HIF-1α在大鼠角膜碱烧伤后的作用研究

目的检测大鼠角膜碱烧伤后缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达变化,探讨其在角膜碱烧伤损伤机制中的作用。方法建立大鼠角膜碱烧伤模型,采用免疫组织化学与原位杂交技术,检测角膜碱烧伤后不同时间HIF-1α在角膜各层中的表达变化。结果在正常角膜组织中,角膜各层均未见HIF-1α免疫染色,碱烧伤后1d时HIF-1α免疫活性增强,且3d时表达最强,15d时明显下降,30d时仍有高于正常水平的弱表达。原位杂交检测中正常角膜组织有极弱的HIF-1α mRNA表达,碱烧伤后HIF-1α mRNA表达增强,在伤后3d、7d时表达最明显,15d后表达强度恢复至正常组织水平。结论HIF-1α参与碱烧伤后角膜的损伤病理机制,其表达变化影响新生血管形成过程,为寻找角膜碱烧伤新的治疗途径提供了理论依据。     

小鼠角膜碱烧伤后缺氧诱导因子-1α和水通道蛋白-1在角膜中的表达

目的　检测小鼠角膜碱烧伤后缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α）及水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP1）的表达情况,探讨角膜碱烧伤后HIF-1α及AQP1在其损伤机制中的作用。方法　选用健康成年雌性昆明系小鼠48只,左眼为对照组,右眼用1 mol·L^-1 NaOH建立角膜碱烧伤模型,并随机分为碱烧伤后1 d组、4 d组、7 d组、14 d组,每组12只,免疫荧光染色法和实时荧光定量PCR法检测碱烧伤后角膜HIF-1α、AQP1的表达情况。结果　免疫荧光染色结果显示,对照组中HIF-1α在角膜上皮基底膜弱表达,碱烧伤后1 d HIF-1α在角膜上皮层表达开始增强,4 d在角膜上皮层和基质层均表达,至7 d时HIF-1α表达达到峰值;对照组中AQP1在角膜内皮层弱表达,碱烧伤后1 d,AQP1在角膜内皮层表达开始增强,4 d和7 d时AQP1在角膜内皮层和基质层均表达,且表达更强。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组（188.70±33.99）相比,碱烧伤后1 d组（269.70±15.68）、4 d组（350.50±67.26）、7 d组（272.10±6.88）的HIF-1α mRNA相对表达量增加,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;与对照组（36.43±3.95）相比,碱烧伤后1 d组（61.90±5.45）、7 d组（48.34±1.33）的AQP1 mRNA相对表达量增加,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　碱烧伤引起了角膜病理性变化,HIF-1α和AQP1参与碱烧伤后角膜损伤的病理机制。     

小鼠角膜碱烧伤后前炎性因子、趋化因子及其受体的表达

目的检测前炎性因子、趋化因子及其受体在小鼠角膜碱烧伤后表达的动态变化。方法建立小鼠碱烧伤模型，用RT—PCR法检测角膜碱烧伤后不同时间点前炎性因子、趋化因子及其受体mRNA的表达。结果RT-PCR检测显示，角膜碱烧伤后角膜组织中前炎性因子IL-1d、IL-1B及IL-6表达增强；调控单核细胞迁移的CCR1-CCL2、CCL3、CCIA、CCR2-CCL2以及调控中性粒细胞迁移的CXCR2-CXCL2表达增强。结论角膜碱烧伤后前炎性因子以及参与调控白细胞迁移的趋化因子及其受体明显上调，提示其参与角膜碱烧伤后白细胞向局部的迁移。     

