熟地鳖甲与系膜细胞协同上调成骨细胞骨钙素基因及蛋白表达

背景:熟地鳖甲含药血清可上调成骨细胞骨钙素基因表达,系膜细胞上清液亦可促进成骨细胞该基因的表达。目的:验证熟地鳖甲含药血清与系膜细胞上清液对成骨细胞骨钙素基因及蛋白表达的影响是否有叠加作用。方法:原代培养经鉴定的SD大鼠成骨细胞分为4组培养:①空白对照组含空白血清培养液。②含药血清组含熟地鳖甲含药血清培养液。③无药系膜组含空白血清培养液+空白系膜细胞上清。④含药系膜组含熟地鳖甲血清培养液+含药系膜细胞上清液。6d后收集培养液,并与3d所收集的培养液混匀进行检测。结果与结论:与空白对照组比较,含药血清组、无药系膜组、含药系膜组骨钙素mRNA表达率明显上调(P<0.05),含药系膜组骨钙素mRNA表达率明显高于含药血清组或无药系膜组。含药系膜组成骨细胞骨钙素浓度/MTTA值明显高于空白对照组(P<0.05)。与含药血清组比较,含药系膜组成骨细胞骨钙素浓度/MTTA值明显升高(P<0.05)。提示系膜细胞上清液及含药血清可上调成骨细胞骨钙素基因表达,二者共同作用进一步上调骨钙素基因的表达量,此时骨钙素分泌量亦明显增加。     

硒对人肾小球系膜细胞硒蛋白表达的影响

目的体外模拟低硒(Se)条件,检测Se对人肾小球系膜细胞硒蛋白的表达影响。方法低硒条件(0.5%胎牛血清)处理人肾小球系膜细胞系(HMCs)5 d,紧接着以不同浓度(0、10 nM、25 nM、50 nM、100 nM、250 nM)亚硒酸钠刺激细胞不同时间(0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h),建立HMCs低硒及补硒细胞模型。低硒培养HMCs 0~9 d,使用细胞谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒检测细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性。RT-PCR法检测标准培养条件下HMCs25种硒蛋白表达谱。实时定量PCR法及western-blotting法检测补硒实验中硒蛋白表达变化。结果人体25种硒蛋白中的21种可被检测到,仅有4种硒蛋白(GpX2,GpX3,GpX6和DIO1)的表达未达到可被检测到的水平。低硒培养条件下,9种硒蛋白的表达显著下调,包括:GpX1、TrxR2、DIO2、DIO3、SelH、SelN、SelR、SelT、SelW。其中,GpX1、SelN、SelW的表达对浓度梯度和时间梯度的补硒敏感。结论 HMCs的硒蛋白GpX1、SelN、SelW的表达受浓度梯度和时间梯度补硒的影响。进一步的研究需要集中在Se对硒蛋白表达的调控和其在CKD进展中的作用上。     

