基于Methyl-Rad技术对结肠癌全基因组DNA甲基化图谱的研究

目的:分析结肠癌全基因组DNA差异甲基化位点（DMS）及差异甲基化基因（DMG）水平,寻找结肠癌相关甲基化基因。方法:在山东大学齐鲁医院结肠癌组织标本库中,随机数表法抽取5份结肠癌组织和配对癌旁组织,采用甲基化修饰依赖性内切酶测序法（Methyl-Rad）进行全基因组DNA甲基化测序,Edge R方法筛选DMS,并比较...     

霍乱弧菌基因组DNA提取方法的比较研究

目的 目前细菌DNA提取方法众多,但由于提取原理和步骤的差别,获得DNA的浓度及纯度各不相同,本文通过霍乱弧菌基因组DNA提取方法的比较研究,为不同需求提供不同的DNA提取方法建议。 方法 本文采用4种不同DNA提取方法(酚-氯仿抽提法、CTAB法、试剂盒法和液氮研磨法)提取霍乱弧菌基因组DNA,并比较各种方法提取DNA的效果。 结果 酚-氯仿抽提法和CTAB法提取的基因组DNA效果相对较差,但成本低;液氮研磨法提取的基因组DNA效果大大改进;试剂盒法不仅操作简便,而且提取的基因组DNA效果最好。 结论 4种方法均适合霍乱弧菌的聚合酶链反应(PCR)检测,试剂盒法还适用于分子分型和基因组测序分析。     

系统性红斑狼疮患者基因组DNA甲基化水平的研究

目的:检测系统性红斑狼疮(SLE)患者基因组DNA甲基化的水平.探讨其在SLE发病中的意义.方法:抽提SLE患者和正常人DNA,采用高效毛细管电泳法检测基因组DNA甲基化水平.结果:SLE组DNA甲基化水平低于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),SLE活动组及SLE稳定组与正常对照组之间差异均有统计学意义(P=0.012.P=0.008),而SLE活动组与稳定组之间甲基化水平差异无统计学意义(P=0.952);SLE患者DNA甲基化水平与系统性红斑狼疮疾病活动指数、抗核小体抗体、抗C1q抗体、抗核抗体、抗dsDNA抗体、免疫球蛋白、补体C3、C4无相关性.结论:SLE患者基因组DNA甲基化水平降低.     

炭疽芽孢杆菌基因芯片探针的制备

目的制备炭疽芽孢杆菌(BA)基因芯片探针,应用于BA基因芯片的检测。方法采用PCR方法,以BA疫苗株A16R基因组DNA为模板,扩增pXO1质粒上的8个特异性片段,连接至pMD19-T Simple载体,构建分别包含8个探针序列的重组质粒,以其为PCR扩增模板获取探针DNA。结果基因测序证明,成功获得BA的3个探针。结论 BA基因探针的成功获取,为炭疽芽孢杆菌基因芯片的制备奠定了基础。     

旋转离心柱提取全血DNA在HLA基因分型中的应用

目的采用旋转离心柱提取人类基因组DNA,能更好的适用于临床肾移植特别是尸肾移植的HLA基因分型。方法18份EDTA-K。抗凝的2ml全血标本分别采用标准酚一氯仿法、快速盐析法和旋转离心柱法提取DNA,做HLA-DR基因分型。然后就所获DNA浓度和纯度、操作时间、分型结果3个方面进行统计学分析。结果3种方法提取的DNA平均含量差异无统计学意义;采用旋转离心柱法和标准酚氯仿法提取的DNA纯度高于快速盐析法差异有统计学意义;整个操作时间旋转离心柱快于标准酚氯仿法和快速盐析法,差异有统计学意义;5份全血标本采用这3种方法获得的模板DNA基因分型结果完全相同,差异无统计学意义。结论采用旋转离心柱提取人类白细胞DNA,操作简单、快速,总耗时60～70min,分型方法稳定、可靠,无一例失败,能更好的适用于临床肾移植特别是尸肾移植的HLA基因分型。     