二十碳五烯酸对大鼠角膜新生血管核转录因子KB及细胞因子表达的抑制作用

背景角膜新生血管（CNV）是炎症性角膜病变导致视力下降和角膜移植后发生排斥反应的重要原因,其发生机制和治疗一直是国内外角膜病研究的热点。目的探讨二十碳五烯酸（EPA）对碱烧伤大鼠CNV核转录因子KB（NF—KB）、白细胞介素1α（IL一1αt）、IL一6表达的影响及作用机制。方法用浸有1mol／LNaOH的3mm圆形滤纸贴附于72只SD大鼠的右眼角膜中央30s制作角膜碱烧伤模型,用随机数字表法将大鼠随机分为3个组,另6只匹配的正常大鼠作为正常对照组。碱烧伤0．02mgEPA治疗组和碱烧伤0．03mgEPA治疗组大鼠分别于碱烧伤后即刻结膜下注射0．04ml剂量为0．02mg或0．03mgEPA,碱烧伤模型组结膜下注射0．04ml生理盐水,正常对照组大鼠未行结膜下注射。大鼠干预后每天裂隙灯下观察CNV的生长面积和角膜水肿。分别于造模后24h,4、7、14d过量麻醉处死动物后制备角膜标本,采用苏木精一伊红染色法检测各组大鼠角膜的组织病理学变化,免疫组织化学方法检测各组大鼠角膜组织中CD34的表达以计数血管内皮细胞,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及蛋白印迹法分别检测各组大鼠角膜组织中IL-1α-mRNA和IL．6mRNA的表达及NF—KBp65的蛋白表达。结果裂隙灯下见造模后2～4d,CNV缓慢生长,角膜水肿,上皮缺损;造模后7～10d,CNV面积增加,角膜水肿减轻;造模后14d,CNV面积最大,血管变细。苏木精一伊红染色显示,碱烧伤后7d碱烧伤组角膜上皮部分缺损,基质层水肿明显,可见较多炎性细胞及大量CNV;碱烧伤0．03mgEPA治疗组与碱烧伤0．02mgEPA治疗组均可见角膜上皮修复,基质层水肿减轻,少量炎性细胞,未见CNV。碱烧伤后7d和14d,碱烧伤0．02mgEPA治疗组CNV相对面积分别为（15．80±6．43）％、（11．06±2．14）％,碱烧伤0．03mgEPA治疗组为（16．10±7．41）％、（11．06±2．51）％,均明显小于碱烧伤组的（84．74±7．77）％、（89．63±7．50）％,差异均有统计学意义（P〈0．05）。碱烧伤后7d,碱烧伤组CD34在CNV的内皮细胞中呈强阳性表达,而在碱烧伤0．02mgEPA治疗组、0．03mgEPA治疗组角膜中未见表达。RT—PCR检测结果表明,碱烧伤后4d,碱烧伤0．02mgEPA治疗组、0．03mgEPA治疗组IL一1α、IL一6mRNA在角膜组织中的表达量明显低于碱烧伤组,蛋白印迹检测证实NF—KBp65蛋白在角膜组织中的表达低于碱烧伤组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论EPA能够抑制NF—KB、IL一1α、IL一6的表达,从而抑制碱烧伤后CNV的生长。     

BMPR-IA在实验性大鼠角膜碱烧伤中的表达及意义

目的 探讨大鼠角膜碱烧伤后,骨形态发生蛋白受体IA(BMPR-IA)在角膜中的表达及意义.方法 采用1moL/L的氢氧化钠溶液烧灼大鼠角膜表面,建立角膜碱烧伤动物模型;分别于烧伤后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d处死大鼠,摘除角膜作病理切片,用免疫组织化学染色方法检测正常对照组及角膜碱烧伤后不同时段BMPR-IA在角膜各层次中的表达,并用计算机图像分析系统进行结果分析.结果 正常大鼠角膜组织表达BMPR-IA;角膜碱烧伤后,BMPR-IA在角膜上皮层的着染程度明显增强,且浸润的新生血管内皮细胞和炎细胞均染色阳性.在各实验组中,烧伤后1 d组表达最强(P＜0.05).烧伤后3 d、5 d时表达逐渐下降,至14 d时表达恢复正常水平.结论 碱烧伤后,角膜组织中BMPR-IA的表达显著增高,提示BMPR-IA在角膜损伤修复过程的早期发挥重要作用.     