人Leptin基因融合蛋白表达载体构建及对人成骨细胞的作用

背景:瘦素作为一种内分泌激素参与机体能量代谢的调节,近年来瘦素对骨代谢的调节作用也越来越被人们所重视.目的:克隆人Leptin基因,构建重组原核表达载体PEGX-5X-3/Leptin并在大肠杆菌中表达,观察Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长抑制作用.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-07/2008-05在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成.材料:新鲜的脂肪组织取自苏州大学附一院(供者知情并同意)、大肠杆菌DH5а、人成骨细胞由苏州大学附属第一医院骨科实验室保种.方法:从人脂肪组织中提取RNA,采用反转录-聚合酶链式反应获得人Leptin全部序列,克隆入带有GST原核细胞表达载体PEGX.5X-3中,实现插入基因的融和表达,用SDS.PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定,提取并纯化GST-Leptin融合蛋白,以5,10,20,40 mg/L不同质量浓度与人成骨细胞共培养,同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组,四甲基偶氮唑盐法测两组人成骨细胞的体外增殖情况.主要观察指标:①Leptin 基因的克隆与鉴定.②重组质粒的双酶切及聚合酶链反应鉴定.③融合蛋白的表达.④GST-Leptin融合蛋白的纯化.⑤GST-Leptin融合蛋白的鉴定.⑥GST-Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长影响.结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到的特异性片段长度约为450 bp,以此构建的重组质粒PEGX-5×-3/Leptin,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后显示5 kb和450 bp左右的两条片段.测序结果与Genbank中报道的完全一致,证明Leptin基因已成功地克隆到了原核表达载体PEGX-5×-3中.并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致,融合蛋白为M 45 000,GST蛋白为Mr29 000,与GST蛋白组相比,20,40 mg/L的GST-Leptin融合蛋白可以明显促进细胞的生长(P<0.05),且其促进作用有一定的浓度依赖性.结论:成功构建了PEGX-5X-3/Leptin重组原核表达载体,在E.coil BL21中表达GST-Leptin融合蛋白,并以浓度依赖性促进人成骨细胞的生长.     

细胞因子与系膜细胞进展

肾小球系膜细胞是最活跃的固有细胞成分,在肾小球损伤过程中首当其冲,为各种细胞因子作用的主要靶细胞。各种细胞因子间的相互作用导致系膜细胞不断增殖与硬化,是肾小球肾炎向终末期肾病发展的关键。文章就近年来研究较多的部分细胞因子与系膜细胞关系的进展作一综述。     

游离脂肪酸对大鼠系膜细胞细胞外基质表达及分泌的影响

目的探讨游离脂肪酸(freefattyacids,FFAs)对大鼠系膜细胞(MC)细胞外基质(ECM)的基因表达及分泌的影响。方法以体外培养的大鼠系膜细胞(HBZY-1细胞)为基础,采用半定量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)法检测Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子(TGF-β1)mRNA的表达;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测细胞外基质ColⅣ、FN的分泌。结果25、100、400μmol/L油酸刺激组中ColⅣ、FN、TGF-β1mRNA的表达分别为0.94±0.17、1.16±0.15、1.28±0.19和0.82±0.11、0.97±0.07、1.09±0.08及1.15±0.07、1.24±0.06、1.36±0.05,各处理组与对照组(0.73±0.16、0.53±0.09、0.96±0.11)相比较差异有统计学意义(P<0.01);25、100、400μmol/L油酸刺激组中ColⅣ、FN的分泌分别为(59.6±6.4)、(63.1±6.7)、(72.4±8.6)ng/ml和(106.1±6.4)、(121.0±7.1)、(137.5±9.7)ng/ml,各处理组与对照组[(52.3±7.2)、(93.2±8.7)]ng/ml相比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论游离脂肪酸具有增加细胞外基质基因表达和分泌的作用,可能参与肾小球硬化(GS)的进展机制。     

肾小球系膜细胞与单核细胞趋化蛋白-1的关系

肾小球系膜细胞是最活跃的细胞固有成分,单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是一种对单核细胞具有特异趋化功能的细胞因子,系膜细胞可表达MCP-1及其特异性受体,两者相互作用对多种肾小球病理生理过程发挥重要影响。本文简要地叙述了肾小球系膜细胞及MCP-1的生物学作用,重点分析介绍影响系膜细胞MCP-1表达的因素以及干预治疗对MCP-1表达的影响。     