甲基化特异性PCR在原发性肝细胞癌p16INK4A基因甲基化检测中的应用

目的设计一种将亚硫酸氢化测序PCR和甲基化特异性PCR相结合的巢式PCR技术，即BS—MSP技术，对原发性肝细胞癌手术切除组织中p16INK4A甲基化情况进行检测。方法基因组DNA经亚硫酸氢化修饰后，首先通过亚硫酸氢化测序PCR评估模板的质量，然后再分别用甲基化和非甲基化特性PCR分析基因的甲基化状态，并将所得的扩增产物进行测序验证。结果在40例HBV感染的肝细胞癌中，有3例（7．5％）因模板质量原因无法检测，其余37例标本中p16INK4A基因甲基化发生率为78％，测序结果证实了所用方法的可行性。结论BS-MSP技术对于肿瘤发生过程中基因甲基化的研究，以及临床诊断方面都具有一定的应用价值。     

亚硫酸氢盐测序法DNA甲基化标记筛查技术的改进研究

目的 改进DNA亚硫酸氢盐测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS),建立一种简便快速的甲基化标记筛查技术.方法 基因组DNA在亚硫酸氢盐处理、脱盐纯化后直接进入碱性的PCR体系,通过延长预变性时间完成修饰过程,然后进行常规亚硫酸氢盐PCR(bisulfite-PCR,BSP)扩增;首轮扩增产物再用5'端加有高GC标签序列的引物进行2次扩增,达到调整GC含量和直接测序的目的 .同时用传统和改进BGS法检测3T3-L1细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因和Hela细胞雄激素受体基因启动子的甲基化情况,以评估改进方案的可行性.并用Alu序列实时定量BSP技术比较传统和改进BGS法的灵敏度.结果 无论是高甲基化还是低甲基化片段,改进的BGS法均可实现BSP产物的直接测序,结果与传统法一致.改进法修饰的DNA转化率达到100%,特异度＞93.75%,灵敏度显著高于传统方法(t=2.978 2,P＜0.05),并有良好的重复性.结论 改进后的BGS方法简单灵敏,可用于甲基化标记的快速筛查.     

MLXIPL、PMVK、TRIB3基因启动子区甲基化检测方法的建立

目的建立基因MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区DNA甲基化检测的方法。方法用亚硫酸氢钠和对苯二酚处理外周血细胞基因组DNA标本,以修饰后的DNA标本为模板,每个基因分别用内外侧两套不同的引物对启动子区进行巢式扩增。PCR产物进一步克隆、测序。结果测序结果表明,MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区基因中的非甲基化的C碱基转变为T碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基则不改变。结论成功地建立了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因甲基化检测的方法,为探索基因启动子区甲基化与疾病的关系做出了铺垫。     

适用于PCR检测的发根DNA提取法

目的 为适应在组织、细胞、血液等标本无法获取或现场只留下毛发的情况下进行基因组检查，本研究了自发根提取DNA的方法。方法 试验了三种提取方法，即Tris—钾镁盐液(TKM)法、细胞裂解法及最简单的水煮沸法。结果 三种方法所得的DNA产量不同，但经模板活性鉴定，均适用于PCR检查。结论 在其它样品取材受限时，毛发可作为另一类标本进行基因组DNA的分析。     

纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性

背景：相对于血液标本,口腔拭子标本更利于大规模载脂蛋白E基因多态性分析的研究,但目前对口腔拭子标本基因组DNA的提取尚无统一方法。 目的：探索合适的口腔拭子标本基因组提取方法以分析载脂蛋白E基因的多态性。 方法：收集50例散发性阿尔茨海默病患者口腔拭子标本,每份标本分别应用纳米磁珠法与PicoDNA微量核酸提取试剂盒法提取基因组DNA,对比分析两种方法获得的基因组DNA纯度和浓度,后续进行PCR反应,应用DNA电泳确认有无成功扩增出目的条带,通过DNA测序方法分析载脂蛋白E基因的多态性。 结果与结论：两种方法提取的基因组DNA纯度均较好,纳米磁珠法提取的基因组DNA浓度要高于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法所得浓度（P〈0.05）。两组获取的基因组DNA均可成功进行PCR扩增,但电泳结果示纳米磁珠法扩增的目的条带更清楚。两组PCR产物DNA测序结果一致,载脂蛋白E基因ε2、ε3、ε4基因型的比例分别是6%,71%,23%。表明纳米磁珠法相对于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法提取口腔拭子标本基因组DNA更适合用于大样本载脂蛋白E基因多态性的研究。     