水通道蛋白1在大鼠角膜碱烧伤新生血管形成中的表达

目的检测大鼠角膜碱烧伤后新生血管形成过程中水通道蛋白1（AQP1）的表达变化,探讨其在角膜新生血管（CNV）形成中的作用。方法碱烧伤诱导CNV模型,将25只sD大鼠按处死的时间点不同分成5组,每组5只。每日裂隙灯下观察CNV的生长情况,并采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测AQP1及VEGF在大鼠CNV形成中的表达。结果在正常大鼠角膜组织中,AQP1和VEGF不表达或弱表达。碱烧伤后1d,AQP1表达开始增强,第7天表达最强,14d下降,21d时仍有弱表达。RT—PCR检测显示碱烧伤后AQP1表达增强,在伤后第7天表达最明显,21d后呈弱表达（t1d=3．491,t4d=10．690,t7d=12．936,t14d=10．767,t21d=8．594,P〈0．05）。免疫组织化学检测结果表明,VEGF与AQP1的表达分布相似,强度较弱,统计学分析表明二者的表达水平呈正相关（r=0．834,P〈0．05）。结论AQP1在碱烧伤后角膜巾的表达水平与新生血管的形成明显相关。     

碱烧伤小鼠角膜组织中SDF-1／CXCR4的表达及意义

目的探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）和CXCR4在小鼠角膜碱烧伤新生血管形成中的作用。方法应用在角膜中央放置NaOH滤纸片的方法构建C57／BL小鼠角膜碱烧伤角膜新生血管动物模型,通过免疫组织化学、RT—PCR、Western blot法检测碱烧伤后不同时间点角膜组织中SDF-1和CXCR4 mRNA及蛋白的表达情况。结果免疫组织化学检测显示,正常小鼠角膜基质层无明显SDF-1的阳性表达,CXCR4仅在角膜上皮层呈弱阳性表达。RT—PCR检测显示,与正常对照组相比,碱烧伤后各时间点SDF-1和CXCR4 mRNA表达均明显升高（P〈0．05）;Western blot检测显示SDF-1和CXCR4蛋白的表达也可见相似的变化趋势（P〈0．05）。SDF-1和CXCR4在角膜中的表达于第7天达高峰,第14天开始下降,但仍高于正常。结论SDF-1／CXCR4在碱烧伤后小鼠角膜组织中的表达增加,在角膜碱烧伤的炎症和新生血管的形成和发展过程中可能发挥重要作用。     

缺氧诱导因子-1α及促红细胞生成素在大鼠角膜新生血管中的表达

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)在碱烧伤大鼠角膜组织中的表达,评估其在角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)发生发展中的作用。方法:健康3月龄SD大鼠,随机分为实验组和对照组,碱烧伤法建立CNV模型,分别于造模成功后1,3,5,7,14d测量CNV的长度并计算面积,同时取角膜组织以免疫组织化学检测HIF-1α及EPO的表达部位,并以RT-PCR法检测其mRNA的表达情况,实验数据采用SPSS 20.0处理。结果:碱烧伤后1,3,5,7,14d,CNV的面积随时间逐渐增加,7d生长最为旺盛,14d后生长减慢。免疫组织化学提示:正常角膜各层未见HIF-1α的表达,可见微量EPO,碱烧伤后1d时HIF-1α及EPO免疫活性增强,主要表达于角膜上皮及内皮层。RT-PCR结果显示HIF-1α及EPO mRNA的表达在正常大鼠角膜组织中表达极少,在角膜碱烧伤后3d表达增强,7d达到高峰,14d后明显下降;不同时间点组间比较存在统计学差异(P<0.05)。结论:HIF-1α和EPO与CNV的形成密切相关。     

大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜中的表达

目的:研究大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜组织中的表达。方法:采用角膜碱烧伤法对60只Wistar大鼠制作角膜新生血管模型。裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管生长情况,免疫组化法检测碱烧伤后不同时间角膜组织中CD105的表达。结果:大鼠角膜碱烧伤后2d角膜新生血管开始形成,3～7d生长旺盛,新生血管面积达到最大,10～14d角膜新生血管生长停滞。在新生血管化角膜组织中,CD105于3～7d表达最明显,14d后表达微弱。结论:大鼠角膜碱烧伤后CD105在新生血管化角膜组织中有明显表达。     