P21在肾小球系膜细胞的表达变化及意义

目的:探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21表达的影响及其与系膜细胞肥大的关系。方法:将培养的大鼠1097系膜细胞株分为8组:正常对照组,高糖组,甘露醇组,不同浓度胰岛素组,高糖加不同浓度胰岛素组。用RT-PCR法检测各组系膜细胞P21mRNA表达。流式细胞仪定量检测各组系膜细胞前向角度散射光(FSC)大小。结果:正常对照组系膜细胞中P21mRNA有一定表达。高糖组P21mRNA表达明显增加为正常对照组的3.89倍(P<0.01);FSC为正常对照组的1.42倍(P<0.01)。不同浓度胰岛素组系膜细胞P21mRNA表达及FSC大小随胰岛素浓度增加而增加,但无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)P21mRNA在正常肾小球系膜细胞有一定表达。(2)高糖刺激可使系膜细胞P21mRNA表达上调,且与渗透压无明显关系。(3)P21mRNA表达上调可导致系膜细胞肥大,在糖尿病肾病发病机制中起重要作用。     

线粒体神经酰胺酶上调K562细胞Bcl-2蛋白表达水平

最近，克隆了一种新的选择性定位于线粒体的神经酰胺酶，提示线粒体存在着神经酰胺代谢途径，可能对线粒体的功能，特别对凋亡产生影响。本研究将线粒体神经酰胺酶基因转染到K562细胞，以此了解线粒体神经酰胺酶的细胞生物学效应。以脂质体介导将含有线粒体神经酰胺酶cDNA的pcDNA3．1／His—CDase质粒转染到K562细胞，G418筛选阳性克隆，建立稳定表达线粒体神经酰胺酶的K562TC细胞株。用MTT法、annexin V／PI法、FCM及Westernblot分别检测K562与K562TC细胞在细胞毒药物抗性、血清剥夺耐受性及Bcl-2蛋白表达水平方面的差异。结果表明：虽然K562TC与K562细胞对阿霉素、足叶乙甙及亚砷酸的敏感性没有差异，但是K562TC细胞Bcl-2蛋白水平明显升高，抗血清剥夺能力明显增强。以硫代反义寡核苷酸特异性封闭K562TC细胞线粒体神经酰胺酶，下调Bcl-2蛋白表达水平；二甲基鞘氨醇(鞘氨醇激酶抑制剂，降低细胞内1-磷酸鞘氨醇水平)同样下调K562TC细胞Bcl-2蛋白表达水平，而1-磷酸鞘氨醇明显上调K562细胞Bcl-2表达水平。结论：线粒体神经酰胺酶将线粒体神经酰胺代谢为鞘氨醇，进而在鞘氨醇激酶作用下生成1-磷酸鞘氨醇，此代谢途径上调K562细胞Bcl-2蛋白表达水平。     

人Leptin基因融合蛋白表达载体构建及对人成骨细胞的作用术

背景：瘦素作为一种内分泌激素参与机体能量代谢的调节,近年来瘦素对骨代谢的调节作用也越来越被人们所重视。目的：克隆人Leptin基因,构建重组原核表达载体PEGX-5X-3／Leptin并在大肠杆菌中表达,观察Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长抑制作用。设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-07／2008-05在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。材料：新鲜的脂肪组织取自苏州大学附一院（供者知情并同意）、大肠杆菌DH5n、人成骨细胞由苏州大学附属第一医院骨科实验室保种。方法：从人脂肪组织中提取RNA,采用反转录-聚合酶链式反应获得人Leptin全部序列,克隆入带有GST原核细胞表达载体PEGX-5X-3中,实现插入基因的融和表达,用SDS．PAGE和WesternBlot对表达产物进行鉴定,提取并纯化GST-Leptin融合蛋白,以5,10,20,40mg／L不同质量浓度与人成骨细胞共培养,同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组,四甲基偶氮唑盐法测两组人成骨细胞的体外增殖情况。主要观察指标：①Leptin基因的克隆与鉴定。②重组质粒的双酶切及聚合酶链反应鉴定。③融合蛋白的表达。④GST-Leptin融合蛋白的纯化。⑤GST-Leptin融合蛋白的鉴定。⑥GST-Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长影响。结果：反转录一聚合酶链反应扩增得到的特异性片段长度约为450bp,以此构建的重组质粒PEGX一5X-3／Leptin,经BamHI和XhoI双酶切后显示5kb和450bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中报道的完全一致,证明Leptin基因已成功地克隆到了原核表达载体PEGX-5X-3中。并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量（M）同预期值相一致,融合蛋白为M45000,GST蛋白为M29000,与GST蛋白组相比,20,40mg／L的GST-Leptin融合蛋白可以明显促进细胞的生长（P〈0．05）,且其促进作用有一定的浓度依赖性。结论：成功构建了PEGX-5X-3／Leptin重组原核表达载体,在E-coliBL21中表达GST-Leptin融合蛋白,并以浓度依赖性促进人成骨细胞的生长。     

