第VIII因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的建立及血管紧张素Ⅱ表达的检测

目的：探索建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的优化方法并对该细胞模型中血管紧张素Ⅱ表达量进行分析。方法：取妊高症孕妇脐带（约8cm）,用PBS冲洗和灌注胰蛋白酶（浓度为1%）消化法分离脐静脉内皮细胞,用McCoy＇s 5A培养基进行原代和继代培养;用吖啶橙（AO）细胞荧光染色进行细胞的形态学鉴定;用免疫组织化学分析所分离细胞的来源;用Western blotting检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的表达情况。结果：利用1%的胰蛋白酶灌注消化可以获得大量的原代细胞,并且在不添加任何生长因子的情况下,使用McCoy＇s 5A培养基进行原代和继代培养可以实现连续传代6代以上,且细胞状态良好,生长稳定。AO染色鉴定显示细胞边缘平整,细胞核小且形态完整,符合正常细胞的形态。免疫组化鉴定结果表明在所分离的细胞中人VⅡI因子及血管内皮生长因子（VEGF）相关抗原呈强阳性。Western blotting检测发现在所分离的细胞中AngⅡ表达量远远高于普通细胞[（90.20±5.84）%,P=0.0130]。结论：1%浓度的胰蛋白酶灌注消化法与McCoy＇s 5A培养基培养法是体外建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的高效经济的方法,该模型高表达血管紧张素Ⅱ,推测AngⅡ可能是诱发妊高症的原因之一。     

实验犬浅静脉内皮细胞原位获取及体外培养

背景:自体血管内皮细胞数量有限且体外长期培养传代后存在功能老化,是目前制约组织工程血管发展的问题.目的:实验拟验证通过体外分离和大规模培养方式为组织工程动脉支架体外内皮化提供血管内皮细胞的可行性.设计、时间及地点:重复测量设计,实验于2007-03/12在复旦大学附属中山医院中心实验室完成.材料:健康杂种犬6只,雌雄不拘,体质量35～40kg,用于获取血管内皮细胞.方法:将犬麻醉后前肢隐静脉原位插管,采用Ⅰ型胶原酶消化法获取血管内皮细胞,体外培养、传代并大规模扩增.采用微格法每日计数培养的细胞总数.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞生长情况,透射电镜和细胞免疫化学进行细胞鉴定,检测原代和传代细胞的条件培养液中6-酮-前列腺素F1°和Ⅷ因子相关抗原的含量.结果:倒置显微镜下观察静脉内皮细胞呈典型的"纺锤样"梭形细胞,单层细胞贴壁生长至融合时呈铺路石样排列.透射电镜下见内皮细胞胞浆中特征性Weibel-Palade小体.细胞免疫化学显示血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原抗体染色阳性.原代及传代细胞培养上清液中6-酮-前列腺素F1°和Ⅷ因子相关抗原的含量差异无显著性意义(P＞0.05).结论:实验成功培养、传代并大规模扩增静脉血管内皮细胞.所培养的静脉内皮细胞可以为组织工程动脉支架体外内皮化提供足够数量和功能良好的细胞.     

血管内皮细胞体外培养方法的实验研究

目的:研究人脐静脉内皮细胞分离培养和鉴定的方法.方法:胰蛋白酶消化脐静脉,脐静脉内皮细胞培养液,贴壁法,37℃,5%CO2细胞培养箱中原代培养,培养2周后免疫组织化学染色鉴定内皮细胞.结果:培养的内皮细胞的形态学观察到脐静脉内皮细胞一般2 h就能贴壁,24 h后,变成梭形.形成数量不等的细胞群.48～72h后生长最快,约5～7 d细胞融合成单层,呈典型的镶嵌状铺路石样.内皮细胞鉴定示90%以上vWF胞浆内阳性显色.结论:脐静脉来源的内皮细胞数量,可以满足实验研究需要.     