血管内皮生长因子及其受体在大鼠碱烧伤后角膜新生血管中的表达

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flk-1在大鼠角膜碱烧伤后新生血管中的表达。方法:应用1mol/LNaOH制作大鼠碱烧伤新生血管模型,随机分为3组,分别于1,4,7及14d处死大鼠取出角膜,免疫组织化学方法和RT-PCR方法检测大鼠角膜中的VEGF及其受体Flk-1的表达。结果:正常大鼠角膜中VEGF及Flk-1受体弱表达或不表达。二者均在角膜上皮层,基质层、内皮层及新生血管内皮细胞表达;大鼠角膜碱烧伤后各时间点VEGFmRNA和Flk-1mRNA相对表达量具有相关性。结论:大鼠角膜碱烧伤后,VEGF及其受体Flk-1结合诱导内皮细胞分化及角膜新生血管形成。     

鼠角膜碱烧伤后血管内皮细胞生长因子在其角膜中的表达及意义

目的：探讨角膜碱烧伤后血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)在鼠角膜中的表达及意义。方法：采用1mol/L氢氧化钠溶液烧伤Sprayue-Dawley(SD)大鼠角膜,建立炎症性角膜新生血管动物模型;用免疫印迹分析SD大鼠角膜烧伤后不同时间段VEGF蛋白在角膜中的表达量;免疫组织化学染色方法检测SD大鼠角膜烧伤后VEGF蛋白在角膜各层中的分布。结果：正常SD大鼠角膜中未检出VEGF蛋白;伤后6h,鼠角膜可检测出VEGF蛋白;伤后96h时,角膜中VEGF蛋白达高峰;伤后168hVEGF蛋白表达量下降,伤后SD大鼠角膜基质层,尤其是毗邻于烧灼区的浅基质层中有大量炎性细胞浸润,浸润的炎性细胞和新生血管内皮细胞均有VEGF蛋白表达。结论;炎性细胞分泌的VEGF蛋白参与了炎症性角膜新生血管增殖的调控,对新生血管的生长有诱导和维持作用。     

大鼠角膜碱烧伤后碱性成纤维细胞生长因子在角膜中的表达及意义

目的 探讨大鼠角膜碱烧伤后成纤维细胞生长因子（bFGF）在角膜中的表达和意义。方法 采用碱烧伤大鼠角膜建立角膜炎症性新生血管动物模型；免疫印迹法检测大鼠角膜碱烧伤后不同时间段bFGF在角膜中的表达；免疫组织化学方法检测大鼠角膜碱烧伤后bFGF在角膜不同组织层次的表达。结果 免疫印迹法检测显示：去除上皮后的正常大鼠角膜无bFGF表达；碱烧伤后96h，大鼠角膜可检测出bFGF表达，随着时间进展，bFGF蛋白表达量逐渐增加。免疫组化结果：正常大鼠角膜上皮层表达bFGF；碱烧伤后角膜上皮层bFGF着染程度逐渐增强，在碱烧伤后48h以前，基质层浸润的炎症细胞无bFGF着染，96h以后，浸润的炎症细胞和新生血管内皮细胞均呈bFGF阳性。结论 bFGF未参与碱烧伤后角膜新生血管增殖的早期诱导，对角膜炎症性新生血管的增殖仅起到后续支持作用。     