不同粪便DNA提取试剂盒及样本储存时间对粪便人基因组DNA提取率的影响

目的比较不同粪便DNA提取试剂盒及粪便样本不同储存时间对粪便人基因组DNA提取效率的影响。方法对18例体检健康者使用QIAamp DNA Stool Mini Kit,MO BIO UltraCleanFecal DNA Isolation Kit,E.Z.N.A.Mag Bind Stool DNA Kit 3种粪便DNA提取试剂盒进行粪便DNA提取,通过紫外分光光度法对总DNA产量和纯度进行分析,通过实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法对提取产物中结肠腺瘤性息肉病基因进行定量,并比较人基因组DNA提取效率的差异及不同样本储存时间对其影响。结果在3种试剂盒中,QIAamp DNA Stool Mini Kit对人基因组DNA的提取产量最高(平均67.81 ng/g),E.Z.N.A.Mag Bind Stool DNA Kit提取产物纯度最高(A260/A280平均2.07),MO BIO UltraCleanFecal DNA Isolation Kit操作耗时最短(约40 min);粪便样本在-70℃条件下储存30 d内,不同储存时间对总DNA提取效率差异有统计学意义(P0.01)。结论 QIAamp DNA Stool Mini Kit对粪便人基因组DNA的提取效率最高,且于-70℃储存粪便样本30 d内对人基因组DNA提取效率无影响。     

中国汉族人群鼻咽癌患者HLA-DQB1等位基因多态性分析★

背景:目前开展HLA-DQB1基因与鼻咽癌疾病相关性研究一方面受昂贵的进口试剂所制约,另一方面单纯做HLA-DQB1第2外测序分型,模棱两可,结果较少。目的:采用HLA-DQB1基因第2至第3外显子双向测序分型检测技术方法。方法:纳入286份中国汉族健康人群血液样本,46例鼻咽癌患者样本,使用Gentra DNA提取试剂制备基因组DNA,取100份健康人群样本作为平行对照组进行基因分型,选择及自行设计HLA-DQB1基因第2至3外显子扩增引物及测序引物,探索最适合PCR扩增及测序反应条件。采用商品化HLA-DQB1基因单向测序分型试剂盒作对照。结果与结论:100份平行对照组样本与HLA-SBT测序分型结果一致。286例健康个体中共检出13种等位基因,27例样本的等位基因为纯合子。鼻咽癌人群共检出DQB1等位基因11种,5例样本的等位基因为纯合子。鼻咽癌患者DQB1*02等位基因频率高于对照组,但所有等位基因频率比较,差异无显著性意义(χ2<3.84,P>0.05)。未发现HLA-DQB1基因与鼻咽癌有相关性。说明采用的中国汉族人群HLA-DQB1基因测序分型方法具有操作方便、结果稳定和低成本消耗等优势。     

PCR扩增产物磁珠纯化法应用于HLA测序分型的研究

目的 探讨PCR扩增产物磁珠纯化法应用于HLA测序分型的可能性.方法 采用本实验室建立的HLA-C基因测序分型方法 中的PCR扩增、测序反应和测序纯化等步骤,对96份标本特异性扩增HLA-C基因外显子1～4目的 序列片段约为2 000 bp,扩增产物分别采用OMEGA公司(瑞士)磁珠纯化法及USB公司(美国)的外切酶I...     

VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究

背景:血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段.但是,血管内皮生长因子价格昂贵,并且半衰期非常短.很难在体内保持有效的作用浓度.故本实验将其转入组织工程的种子细胞--骨髓间充质干细胞中,使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子,从而达到促进血管生成的目的.目的:探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性,为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础.设计:观察对比实验.单位:吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所.材料:实验于2003-06/2004-08在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室(生物安全实验室二级)完成.健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供.4.0～5.0月龄,体质量215～315 kg,雌雄兼用,实验过程中对动物处置均在麻醉状态,无菌条件下完成,符合动物伦理学标准.实验药品及试剂:Ham F12培养基(GIBCO公司),噻唑蓝(MTT)(Sigma公司),pLXSN-KDRp-VEGF165与pcDNA3.0载体由本实验室自备,ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物公司),感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、HandⅢ、EcoR Ⅰ和标准DNA分子(Promega公司).方法:分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞.构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165真核表达载体,利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞.采用ELISA方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达,MTT法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响,设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0转染骨髓间充质干细胞组为对照组.主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析.②ABC.ELISA法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达.③通过MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响.结果:①构建的质粒用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同,PcR和酶切鉴定正确后行测序鉴定,测序结果正确,证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165重组质粒.②ABC-ELISA法检测结果表明,人血管内皮生长因子165基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24 h,即有较高水平的人血管内皮生长因子165蛋白表达,48及72 h呈下降趋势,但与对照组比较,差异显著(P＜0.05).③MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响,结果显示,含2%,4%,8%,16%和32%转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组(P＜0.05).结论:人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中,并可进行有效地表达.     

