肌腱愈合及粘连形成机制的研究:胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达

目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达,ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1;RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA;ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2.873,P<0.05)。结论:重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。     

小鼠Cdc14A基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠pcDNA3.1-MYC-细胞分裂周期14A(Cdc14A)真核表达载体,并观察和验证其在真核细胞中的表达。方法将化学合成的目的基因Cdc14A定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定正确后,采用脂质体法转染HEK293细胞,通过Western blot检测细胞内Cdc14A的表达,并检测Cdc14A基因序列。结果 pcDNA3.1-MYC-Cdc14A真核表达载体构建成功,将其转染HEK293细胞48h,提取细胞蛋白,采用Western blot检测到细胞内Cdc14A的表达,并且测序结果与预期结果一致。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A,为研究Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中的作用奠定了基础。     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.     

pcDNA3.1-flag-pygo2真核表达载体的构建及在C6细胞中的表达

目的构建pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并在C6细胞中进行表达。方法从小鼠脑胶质细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成CDNA，设计引物，调取目的片段，与pcDNA3．1-flag载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板筛选菌落，提取质粒。重组质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经过酶切鉴定及测序后，阳离子脂质体法转染C6细胞并经免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测重组体的表达。结果重构质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经限制性核酸内切酶EcoRⅠ，HindⅢ酶切分析及测序检查，表明真核表达载体构建正确；瞬时转染C6细胞后，免疫细胞荧光染色及蛋白印迹检测表明转染细胞能够表达外源Pygo2基因。结论成功构建了pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并能够在真核细胞中进行表达，这为今后研究pygo2基因在胶质瘤中的作用机制奠定了基础。     

肌腱愈合及粘连形成机制的研究：胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达

目的：探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法：组织块法培养原代肌腱细胞，体外重组真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1，并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞，反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达，ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1；RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA；ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2．873，P&;lt;0．05)。结论：重组的真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。     

小鼠结缔组织生长因子基因克隆及其真核表达载体构建

背景:研究证实结缔组织生长因子在动脉粥样硬化血管平滑肌中呈高表达,构建结缔组织生长因子真核表达载体以特异性上调结缔组织生长因子在血管平滑肌内的表达是进一步通过细胞及动物实验研究其作用机制的基础.目的:克隆小鼠结缔组织生长因子基因、构建其真核表达载体,并在血管平滑肌细胞中瞬时表达.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-09/2008-04在辽宁医学院省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室完成.材料:1个月龄昆明小鼠10只.真核表达载体{pcDNA3.1(+)由辽宁医学院分子生物学实验室保存.方法:以小鼠肾脏总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链反应方法获得结缔组织生长因子(CTGF)目的基因,连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定测序,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体.主要观察指标:酶切测序鉴定重组体pcDNA3.1(+)-CTGF.将pcDNA3.1(+)-CTGF转入血管平滑肌细胞,Western观察结缔组织生长因子蛋白表达.结果:酶切、测序鉴定证实成功扩增出小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,Western检测证实,重组体转入血管平滑肌细胞后,细胞内高表达结缔组织生长因子蛋白.结论:成功克隆小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,重组体能在血管平滑肌中表达.     

重组人MBL在CHO细胞中的表达及检测

[目的]在CHO-K1细胞中表达重组MBL并进行检测。[方法]构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mbl，用阳离子转染试剂Transfast转染CHO-K1细胞，G418筛选稳定转染的细胞。应用RT-PCR、ELISA及免疫荧光检测重组MBL的表达。[结果]RT-PCR从稳定转染pcDNA3.1（＋）-mbl的CHO-K1细胞中检测到mbl基因的表达，夹心ELISA并未从转染细胞上清中检测到重组MBL，免疫荧光表明稳定转染pcDNA3．1（＋）-mbl的CHO-K1细胞能够在胞浆中表达重组人MBL。[结论]成功构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mbl并转染CHO-K1细胞，转染的细胞能够表达重组人MBL。     