Avastin对大鼠角膜新生血管的抑制及超微结构的影响

目的:探讨Avastin对角膜新生血管形成及角膜内血管内皮生长因子(VEGF)的影响及其超微结构的影响。方法:Wistar大鼠96只随机分3组,采用碱烧伤的方法制备大鼠角膜新生血管模型;正常不烧伤组4只。烧伤后隔日球结膜下注射0.1mL生理盐水组32只,烧伤后隔日球结膜下注射Avastin0.1mL组32只,烧伤后隔日球结膜下注射地塞米松0.1mL组32只。碱烧伤术后在裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜混浊度;宏观测量新生血管长度;组织病理切片HE染色作微血管计数;透射电镜观察超微结构的改变;免疫组化检测角膜VEGF的蛋白表达情况;CD34标记新生血管,显微镜下微血管计数方法研究角膜新生血管形成及抑制情况。结果:治疗组在3,7,10,14d较对照组角膜混浊程度轻(P<0.05);14d形成的新生血管数量较对照组少(P<0.05)。实验组新生血管微血管数量减少,VEGF蛋白表达下降,具有统计学差异。VEGF主要表达在角膜受损区的感染细胞胞质内,其出现时间与位置与角膜新生血管一致。Avastin和地塞米松均可有效抑制角膜新生血管,减少角膜内VEGF表达,两者无统计学差异,结膜下注射Avastin和地塞米松后,大鼠角膜超微结构无除烧伤后其它显著改变。结论:Avastin和地塞米松可抑制角膜新生血管,减少角膜内VEGF表达,对角膜的超微结构均无显著毒性。     

GM6001对碱烧伤角膜组织中基质金属蛋白酶表达及活性的影响

目的 检测正常和碱烧伤后不同时间角膜组织中明胶酶(MMP-2，MMP-9)和胶原酶(MMP-1)的表达，探讨在角膜融解发生中的作用．方法 兔角膜碱烧伤20眼，分为对照组和GM600l治疗组，于伤后12、24、48、72h，1、2周和1个月取材，酶谱法检测角膜组织中明胶酶MMP-2、MMP-9的表达，Western blot检测胶原酶MMP-1的表达。结果 在正常兔角膜中，仅检测到微弱的明胶酶原MMP-2，碱烧伤后1周后开始明显升高，至烧伤后1个月维持较高水平，并在2周时出现MMP-2活性酶的表达，并持续至烧伤后1个月。明胶酶MMP-9在正常角膜组织中检测不到，但烧伤后24h开始表达，于烧伤后1周达到最高，然后逐渐下降，至伤后1个月已检测不到。胶原酶MMP-1在正常组织中检测为阴性，从伤后24h开始升高，1个月内无下降。GM6001治疗组角膜组织MMP-2、MMP-9及MMP-1的表达均明显低于对照组。结论 基质金属蛋白酶参与碱烧伤角膜组织的融解，GM6001可抑制MMPs的活性，进而抑制角膜融解的发生。     

SPARC基因在角膜碱烧伤中的表达

目的　动态检测酸性富含胱氨酸分泌型蛋白 (SPA RC)在角膜碱烧伤中的表达 ,为探讨 SPA RC基因在角膜创伤中的作用提供依据。方法　首先建立角膜碱烧伤模型 ,并设角膜物理损伤组为对照组 ,在不同时间段提取各组角膜上皮细胞总RN A。用基因引物进行逆转录 -聚合酶链反应 (RT - PCR )扩增 ,半定量 SPA RC m RN A的表达水平。然后对 PCR扩增结果用限制性内切酶酶切验证。在取角膜上皮之前 ,对受试动物进行裂隙灯检查 ,以判断角膜碱烧伤程度与基因表达的关系。结果　(1)正常角膜上皮细胞可见 SPA RC基因的低表达 ;(2 ) SPA RC在角膜碱烧伤及物理损伤后均见较高水平表达 ,且与正常细胞表达相比较有显著的统计学差异 (P<0 .0 5) ;角膜创伤越严重 ,基因表达水平越高 ;(3 )所检测基因表达结果与显微镜观察角膜水肿、混浊、角膜新生血管等损伤结果呈同步趋势。结论　 SPARC在角膜碱烧伤和创伤过程中具有高水平表达。是角膜创伤修复过程中的重要因素。     

Expression of integrins and MMPs during alkaline-burn-induced corneal angiogenesis