超声靶向微泡破裂联合PEI增强小鼠EGFP基因心肌转染

目的探讨超声靶向微泡破裂(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)增强BALB/c小鼠心肌绿色荧光蛋白基因(EG-FP)转染的可行性和应用价值。方法实验分为7组:PBS组、裸质粒组、质粒 超声辐照组(P US)、质粒 SonoVue 超声辐照组(P UTMD)、质粒 PEI组(P PEI)、质粒 PEI 超声辐照组(P PEI US)、质粒 PEI SonoVue 超声辐照组(P PEI UTMD)。由BALB/c小鼠尾静脉注入EGFP质粒和SonoVue微泡或PEI的复合物,处理4d后检测心肌基因表达效率及HE染色,并对超声辐照后的质粒完整性进行分析。结果电泳显示超声辐照不会损坏DNA或PEI/DNA复合物。非超声辐照时,EGFP只在心内膜下层表达;而超声辐照时,表达最强的位置为靠近探头的左室前壁;超声联合PEI时,EGFP的分布差异不明显。P PEI UTMD组的转染率最高,荧光强度最强。结论UTMD联合PEI可高效、靶向地将质粒DNA输送至心肌,这种非侵入性的技术在心脏基因治疗上很有前景,有望应用于迅速发展的心脏病基因疗法。     

WT1基因干扰质粒的构建

目的构建WT1(Wilms’tumor susceptibility gene,WT1)基因siRNA(small interference RNA,siRNA)载体, 为进一步探讨WT1的生物学功能奠定基础。方法根据针对WT1 mRNA的有效的siRNA序列,设计合成两条shRNA(small hair RNA,shRNA)的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计不同的两个限制酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化,T4连接酶将插入片断插入siRNA空质粒中。结果经酶切、PCR及测序鉴定确定构建成功。结论成功构建了WT1的干扰质粒,可对其生物学行为作进一步研究。     

Ultrasound-mediated microbubble destruction enhances gene transfection in pancreatic cancer cells

INTRODUCTION: The purpose of this study was to determine whether ultrasound exposure combined with microbubble destruction could be used to enhance non-viral gene delivery in human pancreatic carcinoma cells (PANC-1). METHODS: The study was performed with four experimental groups: Group P, plasmid alone; Group P+M, plasmid and microbubbles; Group P+U, plasmid and ultrasound; Group P+U+M, plasmid with ultrasound and microbubbles. Plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pEGFP) was gently mixed with commercially available ultrasound microbubble contrast agents (SonoVue(R); Bracco Diagnostics Inc, Milan, Italy) in Group P+M and Group P+U+M. The different combinations of DNA and DNA plus microbubbles were added to cultured PANC-1 cells under different conditions. Transfection efficiency and cell viability were assessed by FACS analysis (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), confocal laser scanning microscopy, and trypan blue staining. RESULTS: The results demonstrated that microbubbles with ultrasound exposure could significantly enhance the reporter gene expression as compared with other groups (Group P+U+M, 21.4%+/-3.16%; Group P, 2.9%+/-0.45%; Group P+M, 3.1%+/-0.51%; Group P+U, 6.1%+/-1.27%; P<0.01). No statistically significant difference was observed in the PANC-1 cell viability between Group P+U+M and other groups (P>0.05). CONCLUSION: Our in-vitro findings suggest that ultrasound-mediated microbubble destruction has the potential to promote efficient gene transfer into PANC-1 cells without significant cell death. This non-invasive gene transfer method may be a useful tool for safe clinical gene therapy of pancreatic cancer in the future.