磷酸化C-JUN不参与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡

观察磷酸化C-JUN与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关系.在培养的小脑颗粒神经元建立谷氨酸凋亡模型;采用MTT法分析细胞存活率,相差显微镜观察形态学,DNA凝胶电泳法分析细胞凋亡和原位细胞荧光免疫组织化学法检测磷酸化C-JUN.结果显示,谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元细胞体积缩小,突触断裂、消失,DNA电泳呈典型的"梯状"条带;谷氨酸处理24 h后细胞存活率为28.6 %±5.2 %.神经元在谷氨酸处理5,30 min及1,2,4,8,16和24 h后均未检测到有磷酸化C-JUN阳性细胞,与去极化组(25 mmol/L KCl)相同.而复极化组(5 mmol/L KCl)则在30 min检测到大量的磷酸化C-JUN阳性细胞,4 h荧光最强并持续.处理4 h后,400 倍荧光显微镜下,复极化组、去极化组和谷氨酸组的磷酸化C-JUN阳性细胞数分别为124 ±17,8±3,5±3.上述结果提示,谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡,磷酸化C-JUN不参与谷氨酸诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡.     

磷酸化C—JUN不参与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡

观察磷酸化 C- JUN与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关系。在培养的小脑颗粒神经元建立谷氨酸凋亡模型 ;采用 MTT法分析细胞存活率 ,相差显微镜观察形态学 ,DNA凝胶电泳法分析细胞凋亡和原位细胞荧光免疫组织化学法检测磷酸化 C- JUN。结果显示 ,谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元细胞体积缩小 ,突触断裂、消失 ,DNA电泳呈典型的“梯状”条带 ;谷氨酸处理 2 4 h后细胞存活率为 2 8.6%± 5.2 %。神经元在谷氨酸处理 5,30 min及 1 ,2 ,4,8,1 6和 2 4 h后均未检测到有磷酸化 C- JUN阳性细胞 ,与去极化组 ( 2 5mmol/L KCl)相同。而复极化组 ( 5mmol/L KCl)则在 30 min检测到大量的磷酸化 C- JUN阳性细胞 ,4h荧光最强并持续。处理 4h后 ,40 0倍荧光显微镜下 ,复极化组、去极化组和谷氨酸组的磷酸化 C- JUN阳性细胞数分别为 1 2 4± 1 7,8± 3,5± 3。上述结果提示 ,谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡 ,磷酸化 C- JUN不参与谷氨酸诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡。     

亚低温下CIRP抑制H2O2诱导的大鼠皮层神经元凋亡

目的 探讨亚低温的脑保护作用是否是通过冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)抑制神经元凋亡而发挥的.方法 分离培养原代大鼠皮质神经元,用CIRP-RNAi慢病毒转染神经元,100 μmol/L H2O2诱导神经元凋亡,按组分别放入37℃或32℃环境中培养,采用MTT比色法检测细胞存活率;应用Hoechst 33342染色、Annexin V-FITC标记法和流式细胞仪检测各组神经元的凋亡率;Western blot检测神经元细胞CIRP、Actived Caspase-3及TRX蛋白表达的变化.结果 在32℃环境中,皮质神经元内CIRP蛋白表达明显增加,Actived Caspase-3表达下调,TRX表达增加,神经元凋亡率为(4.5±0.8)％;与37℃环境下相比较,皮质神经元内CIRP蛋白表达明显减少,Actived Caspase-3表达显著增高,TRX表达下调,神经元凋亡率为(53.5±1.7)％,P＜0.05.结论 在亚低温环境中,CIRP蛋白在大鼠皮质神经元中表达增高,抑制H2O2诱导的神经元凋亡发生,发挥神经元保护作用,是亚低温的脑保护作用的途径之一.     