肿瘤及白血病细胞肺耐药相关蛋白基因的表达

肺耐药相关蛋白是最新发现的又一种与多药耐药腾的蛋白质，它量种非糖蛋白，与Ｐ糖蛋白及多药耐药相关蛋白的作用机制不同，它在某些肿瘤及急性髓系白血病中过度表达与临床化疗敏感性及预后有关。     

肿瘤及白血病细胞肺耐药相关蛋白基因的表达

肺耐药相关蛋白是最新发现的又一种与多药耐药有关的蛋白质,它是一种非糖蛋白,与P糖蛋白及多药耐药相关蛋白的作用机制不同。它在某些肿瘤及急性髓系白 血病中过度表达与临床化疗敏感性及预后有关。     

成骨细胞龛通过上调白血病细胞IL-1的表达促进白血病干细胞增殖的研究

目的：探索骨髓微环境对白血病干细胞的调控机制,阐明成骨细胞龛是否通过上调白血病细胞中白细胞介素-1(IL-1)的表达,促进白血病细胞的增殖及自我更新。方法：获取AML1-ETO9a(AE9a)小鼠白血病模型的小鼠骨内膜和骨髓腔的白血病细胞,进行转录组测序（RNA-seq）,利用GSEA对转录组差异基因进行功能富集分析;实时荧光定量PCR检测并验证与成骨细胞共培养后,AE9a小鼠白血病细胞中IL-1的表达。同时采用实时荧光定量PCR测定43例急性髓系白血病（AML）患者中IL-1的表达;通过集落培养体系检测在与成骨细胞共培养后及加入IL-1β,AE9a小鼠白血病细胞的集落形成能力。结果：RNA-seq及GSEA分析结果显示,在AE9a白血病小鼠,骨内膜区域的白血病细胞中表达上调的基因,显著富集于炎症通路相关分子,其中IL-1α和IL-1β在骨内膜区的白血病细胞中的表达均显著高于骨髓腔内的白血病细胞（IL-1α:P<0.001, IL-1β:P<0.001）。与成骨细胞共培养后,AE9a小鼠白血病细胞IL-1α和IL-1β表达升高,分别是未与成骨细胞共培养的2.5倍和3.5倍,...     

胆囊癌组织星形胶质细胞上调基因1异常表达与临床病理及预后的关系

目的 探讨胆囊癌组织星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)表达与临床病理及预后的关系.方法 选取2016年1月至2018年6月收治的128例胆囊癌患者,均于术后进行癌组织AEG-1检测.随访2年,记录生存时间.采用多因素COX回归分析胆囊癌患者预后影响因素,绘制Kaplan-Meier生存曲线.结果 128例患者癌组织A...     

