热应激时热休克蛋白70及其细胞保护作用

热应激时机体组织细胞可合成热休克蛋白以提供细胞保护。本文对热应激状态下热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）的细胞保护作用及其在各器官组织中的表现进行了综述,并探讨了ＨＳＰ７０在热应激时的细胞保护作用机制及其在高温医学中的应用前景。     

重组慢病毒载体介导不同启动子驱动的绿色荧光蛋白在多种(不同)细胞中的表达影响

目的比较不同启动子的慢病毒转导细胞后,在不同细胞系中驱动绿色荧光蛋白表达的效率高低。方法采用3种不同启动子的转移质粒,与包装质粒共转染293T细胞,转染60 h后,收集慢病毒上清。用等量的三种慢病毒液转导5种细胞系(293A、MOLT-4、PC3、DU145及RM1),72 h后,荧光显微镜下观察转导效果;流式细胞仪计数转导效率。结果不同启动子(Ubiquitin,EF1α,CMV)在5种细胞系中驱动绿色荧光蛋白的表达及转导效率不同。在293A和PC3细胞中,CMV为最强启动子,转导率分别为(94.83±2.87)%和(20.90±3.15)%;但在MOLT-4和DU145细胞中,EF1α为最强启动子,转导率分别为(74.27±2.14)%和(25.13±4.95)%;在RM1细胞中,Ubiquitin为最强启动子,转导率为(16.77±0.38)%。结论在慢病毒载体介导基因表达研究中,要考虑选取合理的细胞和启动子以获得高效的转导效率。     

热休克蛋白70与耐受的机制

热休克蛋的白（HSP）是机体在应激情况下迅速合成的一组蛋白质，热休克蛋白70（HSP70）是最重要的家族，具有普遍性、高度保守性及应激性，并通过分子伴侣作用、抗氧化作用、协同免疫作用和抗细胞凋亡作用对再次出现的应激有保护耐受作用，且具有交叉耐受性。本文在叙述热休克蛋白的概念之后，着重对热休克蛋白增强耐受性的机制及对热休克蛋白诱导现象的研究和应用展望进行了简要综述。     

热暴露不同时期大鼠肝与心肌细胞热休克蛋白70的表达

目的　研究热暴露不同阶段对大鼠肝与心肌细胞热休克蛋白 70 (HSP70 )表达的影响 ,为探讨HSP70在细胞水平的表达机制 ,以及HSP70对热暴露机体的意义提供实验依据。方法　采用人工热气候室 [(34± 1)℃、湿度 6 0 % ],建立热暴露动物模型。SD大鼠 80只分为对照组和热暴露组 ,每组又分为 2、7、14、2 8d 4个时段。取肝与心肌组织做免疫组化SP法染色 ,应用图像分析系统分析组织HSP70含量的变化。结果　在热暴露的 4个时段 ,热暴露组肝 (灰度值分别为 137.0± 5 .1、137.0± 5 .2、137.8± 7.1、139.2± 5 .2 )与心肌 (灰度值分别为 15 6 .1± 4 .4、15 5 .1± 6 .2、15 5 .4± 4 .5、15 6 .2±5 .1)细胞的HSP70表达均明显强于对照组 ,差异有显著性 (P <0 .0 1或P <0 .0 5 ) ;适应时段对HSP70的表达强度无明显影响。热暴露 2d时HSP70在核内表达强于胞浆 ,肝枯否氏细胞HSP70阳性表达率明显高于对照组 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;热暴露 2d与 2 8d时血清中肝与心肌细胞胞内酶浓度明显增高。结论　受热早期机体的重要器官会产生损伤性改变 ;HSP70高表达可作为组织细胞受损伤的标志 ;延长受热时间 ,机体产生热暴露 ,HSP70的高表达在此期热暴露的产生中起到重要作用 ;过长时间受热 ,机体将失去对热的适应 ,HSP7     

热休克蛋白70与脑损伤

热休克蛋白(HSPs)是一种非特异性细胞保护蛋白,其中热休克蛋白70(HSP70)是整个热休克蛋白(HSP)体系中的最保守的、最丰富的和最重要的。无论实验研究还是临床研究均已证实它的分子伴侣功能、细胞保护功能,可抗细胞凋亡、抗氧化等作用。并且实验研究证实热休克蛋白70对缺血性脑损伤具有保护作用,所以对其生物学方面的进一步研究将对缺血性脑损伤的临床治疗提供新思路。     

