纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖-海藻酸钠复合骨水泥的性能

背景:目前普遍使用的黏合剂对粉碎骨折块进行黏合复位或多或少都存在一些缺陷。目的:研制具有黏接骨骼作用的生物活性骨水泥。方法:应用共沉淀法制备纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖-海藻酸钠复合材料作为骨水泥的固相粉体,将柠檬酸衍生物配制成溶液作为液相。通过优化实验,从骨水泥的固化时间、抗压强度、抗拉强度、抗稀散性等方面确定最佳配比。结果与结论:纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖-海藻酸钠质量比为65/35,其中羧甲基壳聚糖和海藻酸钠质量比为4:1时复合成粉体,并按固液比为1.0:0.5(g:mL)调拌后形成的骨水泥呈膏状,塑形性和抗稀散性能良好,固化时间12～18min,抗压强度为(4.5±2.1)MPa。体外黏接猪股骨头抗拉强度在不同室温下无显著性差异无显著性意义(P>0.05),固化后2h的抗拉强度达到24h的94%。骨水泥为多孔状结构,孔径为100～300μm,纳米羟基磷灰石分布较均匀。提示制备的纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖-海藻酸钠复合骨水泥具有良好的生物活性、适当的力学强度以及较好的黏合强度。     

纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖-海藻酸钠复合骨水泥的性能

背景：目前普遍使用的黏合剂对粉碎骨折块进行黏合复位或多或少都存在一些缺陷。目的：研制具有黏接骨骼作用的生物活性骨水泥。方法：应用共沉淀法制备纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖-海藻酸钠复合材料作为骨水泥的固相粉体,将柠檬酸衍生物配制成溶液作为液相。通过优化实验,从骨水泥的固化时间、抗压强度、抗拉强度、抗稀散性等方面确定最佳配比。结果与结论：纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖-海藻酸钠质量比为65/35,其中羧甲基壳聚糖和海藻酸钠质量比为4：1时复合成粉体,并按固液比为1.0：0.5（g：mL）调拌后形成的骨水泥呈膏状,塑形性和抗稀散性能良好,固化时间12～18min,抗压强度为（4.5±2.1）MPa。体外黏接猪股骨头抗拉强度在不同室温下无显著性差异无显著性意义（P〉0.05）,固化后2h的抗拉强度达到24h的94%。骨水泥为多孔状结构,孔径为100～300μm,纳米羟基磷灰石分布较均匀。提示制备的纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖-海藻酸钠复合骨水泥具有良好的生物活性、适当的力学强度以及较好的黏合强度。     

纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料与兔骨髓间充质干细胞的生物相容性

背景:清华大学材料科学与工程系冯庆玲教授等采用仿生学原理,制成一种塑形简便并且具有良好骨传导、骨诱导性的纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨修复材料.但制备的复合材料是否仍具良好的生物相容性尚不确切.目的:观察纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料与兔骨髓间充质干细胞的相容性.设计、时间及地点:体外观察实验,于2008-08/11在南方医科大学珠江医院中心实验室完成.材料:纳米羟基磷灰石,壳聚糖复合材料由清华大学材料系研制,孔隙率90%,孔径50-200 μm.骨髓间充质干细胞由2周龄健康新西兰大白兔股骨和胫骨骨髓绎密度梯度离心法获得.方法:将预湿后的纳米羟基磷灰石/壳聚糖材料置于培养板内,将第3代骨髓间充质干细胞接种于材料表面在体外复合培养.对照组为单纯骨髓间充质干细胞培养.主要观察指标:倒置显微镜、扫描电镜观察细胞和材料复合培养后细胞生长状况,计数细胞接种后1,2,4 h在材料表面的黏附状况,CCK-8检测细胞在复合材料卜的增殖状况,流式细胞仪榆测种植细胞的细胞周期.结果:骨髓间充质干细胞在复合材料表面上生长状况良好.细胞接种到复合材料1h时黏附率低于对照组(P＜0.05),但接种2,4 h后两组黏附率差异无显著性意义(P＞0.05).细胞接种后,两组均保持正常的分裂增殖速度(P＞0.05).材料组和对照组细胞皆为正常的二倍体细胞,未见异倍体细胞形成,复合材料对兔骨髓间充质细胞的细胞周期影响不大.结论:纳米羟基磷灰石/壳聚糖与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性.     