星形细胞上调基因-1在原发性肝细胞癌组织中的表达及意义

目的探讨星形细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)在原发性肝细胞癌组织中的表达及其意义。方法 60例肝细胞癌患者,取其肝癌组织60份为肝癌组,癌旁肝组织54份为对照组,采用荧光定量PCR法检测2组AEG-1mRNA表达情况,采用Western blot法检测AEG-1蛋白表达情况,采用免疫组织化学法检测AEG-1阳性表达率,分析AEG-1蛋白表达与病理指标间的关系。结果肝癌组AEG-1mRNA和蛋白相对表达量(4.71±2.87、1.27±0.62)及AEG-1阳性表达率(53.3%)均明显高于对照组(1.43±0.49、0.69±0.25、29.6%)(P0.05);肝癌组织AEG-1阳性表达水平在肿瘤转移及病理分级上差异无统计学意义(P0.05)。结论 AEG-1在原发性肝细胞癌组织中特异性表达增高,可能是诊断原发性肝细胞癌的生物学标记物。     

他克莫司对人肾小球系膜细胞细胞周期相关蛋白表达的影响

目的探讨他克莫司对体外培养的人肾小球系膜细胞细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E及p27kip1的影响及可能机制。方法设正常对照组和他克莫司处理组,他克莫司组设为三个组(浓度分别为10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)。四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测他克莫司组处理12h后肾小球系膜细胞的增殖情况;流式细胞仪检测他克莫司组分别作用12、24、48h后系膜细胞的上述三种蛋白质及与其结合的CDK2和CDK4的表达情况;选择有明显抑制作用的时间点(12h),Westernblot检测上述三种蛋白质的表达情况。结果 (1)作用12h,他克莫司组均能抑制系膜细胞的增殖。(2)作用12、24、48h,与对照组相比,浓度为10μmol/L他克莫司对细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E及抑制因子p27kip1的表达无明显影响,而浓度为25、50μmol/L时,cyclin D1及cyclin E明显降低,p27kip1表达明显升高,呈一定的剂量效应关系;且相同浓度的他克莫司在作用三个时间点后,cyclin D1、cyclin E及p27kip1的表达无明显差异。(3)作用12h,与对照组相比,浓度为10μmol/L他克莫司对周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK4的表达无明显影响,而浓度为25、50μmol/L时,CDK2、CDK4的表达明显降低。结论一定浓度的他克莫司可抑制系膜细胞的增殖,其作用机制至少部分与其影响细胞周期相关蛋白的表达有关。     

糖尿病骨折大鼠骨痂组织中成骨细胞增殖和骨钙素表达与骨形态发生蛋白2干预的关系

背景:有研究表明,糖尿病患者骨折愈合过程中局部骨形态发生蛋白2明显降低,成骨细胞增殖能力下降,骨折延迟愈合,或者不愈合.目的:观察骨形态发生蛋白2治疗糖尿病大鼠骨折愈合过程中骨痂组织成骨细胞增殖和骨钙素的表达,分析骨形成蛋白在糖尿病大鼠骨折愈合过程中的作用.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-09/12在昆明医学院动物实验中心完成.材料:SD雄性大鼠30只,20只腹腔内注射链脲佐菌素破坏胰岛细胞诱导为糖尿病大鼠后,随机均分为骨形态发生蛋白2组、模型对照组,另10只为正常对照大鼠,腹腔内注射等容量生理盐水.方法:3组大鼠行右胫骨上段骨折建立大鼠胫骨骨折模型.骨形态发生蛋白2组用10 μ g/kg骨形态发生蛋白2治疗,模型 对照组及正常对照组给予等渗量生理盐水.主要观察指标:伤后第1,2,4,6周X射线片观察骨折愈合情况,光镜下观察骨痂内成骨细胞数量,放射免疫法测定血清骨钙素表达.结果:骨形态发生蛋白2、正常对照组X射线片显示骨痂生成量多,骨折愈合程度明显优于模型对照组(P<0.01)骨形态发生蛋白2组成骨细胞数量明显多于模型对照组,略低于正常对照组.各组血清骨钙素均呈上升趋势,在第2周达到峰值.第4用下降,至第6周进一步下降.模型对照组骨钙素升高幅度明显低于正常对照组(P<0.01),并且低于骨形态发生蛋白2组.骨形态发生蛋白2组、正常对照组的骨钙素差异无显著性意义.结论:糖尿病大鼠骨折愈合过程中较正常大鼠,骨钙索水平降低,成骨细胞增殖下降,采用骨形态发生蛋白2治疗可提高骨钙素水平,促进成骨细胞增殖.促进骨折愈合.     