急进高原青年外周血淋巴细胞热休克蛋白70的变化与意义

热休克蛋白 (ＨＳＰｓ)是机体在遭受热、寒冷、缺血、缺氧、重金属、有毒化合物等刺激后产生的一系列特殊的应激性蛋白质 ,其生物学功能一方面作为分子伴侣保护细胞 ,提高细胞的应激能力[1] ;另一方面 ,ＨＳＰｓ水平的升高又可作为机体接触职业有害因素之后短期内的敏感指标[2 ] 。业已证明大鼠在低氧、低压等应激下淋巴细胞ＨＳＰ70明显增加[3] 。由平原急进海拔 3 6 5 8ｍ高原的人群同时经受缺氧、低压、寒冷等应激性刺激 ,其淋巴细胞ＨＳＰ70的变化情况值得研究。我们采用流式细胞术对急进高原者的外周血淋巴细胞ＨＳＰ70进行了检测 ,对…     

热休克蛋白70在乳腺癌中的表达

目的 探讨乳腺癌组织中热休克蛋白70(HSP70)表达水平及其临床意义.方法 用免疫印迹法检测47例乳腺癌组织和43例良性乳腺病变组织中HSP70的表达.结果 HSP70在乳腺癌组织中的表达水平(142 582)升高.与良性乳腺病变组织(40 449)相比,差异有统计学意义(P<0.01);乳腺癌HSP70的表达与临床分期、淋巴结是否转移及肿瘤直径有关(P<0.05),而与年龄、月经状况及组织学分型无关(P>0.05).结论 HSP70在乳腺癌组织中存在一定程度的异常表达.提示,在乳腺癌的发病机制中可能发挥一定作用.     

风湿热患儿血液热休克蛋白70的表达

目的　探讨热休克蛋白 70 (HSP70 )在儿童急性风湿热 (ARF)中的作用。　方法　采用Westernblot技术检测ARF活跃期、静止期及健康对照组血液单个核细胞HSP70表达情况 ,并与血沉 (ESR)、C反应蛋白 (CRP)进行相关分析。　结果　活跃期组HSP70呈高表达 ,静止期组表达降低 ,正常对照组呈低表达 ,活跃期组与静止期组及正常对照组比较 ,有显著差异 (P <0 .0 1) ;静止期组与正常对照组 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。活跃期组血液HSP70表达与ESR、CRP呈正相关。　结论　ARF患儿血液HSP70表达可作为判断风湿活跃的一项实验指标     

Wnt-3a/eGFP双表达基因慢病毒载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建双表达基因慢病毒载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A>Wnt-3a>IRES/eGFP,用携带目的基因Wnt-3a及示踪基因增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒转导大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs),建立能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型。方法基于GatewayTM技术构建双表达基因慢病毒载体,经293FT包装并释放出病毒转导rBMSCs,检测Wnt-3a以及β-catenin的表达水平。结果经测序证实目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP片段按正确方向重组入目的载体中。用含Wnt-3a/eGFP的病毒上清转导rBMSCs,转导率超过85%。RT-PCR证实rBMSCs-Wnt3a过表达wnt-3a和β-catenin。结论携带目的基因Wnt-3a及示踪基因eGFP的慢病毒可以稳定转染rBMSCs,构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型。     

累积吸烟年数与血浆热休克蛋白70抗体关系的分析

目的研究吸烟与HSP70抗体间的关系。方法用Western blot免疫印迹法检测吸烟和不吸烟组血浆HSP70抗体水平，采用logistic回归分析HSP70抗体与吸烟之间的关系。结果吸烟者血浆HSP70抗体阳性检出率为33．3％，不吸烟者的为29．2％，但差异无统计学意义（χ^2=1．309，P=0．257）。随着累积吸烟年数的增加，血浆HSP70抗体阳性检出率有升高的趋势（χ^2=5．602，P=0．018），logistic回归分析显示，在排除年龄、性别的影响后仍显示累积吸烟年数与血浆HSP70抗体有关，累计吸烟年数与血浆HSP70抗体阳性率之间存在统计学意义上的关联（OR=1．218，P=0．018）。结论累积吸烟年数是引起血浆HSP70抗体水平的影响因素之一。     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