海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料与兔骨髓基质干细胞的体外细胞相容性

背景：采用仿生学原理，利用海藻酸钙、纳米羟基磷灰石及胶原按一定比例复合，制成一种可注射、可任意塑形且具有良好骨传导、骨诱导性的组织工程骨，其应用在微创外科技术中，具有组织损伤小、不破坏修复区血供、操作简便易行等优点。目的：验证海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料与兔骨髓基质干细胞的相容性。设计、时间及地点：对比观察实验，于2008-02／05在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。材料：2周龄健康新西兰大白兔用于骨髓基质干细胞的分离培养。海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料由清华大学材料系研制提供，孔隙率90％，孔径50～200μm。方法：选取生长良好的第5代兔骨髓基质干细胞与海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料体外复合培养。主要观察指标：共培养5d后倒置显微镜下观察细胞在材料表面、孔隙内的生长情况，扫描电镜下观察细胞在材料上附着情况。细胞和支架共培养后CCK-8法测定细胞活性。结果：骨髓基质干细胞能在海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料上良好地黏附、增殖、生长，细胞活性未受到海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料的影响。结论：海藻酸钙纳米羟基磷灰石胶原复合材料与兔骨髓基质干细胞有良好的细胞相容性。     

纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2与骨髓基质干细胞的体外培养

背景：纳米级羟基磷灰石支架材料复合骨形态发生蛋白2因子组织构建模式组合后对骨髓基质干细胞的作用是叠加促进或抑制作用以及其生物相容性如何？目的：验证纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2与骨髓基质干细胞在体外共同培养下的生物相容性和成骨性。方法：将兔骨髓基质干细胞体外培养、传代和扩增,经鉴定后将第3代细胞分别接种在对照组、骨形态发生蛋白2组、纳米羟基磷灰石组、纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组4种培养液中。结果与结论：对照组和纳米羟基磷灰石组的细胞倍增时间较骨形态发生蛋白2组、纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组两组长;骨形态发生蛋白2组和纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组细胞增殖能力及碱性磷酸酶测量值明显大于对照组和纳米羟基磷灰石组（P〈0.01）。提示纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2的组织构架不仅与骨髓基质干细胞之间具有良好的生物相容性,还可发挥骨形态发生蛋白2促进骨髓基质干细胞增殖和定向分化成骨的作用。     

壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物驻极体屏障膜的骨引导性

背景:当前应用于引导骨再生的屏障膜不具备骨引导性。目的:探讨极化后的复合生物膜对成骨细胞相容性和活性的影响。方法:采用栅控电晕法制备了壳聚糖/羟基磷灰石复合生物驻极体膜,检测驻极体膜上的表面电位衰减及接种成骨细胞后细胞的增殖分化情况。结果与结论:驻极体膜上的表面电位在第1天内急速衰减,但在接下来的9d内衰减速度逐渐减慢。相较于非极化膜,驻极体膜上的细胞边界明显,有较多的伪足,细胞增殖能力更强,碱性磷酸酶的表达也更高(P<0.05),但肌动蛋白直接免疫荧光结果无显著差异。结果显示该驻极体膜是一种新型的拥有骨引导性的屏障膜,可促进成骨细胞的增殖和分化。     