Exendin-4对大鼠皮质神经元缺血再灌注损伤后内质网相关性细胞凋亡的影响

目的探讨Exendin-4(Ex-4)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法体外培养Spra-gue Dawley(SD)乳鼠皮质神经元并随机分为对照组(正常培养)、模型组(体外模拟缺血再灌注)、治疗组(建模前2h、建模中均给予Ex-4)。免疫荧光染色鉴定神经元纯度,RT-PCR检测GLP-1受体基因表达,ELISA检测神经元细胞浆内cAMP水平,MTT法测定神经元存活率,流式细胞术检测神经元凋亡率,Western-blot免疫印迹法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)表达。结果大鼠皮质神经元可体外纯化培养。RT-PCR及ELISA检测结果显示皮质神经元存在活性GLP-1受体。体外模拟缺血再灌注后神经元凋亡率明显增加,早期凋亡率及总凋亡率分别为(22.43±1.67)%、(41.87±3.2)%,Ex-4(0.4μg/ml)干预后神经元凋亡率明显下降,早期凋亡率及总凋亡率分别降至(7.53±0.6)%、(13.67±1.77)%,两组比较差异均有统计学意义(t早期凋亡率=14.511、t总凋亡率=13.352,P0.01)。体外模拟缺血再灌注损伤可诱导神经元GRP78、CHOP表达上调,Ex-4干预后神经元GRP78表达进一步增加、CHOP表达反而减少,两组GRP78、CHOP含量比较差异均有统计学意义(tGRP78(%control)=7.103、tCHOP(%control)=7.816,P0.01)。结论 Ex-4对大鼠皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤具有保护作用,其可能机制为抑制损伤后内质网相关性细胞凋亡。     

缺氧对乳鼠脊髓神经元低氧诱导因子-1α的影响

目的研究缺氧对脊髓神经元低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达和凋亡的变化,探讨HIF-1α在耐受缺氧和诱导凋亡机制中的作用。方法以体外培养的乳鼠脊髓神经元细胞为研究对象。采用激光共聚焦显微镜(LCSM)、DNA琼脂糖凝胶电泳观察缺氧诱导脊髓神经元凋亡的变化;免疫组化检测HIF-1α在缺氧脊髓神经元中的表达;流式细胞术(FCM)检测缺氧对脊髓神经元p53、Bcl-2蛋白水平表达的影响。结果持续缺氧显著抑制脊髓神经元细胞的生长;荧光显微镜下可见脊髓神经元细胞呈典型凋亡的形态学改变。脊髓神经元缺氧2、4 h时HIF-1α、P53、Bcl-2表达上调(P<0.01),8 h时其表达下调(P<0.05)。结论缺氧预处理诱导的HIF-1α的表达,在脊髓神经元的耐受缺氧和诱导凋亡机制中起着重要的作用。     

N-乙酰半胱氨酸防止帕金森病鼠黑质神经元凋亡

目的:研究N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的帕金森病小鼠黑质神经元凋亡的保护机制.方法:采用MPTP制备帕金森病(Parkinson disease,PD)小鼠模型,应用生化技术检测黑质区域谷胱甘肽(GSH)浓度及超氧化物歧化酶(SOD)活力,用尼氏(Nissl)染色、TH组化染色、活化型Caspase 3组化染色及TUNEL染色观察黑质神经元的损害情况,并计算神经元的凋亡率,同时应用蛋白免疫印迹法检测黑质神经元磷酸化JNK及磷酸化c-Jun蛋白表达水平.另经NAC预处理该模型后,对上述指标进行检测.结果:NAC预处理能提高黑质区域GSH的浓度及降低SOD活力,减轻PD鼠黑质致密带Nissl阳性神经元和TH阳性神经元的脱失现象,减少磷酸化JNK及磷酸化c-Jun蛋白表达水平,使活化型Caspase 3表达减少并降低黑质神经元的凋亡率.结论:NAC能减少MPTP诱导的小鼠黑质神经元凋亡,其机制与抗氧化及阻断JNK细胞凋亡通路的激活有关.     

蛋白激酶D1对Aβ诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的调节作用

目的探究蛋白激酶D1(PKD1)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的阿尔茨海默病(AD细胞模型的调节作用和分子机制。方法分别以0、10、20、30、40、50μmol·L~(-1)的Aβ25-35处理SHSY5Y细胞24 h,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT检测细胞活力,蛋白印迹法(Western blotting)检测PKD1蛋白水平变化。在AD细胞模型中分别过表达和干扰PKD1,流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧(ROS),Western blotting检测凋亡相关蛋白(B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病-xl(Bcl-x L))、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(P-JNK)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK 1/2)、磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号传导及转录激活蛋白3(p-STAT3)及其下游靶基因c-Myc的蛋白水平变化。过表达PKD1同时添加10μmol·L~(-1) FLLL32(JAK2/STAT3通路抑制剂)处理AD细胞模型,流式细胞术检测细胞凋亡和ROS,Western blotting检测Bcl-2、Bcl-x L、P-JNK和P-ERK 1/2蛋白水平变化。结果 30μmol·L~(-1) Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞,细胞存活率和凋亡率分别约为70%和20%(P0.05),为构建AD模型的最适浓度。过表达PKD1抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡增加、ROS升高、Bcl-2和Bcl-x L蛋白表达下调、P-JNK和P-ERK1/2蛋白表达上调;干扰PKD1,加剧Aβ25-35对细胞的毒性作用。过表达PKD1,P-JAK2、P-STAT3和C-Myc蛋白表达上调;干扰PKD1,p-JAK2、p-STAT3和c-Myc蛋白表达下调。FLLL32处理抑制PKD1对AD细胞模型的作用。结论 Aβ诱导SH-SY5Y神经细胞中P-JAK2、P-STAT3表达下调和P-JNK和P-ERK 1/2表达上调。过表达PKD1可通过上调p-JAK2、p-STAT3的表达抑制P-JNK和P-ERK 1/2表达,缓解Aβ对细胞的毒性作用。     