PURPOSE: To determine in a corneal alkaline burn model of angiogenesis whether the expression of integrins and MMPs is consistent with a VEGF-induced angiogenic response. METHODS: Neovascularization in female Sprague-Dawley rats was induced by alkaline cauterization of the central cornea. RT-PCR for integrins alpha(1), alpha(2), beta(3), and beta(5); the endothelial marker CD31; and metalloproteinases MMP-2 and MT1-MMP was performed on naive corneas and on cauterized corneas 72 and 288 hours after cautery. Analyses of protein and MMP expression were conducted on naive corneas and on cauterized corneas 24, 72, 120, and 168 hours after cautery by immunofluorescence microscopy and gelatin zymography. RESULTS: RT-PCR indicated a correlation between the induced angiogenic response and the expression of alpha(1) and beta(3) integrin subunits and MT1-MMP. Immunohistochemical analysis indicated that alpha(1), alpha(2), alpha(5), and beta(5) integrins and MMP-2 and MT1-MMP were expressed on the newly developing vasculature. The beta(3) integrin was preferentially expressed on platelets. CONCLUSIONS: Integrin expression during neovascularization of rat corneas in response to alkaline injury correlates with an angiogenic response that uses the VEGF/alpha(v)beta(5) pathway. MMP-2 and MT1-MMP, but not MMP-9, are expressed in a pattern consistent with their involvement in the angiogenic response.     

基质金属蛋白酶抑制剂治疗碱烧伤后兔角膜融解的研究

目的研究基质金属蛋白酶抑制剂(GM 6001)在治疗兔角膜碱烧伤后角膜融解中的作用.方法将28只兔随机分为A、B组,将浸有2 mol/L(16只)及1 mol/L(12只)氢氧化钠的滤纸片分别置于A、B组兔右眼角膜上制备角膜重和中度碱烧伤模型;每组均设治疗和对照组,A、B治疗组术眼分别滴浓度为400及200 mg/L的GM 6001滴眼液,对照组滴药物基质液;均治疗30 d,然后处死动物.观察其角膜融解及混浊等情况,并进行病理组织学检查.结果 A组对照组8只兔眼角膜自伤后(13±5) d开始全部发生融解,2只兔眼发生角膜穿孔;治疗组,仅有2只兔眼烧伤后(19±4) d发生角膜融解,无角膜穿孔;两组角膜融解发生率及角膜穿孔率比较,差异有显著意义(P<0.05).治疗组角膜融解开始的时间亦明显迟于对照组(P＜0.05).B组对照组6只兔角膜自伤后(14±6) d全部融解,1只兔眼角膜穿孔;治疗组2只兔眼角膜自伤后(19±4) d融解,无角膜穿孔;两组角膜融解发生率间比较,差异有显著意义(P＜0.05);治疗组角膜混浊程度明显低于对照组(P＜0.01).病理检查结果显示治疗组角膜胶原纤维破坏轻,炎性细胞浸润明显少于对照组.结论 GM 6001可抑制和延迟碱烧伤后角膜融解的发生和发展,降低角膜胶原纤维的破坏及角膜组织中炎性细胞的浸润.     

角膜碱烧伤中PMNs与MMP-9的关系

目的：研究角膜碱烧伤后基质损伤修复病程中多形核中性白细胞(PMNs)的浸润和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达的关系。

方法：建立25只家兔角膜碱烧伤模型,分别于伤后3、7、14、21、28d随机处死5只兔,裂隙灯下观察角膜病理修复情况,摘除角膜做病理切片,测定PMNs的浸润量值。免疫组化法测定MMP-9的表达。

结果：PMNs和MMP-9在角膜碱烧伤后的3d开始升高,14d上升达到最大峰值,之后逐渐降低,碱烧伤后角膜基质在第14d溃疡面积及深度最为严重。

结论：角膜碱烧伤病灶中PMNs和MMP-9的量值呈正相关,且角膜的病理损伤与PMNs的浸润和MMP-9的表达密切相关。