纳米羟基磷灰石对人骨髓基质干细胞体外成骨活性的影响

目的：观察人骨髓基质干细胞在纳米羟基磷灰石材料上的生长、分化特点以及成骨细胞形态. 方法：实验于2004-03/2005-07在中南大学湘雅医院医学实验室完成.①实验方法：采用密度梯度离心的方法分离人骨髓基质干细胞,加入含体积分数为0.1的新生牛血清的低糖DMEM完全培养基中作原代培养,细胞长至90%汇合时传代,取培养第3代细胞接种于纳米羟基磷灰石（卫生部肝胆肠研究中心纳米课题组提供）表面,并加入含1 mmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的培养基中诱导分化、培养.②观察指标：复合培养第2,4,6,8天后采用MTT法检测细胞增殖情况;复合培养7 d后行钙-钴法成骨细胞染色观察细胞分化情况;培养8 d后应用扫描电子显微镜观察细胞在材料上的生长情况. 结果：MTT法检测出的吸光值随着培养时间的增加而增大（P＜0.05）;经加入特定的成骨诱导体系培养7 d后,附着于材料的骨髓基质干细胞具有典型的成骨细胞形态,经钙-钴法染色后细胞胞浆中可见灰黑色颗粒或块状沉淀的阳性反应,细胞形态也多呈多角形或短矩形;培养8 d后扫描电镜可观察到材料孔隙内有细胞长入. 结论：人骨髓基质干细胞在纳米羟基磷灰石材料上生长良好,提示纳米羟基磷灰石适于骨髓基质干细胞的生长、分化,可作为骨组织工程的细胞外支架材料.     

纳米羟基磷灰石颗粒与成骨细胞相容性的研究

目的:将纳米羟基磷灰石颗粒(nano-hydroxyapatite,nHA)与体外培养的胎鼠颅顶骨源性成骨细胞共同培养,观察nHA与成骨细胞的相容情况及细胞形态。评价其细胞增殖性和细胞相容性。方法:将体外培养的胎鼠颅顶骨源性成骨细胞培养于标准培养基中,每个培养基中添加不同浓度的nHA颗粒,37.5℃、5%CO2孵箱内培养120 h。并以两个无添加物的培养基作为空白对照。分别在2、6、8、24、72、120 h测定成骨细胞的数量,并用透射电镜和倒置相差显微镜分别观察成骨细胞的形态和细胞显微结构。结果:实验1、2、3组在24、72、120 h时MTT吸光值与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。实验1、2、3组在2、6、8、24、72、120 h时成骨细胞数目与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。透射电镜观察结果显示,成骨细胞的细胞突中吸收了纳米颗粒。倒置相差显微镜观察结果显示,传代细胞在6 h内贴壁,细胞形态为长梭形、鳞片形、短梭形、圆形。结论:nHA材料具有很好的安全性和细胞相容性。     

纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合大鼠骨髓间充质干细胞的生物相容性

背景:纳米羟基磷灰石/聚己内酯是一种具有优良生物相容性和生物活性的典型生物复合材料.目的:分析纳米羟基磷灰石/聚己内酯电纺薄膜作为组织工程骨支架的可行性.方法:采用静电纺丝技术制备纳米羟基磷灰石/聚己内酯电纺薄膜,将其与第3代 SD 大鼠骨髓间充质干细胞复合培养,在地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C成骨诱导剂诱导下,诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化.结果与结论:纳米羟基磷灰石/聚己内酯支架具有合适的微孔结构,且孔道相互贯通.①倒置显微镜观察:复合培养7 d后细胞大部分为梭形,细胞开始分裂;14 d后,细胞生长比较旺盛,数量明显增多,细胞分泌基质并黏附于支架上.②扫描电镜观察:复合培养7 d后大量细胞位于支架孔隙内生长,增殖良好,细胞大多呈梭形,双极突起,形态较佳,呈立体状生长,并分泌基质,有纤维连接蛋白生成.表明纳米羟基磷灰石/聚己内酯支架具有良好的生物相容性,是骨组织工程的良好载体.     

纳米羟基磷灰石/壳聚糖/海藻酸钠复合材料修复下颌骨缺损

背景：有研究证实,纳米羟基磷灰石/壳聚糖/海藻酸钠三元复合材料具有一定的柔韧性和强度,具有与人体骨相似的生物活性。目的：观察纳米羟基磷灰石/壳聚糖/海藻酸钠复合材料修复兔下颌骨缺损的效果。方法：在18只健康新西兰大白兔两侧下颌骨制作10 mm×5 mm×5 mm的缺损,随机分为2组,实验组双侧骨缺损处植入纳米羟基磷灰石/壳聚糖/海藻酸钠复合材料,对照组双侧骨缺损处植入纳米羟基磷灰石/壳聚糖,植入后4,8,12周,应用锥形束CT观察各组缺损区材料降解、骨痂生长及骨连接情况,苏木精-伊红染色观察新骨生成。结果与结论：两组骨密度灰度值均随着时间延长逐渐增加,组内不同时间点间差异有非常显著性意义（P〈0.01）;在相同时间点条件下,实验组大体观察、锥形束CT观察及CT灰度值,以及组织学观察均优于对照组（P〈0.05）。在材料植入后第4-8周,两组植入材料均已逐渐降解,缺损区与骨组织相交接处模糊,有少量新骨生成,与受体骨组织结合紧密,其中以实验组较为明显;第8-12周,两组植入材料已经基本降解完全,与受体骨组织开始逐渐相融合,有新生骨组织进一步生成,骨缺损区域逐渐被修复,以实验组较为明显。结果表明纳米羟基磷灰石/壳聚糖/海藻酸钠可有效修复骨缺损,促进新骨生成。     