血管抑素对人脐静脉内皮细胞及体外微血管模型的作用

目的:观察血管抑素对人脐静脉内皮细胞及体外微血管模型的抑制作用。方法:实验于2005-01/2006-12在中国医科大学基础医学院实验病理研究室(省部级)完成。①采用改进的Jaffe式培养法体外培养人脐静脉内皮细胞。②MTT法检测不同质量浓度(1,2,4,8,16,32mg/L)、不同时间(24,48,72h)血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。③流式细胞仪检测不同质量浓度(2,4,8,16,32mg/L)的血管抑素对人脐静脉内皮细胞生长周期的影响。④建立肿瘤微血管体外生成模型,培养4,8,12h倒置显微镜观察血管网形成情况;血管网未形成之前加16mg/L血管抑素观察对血管形成的影响;肿瘤微血管体外生成模型经24h培养形成血管网后加16mg/L血管抑素观察对新生血管的影响。结果:①血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响:8,16,32mg/L血管抑素能明显抑制人脐静脉内皮细胞的生长(P<0.01),血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞24,48,72h后细胞明显受抑制(P<0.01),这种作用具有剂量-时间依赖性。②血管抑素对人脐静脉内皮细胞生长周期的影响:血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞后能诱导细胞凋亡。③血管抑素对体外血管模型的影响:光镜下血管抑素可抑制新生血管的形成,且能破坏新生的血管网。结论:血管抑素可能抑制人脐静脉内皮细胞增殖,从而破坏新生血管形成,抑制肿瘤的生长和转移。     

人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离原代培养的方法,并总结对培养的细胞鉴定方法。方法通过胰酶灌注法从人脐带获取内皮细胞进行分离培养,并采用免疫组化法及光镜和透射电镜观察超微结构鉴定所获得的细胞系。结果分离的HUVEC在体外7-10天左右可长成单层,光镜下胞体为单层铺路石状排列。第VⅢ因子相关抗原的检测为阳性。透射电镜下观察培养的内皮细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。结论用胰酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的有效方法。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

组织工程化类金刚石膜复合材料与人血管内皮细胞的相容性研究

目的:验证纳米相类金刚石薄膜复合材料与人血管内皮细胞相容性,为组织上程化机械瓣膜材料的构建提供依据.方法:利用脉冲激光沉积法在人工心脏机械瓣膜上沉积纳米相类金刚石薄膜,将人脐静脉血管内皮细胞与纳米相类金刚石薄膜复合材料体外复合培养.倒置显微镜及扫描电镜观察细胞在材料表面的生长、附着情况;MTT法检测细胞在材料上增殖情况;同时分别测定人脐静脉血管内皮细胞在类金刚石溥膜材料和空白对照组中一氧化氮及前列环素分泌水平,以评价其活性.结果:人脐静脉血管内皮细胞能在纳米相类金刚石薄膜复合材料上良好地黏附、增殖、生长.人脐静脉血管内皮细胞分泌一氧化氮和前列环素水平在类金刚石薄膜材料和空白对照组没有显著性差异(P>0.05),说明纳米相类金刚石薄膜材料对人脐静脉血管内皮细胞的活性没有影响.结论;纳米相类金刚石薄膜复合材料具有良好的细胞相容性,有可能作为组织工程化机械瓣膜材料.     

应用猪主动脉脱细胞基质制备新型组织工程血管支架:生物相容性及力学性能评价

背景:组织工程血管构建的关键依赖于理想的支架.猪血管作为组织工程血管构建材料已有广泛应用,但其较高的免疫原性及较差的力学强度限制了该材料作为组织工程支架的应用.目的:应用猪主动脉脱细胞基质制备一种新的具有良好机械性能及生物相容性的组织工程血管支架.方法:对猪主动脉进行脱细胞处理和热交联改性制备脱细胞血管基质支架,采用苏木精-伊红染色及生物力学分析评估其脱细胞效果及血管基质的力学性能.将人脐静脉血管内皮细胞接种于脱细胞血管基质支架中进行体外培养,评估其生物相容性.结果与结论:用1%的Triton X-100溶液处理猪主动脉84 h可完全脱除血管细胞,同时不破坏血管基质结构;经真空下120 ℃热交联处理12 h,脱细胞基质的拉伸断裂强度得到明显提高,达到1.70 MPa.在该改性血管基质支架上接种人脐带静脉内皮细胞体外培养7 d,扫描电镜显示内皮细胞呈现典型的血管内皮层状结构.表明猪主动脉经过脱细胞处理能够维持血管基质完整,冷冻干燥和真空热交联处理可有效提高其拉伸强度,且对血管内皮细胞具有良好的相容性.     