bcl-2基因蛋白在急性髓系白血病中的表达及意义

急性髓系白血病（ＡＭＬ）是血液系统的常见恶性肿瘤,它的病因及发病机制尚未阐明。近来认为白血病是由于造血干细胞的增殖与凋亡失控所致。ｂｃｌ２基因是细胞凋亡的主要调控基因［１］,它不仅通过抑制细胞调亡而导致白血病的发生,而且与白血病的疗效、预后关系密切［２,３］。本文旨在探讨ｂｃｌ２基因在ＡＭＬ中的表达水平及其与临床生物学特征的相关性,以进一步阐明其对白血病的发生、治疗、预后判断的意义。１　临床资料１．１　一般资料　７２例ＡＭＬ患者系本院１９９８年４月至１９９９年４月期间门诊或住院病人,其中男４…     

高糖、胰岛素影响肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白4 mRNA表达的研究

目的:探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白4 mRNA表达的影响,进一步研究GluT4在糖尿病肾病发病中的作用。方法:将培养的鼠1097系膜细胞分为8组:正常对照组,生理浓度胰岛素组(10-9M),低浓度胰岛素组(10-8M),高浓度胰岛素组(10-6M),高糖组(30mM),甘露醇组,高糖加高浓度胰岛素组,高糖加生理浓度胰岛素组。采用RT-PCR法检测GluT4 mRNA含量。结果:①正常系膜细胞可检测到GluT4mRNA。②高糖组GluT4 mRNA表达为对照组的58.7%(p<0.05);10-8M胰岛素组、10-6M胰岛素组分别为对照组的230.2%和297.2%(P<0.01);高糖加10-6M胰岛素组,高糖加10-9M胰岛素组分别为高糖组的170.6%和140.3%(p<0.05)。结论:①正常系膜细胞有GluT4 mRNA表达。②高糖可抑制GluT4 mRNA表达,胰岛素有一定拮抗作用,且呈剂量依赖性。③GluT4是糖尿病肾病发生发展中的重要因子。     

急性髓系白血病细胞p16基因结构及mRNA表达分析

为了解p16基因在急性髓系白血病(AML)发病中的意义,用PCR-SSCP和Northern blot方法分析了16例AML细胞p16基因结构及mRNA的表达。研究结果表明,16例未发现p16基因的缺失、突变。初治和复发的12例AML的p16 mRNA表达水平明显低于4例长期缓解者及正常对照者。1例p53突变AML的p16 mRNA有明显升高,提示p16基因在AML发病中可能不占重要地位,而在AML细胞抑制正常造血的逐步恶化中起一定作用,在p53突变时,其表达反馈性升高显示一种反馈环路失衡。     

急性髓系白血病细胞p16基因结构及转录水平表达

目的：了解ｐ１６基因在急性髓系白血病（ＡＭＬ）发病中的意义。方法：用聚合酶链反应－单链ＤＮＡ构象多态性、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法分析１６例ＡＭＬ细胞ｐ１６基因结构及转录水平表达。结果：１６例均无ｐ１６基因的缺失、突变。初治和复发的１２例ＡＭＬ的ｐ１６ｍＲＮＡ表达水平明显低于４例长期缓解者及正常对照。１例ｐ５３基因突变ＡＭＬ的ｐ１６ｍＲＮＡ有明显升高。结论：ｐ１６基因在ＡＭＬ发病中可能不占重要地位，而在ＡＭＬ病态造血的维持中起一定作用，在ｐ５３突变时其表达反馈性升高，显示一种反馈环路失衡，提示在研究单个基因的基础上观察细胞周期检测点功能具有重要意义。