可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合骨髓间充质干细胞促进骨缺损的修复

背景:可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料是清华大学利用仿生学原理制备的一种较理想的组织工程新型材料,经过前期体外实验证明其具有良好的生物相容性和骨传导性.目的:观察骨髓间充质干细胞复合可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖材料在促进骨缺损修复中的作用.方法:用梯度离心和贴壁培养法收集兔骨髓间充质干细胞,分离、培养至第3代,然后与纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合.24只新西兰大白兔双侧股骨外侧髁钻孔,制备骨缺损模型.所有兔右侧股骨外侧髁缺损以骨髓间充质干细胞-纳米羟基磷灰石/壳聚糖局部植入作为实验组,其中20只兔左侧股骨外侧髁缺损以单纯纳米羟基磷灰石植入治疗作为对照组,4只兔左侧股骨外侧髁缺损旷置为空白组,于第12周末,分别行大体、影像学观察、组织形态学、观察该复合材料对兔骨缺损的修复效果.结果与结论:术后12周实验组植入体已与骨缺损处骨性愈合,明显见新生骨生成,骨缺损能够完全修复,对照组骨缺损处部分修复,部分骨皮质不连续.空白组缺损区尚未见修复,纤维结缔组织填充.术后12周,实验组见骨形成细胞较多,材料内见新生骨小梁相互连接成片;对照组少量骨细胞形成,骨量少,部分纤维组织填充.空白组未见骨形成细胞,纤维组织较多.结果表明,骨髓间充质干细胞-纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料具有骨缺损修复能力,其疗效优于单纯纳米羟基磷灰石材料.     

可注射藻酸盐支架与人骨髓基质干细胞的体外复合培养

背景:目前可注射组织工程骨的研究主要限于动物实验,若人骨髓基质干细胞与藻酸盐生物相容性良好,可注射组织工程骨将是极具前途的临床治疗手段。目的:体外观察人骨髓基质干细胞与可注射支架藻酸钙凝胶的生物相容性。方法:实验组将第2代人骨髓基质干细胞与藻酸钙凝胶复合培养,对照组单纯接种骨髓基质干细胞。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况,MTT法半定量检测细胞增殖情况。结果与结论:倒置显微镜下见实验组细胞生长良好,与对照组无明显差异。扫描电镜见骨髓基质干细胞在藻酸钙表面贴附、增殖良好,第6天时细胞已跨越微孔表面或向孔内生长。MTT法显示与对照组相比,实验组细胞增殖能力不受影响。结果初步表明藻酸钙与人骨髓基质干细胞体外生物相容性较好。     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石，胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09／2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料；纳米晶羟基磷灰石，胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨复合培养14d。主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨上的生长情况。结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10～12d左右即可稳定传代，传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石／胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d，分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。结论：纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