大鼠膜联蛋白A_2真核表达载体的构建及表达

目的:克隆大鼠背根神经节膜联蛋白A2(annexin Ⅱ)的基因,构建真核表达载体并检测其表达。方法:以RT-PCR法扩增大鼠背根神经节(DRG)细胞中膜联蛋白A2(annexin Ⅱ)的基因,构建pGMT-Anxa2克隆载体,以此为模板插入flag标签扩增Anxa2-flag序列,将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),获得表达载体pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag。以PCR、双酶切及序列测定法鉴定该质粒。以脂质体法将表达载体转染到HEK293细胞中,Western印迹和细胞免疫荧光检测annexin Ⅱ蛋白表达及细胞内定位。结果:PCR扩增Anxa2-flag片段大小与预期相同。通过PCR、HindⅢ和NotⅠ双酶切及测序鉴定,证明构建出了含大鼠annexin Ⅱ基因的真核表达载体。Western印迹和细胞免疫荧光的检测表明大鼠annexin Ⅱ基因稳定表达,并可在胞膜和胞质中广泛表达。结论:成功构建pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag真核表达载体,并稳定表达蛋白,为研究annexin Ⅱ调控DRG伤害性感受传导的分子机制奠定基础。     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的真核共表达质粒

背景：一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体，可提高转染和表达效率。目的：利用多形上皮黏蛋白（polymorphic epithelial mucin，MUC1）多肽骨架中含有许多连续重复系列，构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte macrophagehage colony stimulating factor，GM-CSF）基因重组的真核共表达质粒pcDNA3．1（＋）．MUC1-GM-CSF，并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。设计、时间及地点：基因重组体设计实验，于2005—09，2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成。材料：真核表达载体pcDNA3．1（＋）由英国Taylor-Papadimitriou教授惠赠，pGEM-3zf（-）-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E．coli DH5α为自备，雌性BALB／c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体，酶叨鉴定及序列分析后，与GM—CSF基因克隆入pcDNA3．1（＋）真核表达载体中，构建真核共表达质粒pcDNA3．1（＋）-MUC1-GM—CSF。以重组质粒转染COS-7细胞。主要观察指标：通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果：酶切鉴定及序列分析表明，重绍质粒含育人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因，在COS-7细胞中可检测到MUC1表达，重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM—CSF抗体。结论：成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM—CSF基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒。     

酸敏感离子通道蛋白与组织型激肽释放酶相互作用的研究

目的：观察酸敏感离子通道蛋白（ASIC1a、ASIC2a）与组织型激肽释放酶（TK）之间是否存在相互作用。方法：RTPCR分别获得小鼠TK、ASIC1a、ASIC2a全长cDNA,将其克隆人真核表达载体pcDNA3．1／Myc—his中,脂质体法分别将pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC1a、pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC2a共转染至人胚胎肾细胞（HEK293T）,免疫共沉淀分别用抗Myc及抗TK抗体观察两者间有无相互作用。将ASICs融合蛋白与TK（100μg／mL）共孵育,SDS—PAGE分别用抗Myc及抗TK抗体检测蛋白表达。结果：pcDNA3．1TK和pcD—NA3．1-ASIC1a、pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC2a共转染后,SDS—PAGE显示抗TK抗体检测后在转染细胞内见有56kDa的TK条带出现,但抗Myc抗体作用未见ASICs目的条带出现。纯化的ASIC1a、ASIC2a融合蛋白与TK共孵育后,SDS—PAGE显示抗Myc抗体检测后在约66kDa处有融合蛋白表达条带,但抗TK抗体检测后在56kDa处无条带出现。结论：TK与ASIC1a、TK与ASIC2a之间无相互作用。     

pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体的构建

从胰腺癌PaTu8988S细胞中提取总RNA,并克隆AKR1B10基因,构建pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体。转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,提质粒,酶切及测序鉴定,pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体构建成功。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA4真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA4引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4。结果PCR扩增GRA4基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA4,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）的构建及其在体内外细胞中的表达