siRNA沉默FOXO3a对三氧化二砷抑制内皮细胞增殖的影响

背景：课题组前期已证实As2O3可以促进乳腺癌细胞中FOXO3a因子的表达,并抑制肿瘤细胞中血管内皮生长因子的表达,但As2O3对血管内皮细胞增殖的影响,以及对血管内皮细胞中FOXO3a、血管内皮生长因子的影响尚未证实。目的：观察siRNA沉默FOXO3a对As2O3抑制人脐静脉内皮细胞增殖及血管生成的影响。方法：实验分为4组：①As2O3组：待人脐静脉内皮细胞贴壁,在含4μmol/LAs2O3的RPMI-1640培养基中培养。②control siRNA组：转染无关序列control siRNA后,细胞在含4μmol/LAs2O3的RPMI-1640培养基中培养。③FOXO3a siRNA组：转染FOXO3a siRNA后,细胞在含4μmol/LAs2O3的RPMI-1640培养基中培养。④对照组：与实验药物等体积PBS作为对照,细胞在完全培养基条件下培养。应用CCK-8方法检测细胞增殖情况,采用免疫细胞化学方法观察人脐静脉内皮细胞中FOXO3a、血管内皮生长因子蛋白的表达情况。结果与结论：与对照组相比,FOXO3a siRNA明显减弱了As2O3抑制人脐静脉内皮细胞增殖的作用,As2O3促进人脐静脉内皮细胞中FOXO3a蛋白的表达并抑制血管内皮生长因子蛋白的表达,FOXO3a siRNA处理后明显抑制FOXO3a蛋白表达且增加血管内皮生长因子蛋白表达。结果提示FOXO3a可能成为As2O3抑制肿瘤细胞增殖及血管生成治疗的重要靶点。     

慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白转染的人脐静脉内皮细胞

背景：人脐静脉内皮细胞转染慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白方便后期示踪该细胞,掌握转染的最佳感染复数（MOI）和产生较强荧光强度的时间,可为后期观察人脐静脉内皮细胞在动物模型体内的示踪奠定基础。 目的：观察慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白在人脐静脉内皮细胞中的表达,找到稳定标记人脐静脉内皮细胞的方法。 方法：采用胶原酶灌注消化分离人脐静脉内皮细胞,将其置于含有体积分数20%胎牛血清、内皮细胞生长因子的培养基内培养,倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,消化离心重悬后进行计数,平均分成4组,每组细胞数5.0×105个,接种于24孔培养皿,空白组加入10μL的DMEM无血清培养基,剩余3组加入慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白进行转染,MOI分别为2,3,4,每组3个皿。 结果与结论：分离的人脐静脉内皮细胞在体外培养5-7d可长成单层,光镜下胞体为单层鹅卵石状排列,第Ⅷ因子相关抗原的检测为阳性。转染后24 h可见绿色荧光,72 h荧光达到最强,细胞转染率与MOI值呈线性增长关系,至21 d 时仍可见绿色荧光。转染后0,7,14,21 d,MOI=3组的人脐静脉内皮细胞数量均与空白组差异无显著性意义,表明转染后细胞增殖能力不受慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白影响。提示慢病毒携带增强型绿色荧光蛋白转染人脐静脉内皮细胞效率高,绿色荧光蛋白基因可持续表达21 d,且标记后不影响人脐静脉内皮细胞的增殖活性。     

应用猪主动脉脱细胞基质制备新型组织工程血管支架：生物相容性及力学性能评价（英文）

背景：组织工程血管构建的关键依赖于理想的支架。猪血管作为组织工程血管构建材料已有广泛应用,但其较高的免疫原性及较差的力学强度限制了该材料作为组织工程支架的应用。目的：应用猪主动脉脱细胞基质制备一种新的具有良好机械性能及生物相容性的组织工程血管支架。方法：对猪主动脉进行脱细胞处理和热交联改性制备脱细胞血管基质支架,采用苏木精-伊红染色及生物力学分析评估其脱细胞效果及血管基质的力学性能。将人脐静脉血管内皮细胞接种于脱细胞血管基质支架中进行体外培养,评估其生物相容性。结果与结论：用1%的TritonX-100溶液处理猪主动脉84h可完全脱除血管细胞,同时不破坏血管基质结构;经真空下120℃热交联处理12h,脱细胞基质的拉伸断裂强度得到明显提高,达到1.70MPa。在该改性血管基质支架上接种人脐带静脉内皮细胞体外培养7d,扫描电镜显示内皮细胞呈现典型的血管内皮层状结构。表明猪主动脉经过脱细胞处理能够维持血管基质完整,冷冻干燥和真空热交联处理可有效提高其拉伸强度,且对血管内皮细胞具有良好的相容性。     