谷氨酰胺对脑梗死病人热休克蛋白70表达及免疫功能的影响

目的:观察静脉补充谷氨酰胺(Gln)对急性脑梗死病人热休克蛋白70(Hsp70)的表达及免疫功能影响.方法:采用随机法将60例急性脑梗死病人分为对照组和Gln组,每组30例.Gln组入院24 h内开始给予静脉输注Gln,其他治疗同对照组.记录两组病人14 d观察期间血浆Hsp70浓度、免疫指标和感染发生率.结果:Gln组与对照组病人相比,血浆Hsp70浓度明显增高,免疫球蛋白浓度、CD4 细胞及CD4 /CD8 比值明显增加,肺部及泌尿系统感染发生率明显降低.结论:Gln可促进急性脑梗死病人Hsp70的表达,改善免疫功能,降低感染发生率.     

外周血淋巴细胞热休克蛋白60和70表达水平与工人噪声性听力损失的联系

目的探讨职业性噪声暴露工人外周血淋巴细胞热休克蛋白60（Hsp60）和70（Hsp70）表达水平与噪声性听力损失的关系。方法采用横断面流行病学研究,选取117名噪声暴露作业工人进行听力测试,分为听力损失组和听力正常组;运用Western Blot法检测2组外周血淋巴细胞Hsp60和Hsp70水平。结果与正常组相比,高频段和低频段噪声性听力损失组的淋巴细胞Hsp60和Hsp70表达水平差异均无统计学意义（P〉0.05）;校正年龄、性别、吸烟状况、爆震史和累积噪声暴露量等因素后,得到了同样结果;Hsp70的表达水平与累积噪声暴露量呈临界负相关（r=-0.179,P=0.058）;Hsp70与Hsp60水平之间呈显著正相关（r=0.224,P=0.017）。结论外周血淋巴细胞Hsp70和Hsp60的表达水平与高频段或低频段噪声性听力损失无相关;外周血淋巴细胞Hsp70的表达水平可能反映了机体的累积噪声负荷情况;未发现外周血淋巴细胞Hsp60的表达水平与机体的累积噪声负荷有相关性。     

诱导分化剂和热应激对K562细胞JWA和热应激蛋白70表达的影响

目的　研究诱导K5 6 2细胞分化和热应激过程中 ,JWA表达的特点 ,探讨JWA与热应激蛋白 (Hsp70 )表达的关系以及参与诱导分化和热应激可能的机制。方法　分别建立K5 6 2细胞诱导分化和热应激模型 ,采用Western blot方法检测JWA、Hsp70、热休克转录因子 (HSF1)、HSF2蛋白表达水平。结果　 (1)佛波酯 (TPA ,10 0ng ml)、氯化高铁血红素 (hemin ,3× 10 - 5mol L)、阿糖胞苷 (Ara C ,80ng ml)、阿霉素 (adriamycin ,4× 10 - 8mol L)、全反式维甲酸 (ATRA ,1× 10 - 6 mol L)、三氧化二砷 (As2 O3,1× 10 - 6 mol L)分别诱导K5 6 2细胞 4 8h ,JWA、Hsp70蛋白表达水平均明显增加 ;HSF2在hemin、Ara C、ad riamycin诱导下表达增加 ;(2 )在 4 2℃不同时间 (10、2 0、30、4 5、6 0、90min)和不同温度 (39℃、4 2℃、4 5℃ )处理下 ,Hsp70表达水平的变化与JWA蛋白表达水平的变化趋势基本相似 ,且HSF1在热应激早期表达。结论　在诱导分化、热应激过程中 ,JWA与Hsp70蛋白表达水平均明显上调 ,且变化趋势有一定的相似 ,但所涉及的细胞内信号转导通路可能不是惟一的。JWA表达与HSF1或HSF2似乎没有直接的特征性联系。     