目的构建真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）并了解其在体内外真核细胞中的表达。方法将带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）产物克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染体外培养的真核293T细胞及注射入鼠骨骼肌细胞中,了解其在体内外真核细胞中的表达情况。结果我们获取了包含带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）成熟肽及HA抗原在内的一段cDNA片段,并成功地与真核表达载体PcDNA3.1（＋）连接,经测序表明,其中含有的带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）成熟肽的序列与Genebank上报道的序列完全一致。即我们成功构建了真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）。之后,在转染了该质粒的体外真核293T细胞的上清液中及骨骼肌注射了该质粒的鼠血液中,利用Western-blot法检测到了目的基因的蛋白质。结论带有白蛋白信号肽的真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-Vasostatin（120-180aa）增强了蛋白分泌表达能力,这为进一步应用该质粒治疗全身新生血管类病奠定了一定基础.     

Construction and identification of an antisense glucose transporter-1 plasmid

Our aim was to construct a pcDNA3.1(+) eucaryotic expression system vector containing the antisense glucose transporter-1 (Glut-1) gene. Total RNA was isolated from human Hep-2 laryngeal carcinoma cells, and the Glut-1 and antisense Glut-1 sequences were amplified by polymerase chain reaction. Expression plasmids containing the sense and antisense cDNA were constructed using the pcDNA3.1(+) vector. The resulting sense and antisense vectors, pcDNA3.1(+)-Glut-1 and pcDNA3.1(+)-antiGlut-1, respectively, were examined by restriction analysis and DNA sequencing. The pcDNA3.1(+)-antiGlut-1 was subsequently transfected into Hep-2 cells. AntiGlut-1 mRNA expression was detected, indicating the successful construction of an antisense Glut-1 plasmid capable of transfecting Hep-2 laryngeal carcinoma cells. These data provide a firm basis for additional studies using the plasmid pcDNA3.1(+)-antiGlut-1 to determine its therapeutic potential for the treatment of laryngeal carcinoma.     

外源Smad7转染肝星状细胞及对转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

背景:Smad7是转化生长因子β信号转导途径的主要抑制性蛋白,具有抗纤维化的作用.目的:构建并鉴定大鼠Srnad7真核表达质粒,观察外源Smad7可否有效转染肝星状细胞T6,并进一步研究其对转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响.设计、地点:基因重组及细胞观察实验,于新疆石河子大学医学院第一附属医院完成.材料:pcDNA3.1(+)质粒为课题组保留;大肠杆菌DH5a系石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室所赠;肝星状细胞T6细胞由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供品.方法:采用基因重组技术将Smad7cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染肝星状细胞T6细胞,分为正常对照、空质粒及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞.主要观察指标:反转录-聚合酶链反应法检测各组中Smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照组、空质粒组比较:Smad7 mRNA 达显著增加(P<0.01);转化生长因子β、Ⅰ型胶原mRNA表达减少(P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P>0.05).正常对照组、空质粒组smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P值均>0.05).结论:大鼠Smad7真核表达质粒构建成功,外源Srnad7转染肝星状细胞T6细胞后可有效表达,并能降低转化生长因子β及Ⅰ型胶原mRNA表达水平.     

重组人单链白细胞介素12融合基因的构建、真核表达及生物学活性测定

目的 探讨用生物学技术获取具有生物学活性的重组人白细胞介素１２（ｒｈＩＬ－１２）的方法。方法 从经佛波醇酯（ＰＤＢｕ）刺激的ＥＢ病毒转化的人Ｂ淋巴母细胞株ＮＣ－３７中提取ｍＲＮＡ,经逆转录－聚合酶链反应分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ,运用重组聚合酶链反应技术。将两段基因通过多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列连接后进行基因重组,构建了重组人单链ＩＬ－１２融合基因（ｒｈ－ｓｃＩＬ－１２）。进一步将ｒｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１（＋）真核表达载体中,构建ｒｈｓｃＩＬ－１２真核表达载体「ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｒｈｓｃＩＬ－１２」,转染ＣＯＳ－７细胞,结果 经Ｇ４１８筛选获ＣＯＳ－ｒｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白稳定表达株,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白相对分子质量为７