恒磁场对人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶活性的影响

目的:观察恒磁场(staticmagneticfield,SMF)对培养的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendotheliumcell,HUVEC)一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)活性表达的影响,以探讨SMF能否用于经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty,PTCA)及冠脉内支架植入术后冠脉再狭窄(restenosis,RS)的防治。方法:用含100g/L小牛血清的DMEM培养液体外培养人脐静脉内皮细胞(ECV304),分别在给予SMF和无SMF条件下培养,行ABC免疫酶染色法,采用图像分析法分析SMF对HUVEC的NOS活性的影响。结果:实验组内皮细胞结构型NOS(endotheliumconstructiveNOS,ecNOS)表达较对照组增强,差异显著(P<0.01),实验组与对照组诱生型NOS(inducedNOS,iNOS)均无表达。结论:恒磁场增强了培养的HUVEC的ecNOS的表达;恒磁场对PTCA支架植入术后的冠脉再狭窄可能具有防治作用。     

Specific binding of endothelin on human vascular smooth muscle cells in culture.

Endothelin is a newly discovered, potent vasoconstrictor peptide secreted by endothelial cells. The binding of endothelin was studied on cultured human vascular smooth muscle cells obtained from umbilical veins. A single specific binding site for 125I-endothelin was identified, with an apparent Kd of 126 pM and a maximal binding capacity of approximately 10,000 sites per smooth muscle cell. At room temperature the binding was saturable, reached equilibrium at 2 h (using 20 pM endothelin), and was slowly and only partially reversed by unlabeled endothelin. The calcium antagonists nifedipine, nicardipine, and diltiazem did not compete for the same binding site. Conditioned medium from cultured human umbilical vein endothelial cells inhibited the binding of 125I-endothelin dose dependently. This effect was antagonized by anti-endothelin antiserum. We conclude that human umbilical vein smooth muscle cells possess specific binding sites for endothelin, and that human endothelial cells secrete an endothelinlike material.     

羊水干细胞分泌细胞因子及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

背景:关于细胞移植的功效,重点在于其分泌的促增殖或抗凋亡的细胞因子,羊水干细胞能否分泌相关细胞因子有必要深入分析.目的:观察分离培养的羊水于细胞分泌细胞因子情况,及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-12/2009-06在南昌大学第一附属医院高血压病研究所完成.材料:10例剖宫产孕妇足月羊水,50 mL/例,用于分离培养羊水干细胞,同时留取其产后脐静脉用于分离培养内皮细胞,取前均获孕妇知情同意.方法:①贴壁法分离培养羊水干细胞,达80%融合时胰酶消化传代,取传至第3代细胞,调整细胞密度为5×10~8L~(-1),分为2组:缺氧羊水干细胞组通入体积分数为2%O_2+体积分数为5%CO_2+体积分数为93%N_2,常规羊水干细胞组通入体积分数为5%CO_2+体积分数为95%空气,两组细胞37℃培养24 h,收集各自培养上清液及细胞以备分析.②取体外分离培养的第2代人脐静脉内皮细胞,以2×10~4细胞/孔的密度接种于12孔板,分为3组:对照组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液2 mL,常规羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL+羊水干细胞培养液1 mL,缺氧羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL+缺氧诱导羊水干细胞培养液1 mL,培养3d,加入10 μg/L肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡.主要观察指标:流式细胞仪测定羊水干细胞表面抗原表达,ELISA法测定羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子情况,RT-PCR法测定细胞因子mRNA的表达,检测内皮细胞增殖率及凋亡率.结果:培养7 d后羊水干细胞呈长梭形,以漩涡状、辐射状排列,第3代羊水干细胞呈CD29~+,CD105~+,CD34~-.常规培养的羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子;缺氧诱导条件下血管内皮细胞生长因子水平明显增加(P＜0.01),其mRNA表达明显上调(P＜0.05),而肝细胞生长因子含量及mRNA的表达均无明显变化(P＞0.05).与对照组比较,培养3 d后常规羊水干细胞组、缺氧羊水干细胞组内皮细胞数均明显增加(P＜0.05),肿瘤坏死因子α诱导凋亡24 h后内皮细胞凋亡率均明显降低(P＜0.05),且缺氧羊水干细胞组变化幅度大于常规羊水干细胞组(P＜0.05).结论:羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子,羊水干细胞培养液能促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞凋亡.经缺氧处理后,羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子的能力增加,对内皮细胞的增殖和凋亡干预作用增强.