线粒体通透性转换孔在缺血预处理脑保护中的作用及机制

目的观察线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)在缺血再灌注及缺血预处理脑保护中的作用。方法将体外培养8 d的海马神经元分为五组,正常对照组(A组),缺血再灌注组(B组),缺血预处理+缺血再灌注组(C组),苍术苷+缺血再灌注组(D组),缺血预处理+苍术苷+缺血再灌注组(E组)。使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,罗丹明123染色流式细胞术检测线粒体膜电位,Western-blot检测Bcl-2,Bax的表达水平。结果与A组比较,其余四组线粒体膜电位均降低,神经元凋亡率升高(P<0.05);与B组比较,C组线粒体膜电位升高,神经元凋亡率升高,Bcl-2表达上调,Bax表达下调(P<0.05);与C组比较,E组粒体膜电位降低,神经元凋亡率升高,Bcl-2表达下调,Bax表达上调(P<0.05)。结论缺血预处理能有效减轻海马神经元缺血再灌注损伤,抑制缺血再灌注后神经细胞凋亡,其机制可能与抑制MPTP的开放有关。     

溶血磷脂酸诱导小脑颗粒细胞氧化性损伤与凋亡

目的研究溶血磷脂酸(LPA)对原代培养大鼠小脑颗粒细胞的细胞毒性作用及其损伤机制.方法将原代培养的大鼠小脑颗粒细胞暴露于不同剂量LPA中,测定噻唑蓝(MTT);应用流式细胞仪、透射电镜、激光共聚焦显微镜等技术观察细胞的凋亡率、凋亡细胞的核形态及细胞质和线粒体内活性氧(ROS)的形成.结果LPA对小脑颗粒细胞的损伤呈剂量依赖效应.经50μmol/LLPA作用后细胞生存率为正常细胞的(54.8±11.5)%,细胞凋亡率达(40.5±2.3)%,细胞染色质发生浓缩和形成凋亡小体,细胞质和线粒体内ROS形成增加,而经四甲基吡嗪(TMP)预处理后细胞生存率升至(84.7±8.8)%,细胞凋亡率减至(16.7±5.8)%,细胞核形态无明显改变,细胞质和线粒体内ROS形成被抑制.结论LPA具有神经毒性作用.通过增加线粒体内ROS形成,继而诱导神经元凋亡可能是其损伤机制之一.能减少内源性ROS形成的抗氧化剂可对抗LPA诱导的神经元凋亡.     

心肌营养素-1对超氧化损伤神经元的保护作用

目的在体外培养神经元凋亡损伤模型,观察重组腺病毒-心肌营养素1(Adv-CT1)对损伤神经元存活的保护作用,了解CT-1对神经元的作用和机制,为神经损伤提供新的治疗措施。方法诱导大鼠神经干细胞(NSCs)分化为神经元,建立超氧化诱导神经元凋亡损伤模型,以Adv-CT1转染神经元,应用免疫组化、流式细胞仪凋亡检测等技术,观察CT-1对神经元生长存活的作用以及CT-1和caspase-3基因在损伤神经元表达的变化。结果分离培养NSCs,应用无血清小剂量碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)神经元培养基诱导NSCs定向分化培养神经元;在神经元凋亡模型中转染Adv-CT1,免疫组化显示神经元中CT-1表达增高(P<0.05,或P<0.01),caspase-3表达降低(P<0.05);流式细胞检测显示CT-1可减少损伤神经元凋亡比例(P<0.01,或P<0.05),促进细胞存活。结论Adv-CT1转染到凋亡神经元后,CT-1表达增加,caspase-3表达降低,提示Adv-CT1对损伤神经元有保护作用,是CT-1通过减少神经元凋亡基因caspase-3表达,抑制凋亡发生,从而促进神经元存活。