复合骨髓基质细胞的藻酸钙凝珠体外培养特征

背景载体材料是种子细胞生长微环境的重要组成部分,有实验进行了软骨细胞在藻酸钙凝胶载体中的长期体外培养.目的观察骨髓基质细胞复合藻酸钠形成的藻酸钙凝珠体外培养扩增后其细胞活力、组织形态学和细胞超微结构的变化.设计单一样本观察.单位郑州大学骨科研究所,上海第二医科大学骨科实验室.材料实验于2001-09/2002-03在上海第二医科大学骨科实验室完成.4～6周龄新西兰大白兔8只用于骨髓基质细胞提取.方法取白兔8只,麻醉后,用肝素预处理过的16号穿刺针于股骨第3转子下抽取骨髓1.0～2.0 mL,用于骨髓基质细胞培养,传代培养的骨髓基质细胞;制备藻酸钠溶液;藻酸钠复合骨髓基质细胞形成藻酸钙凝珠,细胞密度为1×109 L-1,体外培养4周.①骨髓基质细胞活力观察采用锥虫蓝染色,倒置相差镜下观察.②骨髓基质细胞组织学检测采用甲苯胺蓝染色.③骨髓基质细胞超微结构观察采用透射电镜检查.主要观察指标①骨髓基质细胞活力.②骨髓基质细胞组织学观察.③骨髓基质细胞超微结构观察.结果①骨髓基质细胞活力倒置相差显微镜下可见细胞为圆形,大小不一,部分细胞呈团状分布,胞核清楚,个别为双核细胞,几乎无蓝染细胞.②骨髓基质细胞组织学观察结果细胞与材料均匀混合,材料无着色;细胞均匀着色,大小不一,核大浆少,个别为双核或多核细胞,可见细胞分裂相;细胞结构完整、轮廓清楚,周围有少量的异染性反应.③骨髓基质细胞超微结构结构正常,无线粒体肿大及核糖体脱颗粒现象发生;胞核完整,形态幼稚且较大,呈圆形、椭圆形或不规则形,可见双核.结论①复合骨髓基质细胞的藻酸钙凝珠亲水性好,营养物质易于渗透,适合细胞生长、增殖.②骨髓基质细胞增生分裂能力活跃,通过体外培养,使体内骨髓基质细胞实现数目扩增是可行的.③藻酸钙复合骨髓基质细胞用于组织工程方法修复骨软骨缺损具有可行性.     

菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外标记免骨髓基质细胞

背景:为明确细胞移植后症状改善是否由移植所致,既往多采用侵袭性方法,但是这种方法不适用于动态追踪及人体研究.如果能够在合适示踪剂的帮助下,采用无创伤性影像学技术在活体识别、跟踪移植后细胞的存活状态,将显著提高细胞移植疗法的学术价值.目的:初步探讨菲立磁-多聚赖氨酸复合物体外磁性标记兔骨髓基质细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/08在珠江医院神经外科实验室完成.材料:2月龄新西兰大白兔8只,由广州中医药大学实验动物中心提供.菲立磁为Advanced Magnetic公司产品,多聚赖氨酸为sigma公司产品.方法:无菌条件下穿刺抽取兔股骨骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,收集第2代细胞,加入含白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子及胎牛血清的神经干细胞培养摹诱导5 d.将50 mg/L菲立磁和1.5 mg/L多聚赖氨酸混合,振荡30 min后,将复合物加入到细胞培养基中进行标记,孵育细胞24 h.主要观察指标:骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化情况,细胞内铁的鉴定,菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对细胞增殖或分化的影响.结果:骨髓基质细胞诱导后可见少量细胞的胞体变圆变大,突起缩短,随时间延长,圆形细胞逐渐增多,部分聚集成簇、成球,FITC荧光染色示巢蛋白呈阳性表达.普鲁士蓝染色结果显示99%以上骨髓基质细胞的胞质内出现细小的蓝色铁颗粒.在含菲立磁-多聚赖氨酸复合物的培养基中,骨髓摹质细胞可继续增殖和分化,但增殖分裂后细胞质内铁颗粒数量较增殖前有所减少,经鉴定部分为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞.结论:菲立磁-多聚赖氨酸复合物可在体外高效标记骨髓基质细胞,且标记后细胞的活性、增殖和分化能力不受影响.     

Osteogenic potential of bone marrow stromal cells

Bone marrow is the point of origin of several cell types, including stromal cells. Adherent bone marrow stromal cells can differentiate into chondrocytes, adipocytes and osteoblasts. Several substances which modulate the dynamics and differentiation of bone marrow stromal cells have been identified. Recently it has been discovered that those bone marrow cells which are non-adherent in tissue culture for 3 days have osteogenic potential comparable to that of whole bone marrow cells. In the future, implantation of non-adherent bone marrow stromal cells may be of use as an aid in bone fracture healing, similar to whole marrow or adherent stromal cell grafting at present.