刚地弓形虫HSP70真核表达质粒构建及评价

目的 构建刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T细胞内获得表达,为制备基因疫苗奠定基础。方法 扩增TgHSP70基因,双酶切后与真核表达质粒p3×Flag-CMW-14连接,经酶切、PCR及测序鉴定;脂质体法将重组体转染HEK 293T细胞中,TgHSP70的表达产物通过RT-PCR和western blot在基因和蛋白2个水平鉴定。结果 PCR扩增获得约495 bp的HSP70基因片段,p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重组质粒构建成功,经双酶切、PCR及测序鉴定,重组质粒基因序列完全正确;将p3×Flag-CMW-14-TgHSP70转染到HEK 293T细胞中,经RT-PCR检测获得预期大小目的基因条带,Western-blot检测表达产物大小约19 kDa。结论 成功构建了真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T正确表达。     

PAX2慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的 构建大鼠PAX2慢病毒表达载体,以期在大鼠肾脏中高效、稳定表达.方法 设计引物引入Age I酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-PAX2中扩增小鼠PAX2基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化.用In-Fusion技术将Age Ⅰ内切酶消化后目的片段交换连接入Age Ⅰ酶切的pGC-FU载体,构建PAX2慢病毒表达载体pGC-FU-PAX2.酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-FU-PAX2与慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,Western-blot验证PAX2在转染293T细胞中表达.结果 通过PCR扩增获得了PAX2基因,将PAX2克隆到慢病毒转移质粒pGC-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒.结论 成功构建了PAX2慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨PAX2功能奠定了基础.     

副溶血弧菌tlh基因克隆载体和表达载体的构建

目的：构建含副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP)tlh基因克隆载体和表达载体，检测并鉴定表达载体在转化菌的表达，为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究不耐热性溶血毒素（TLH）的功能奠定基础。方法：根据Genbank的tlh全基因序列，设计一对附加EcorV和HindⅢ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物，以VP基因组DNA为模板，用高保真Taq酶扩增出tlh基因。连接pGEM-T载体构建克隆载体，测序鉴定后，再用EcorV和HindⅢ酶切回收目的基因并克隆至表达载体pET32 ,采用PCR和双酶切鉴定筛选阳性质粒，转化DE3，IPTG诱导，用SDS－PAGE检测tlh的表达。结果：扩增的目的基因与GenBank的tlh比较具有99％的同源性，重组表达载体转化DE3，能表达融合蛋白。结论：本研究成功扩增出完整的tlh基因，构建了克隆载体和表达载体，获得融合表达的目的蛋白。     

大鼠热损伤时急性生理改变及热休克蛋白70的表达

目的观察热损伤(41.0～41.5℃)状态下大鼠的急性病理生理改变及脑、心、肺组织Hsp70mRNA及蛋白的表达特征。方法清洁级雄性Wistar大鼠测定肛温后持续暴露于41.0～41.5℃的热舱中至动物死亡。采用体温检测仪检测热损伤状态下大鼠的直肠温度动态变化规律;采用遥感测压监测系统检测大鼠热损伤时平均动脉压、心率的动态变化规律;采用RT-PCR及Westernblot技术检测大鼠脑、心、肺组织Hsp70mRNA及蛋白表达情况。结果大鼠持续暴露于高温环境中时,直肠温度持续上升,血压和心率上升到峰值后开始下降,热暴露(35±2)min时发生中暑;大鼠中暑后血压迅速下降、心律失常,直至动物死亡,此时肛温上升到最高峰(约45.0℃)。正常大鼠脑组织和心脏低表达Hsp70,而肺组织Hsp70表达稍高,中暑时大鼠脑、心、肺组织Hsp70表达明显增加,其中Hsp70mRNA表达量分别约为正常组的5.19、6.88和1.80倍(P<0.01);Hsp70蛋白表达量分别为正常组的2.54、1.95和2.33倍(P<0.01)。结论大鼠暴露于高温环境(41.0～41.5℃)时,肛温持续上升,血压和心率发生特征性改变,热损伤35min时发生中暑,中暑时大鼠脑、心、肺组织Hsp70mRNA及蛋白表达明显增加。     

蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

miR-29c真核表达载体构建及鉴定

目的 构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c真核表达载体,为进一步研究miR-29c的功能和靶基因鉴定奠定基础。方法 根据miR-29c成熟体序列设计合成1对miRNA寡聚单链DNA,经退火后克隆到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中,瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经实时荧光定量PCR检测pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c在肺癌细胞中表达miR-29c。结果 A549转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c 24 h后,miR-29c表达量上升,明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功构建真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c,并能有效表达miR-29c。