基于细胞模型的高通量药物筛选

随着高通量药物筛选发展的需要,细胞模型在药物筛选中发挥了越来越大的作用.本文综述了细胞模型在药物高通量筛选中的应用.主要介绍了该模型基础上的筛选流程、模型分类及其在实际药物筛选中的应用,并对其相关的检测技术进行了阐述,以及对其发展前景进行了分析.     

高通量药物筛选模型

介绍了可用于药物筛选的3种新的快速高通量筛选方法，包括基于反酵母双杂交的筛选系统；细胞平台伤的高通量筛选系统以及动物水平的筛选系统。并对其应用原理，应用情况和优缺点进行了阐述。     

维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的以维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型，用于筛选治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)、银屑病、痤疮以及肿瘤的新型药物。方法用分子生物学的方法，构建含有8个串连维甲酸受体应答元件(RARE)并连接报告基因E-GFP的重组载体。将体外培养的细胞株用该重组载体进行稳定转染，然后进行单克隆培养，最终挑选出敏感、高效、稳定表达的单克隆细胞，用于筛选针对维甲酸受体的小分子有机药物。结果建立了高效的药物筛选细胞模型。此模型筛选方法简便，适用范围广，灵敏度高，结果稳定。结论挑选出的细胞株作为药物筛选模型可用于大规模高通量药物筛选。     

基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的建立基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型,筛选调节免疫系统、造血系统和抗肿瘤药物。方法构建以串连的多个STAT的DNA结合序列为调控序列,以荧光酶基因作为报告基因的表达载体。通过将该载体分别转入体外培养的不同细胞系中使之稳定表达,建立具有激活STAT活性的药物筛选模型,并利用多个抗过敏和抗肿瘤药物样品进行检测。结果建立多株药物筛选细胞模型,筛选方法简便,操作容易,灵敏度高,结果稳定。结论本细胞株可以用于大规模高通量药物筛选。     

基于COL1A1启动子的抗肝纤维化药物高通量筛选模型的建立及应用

为了有效筛选潜在的抗肝纤维化药物,本实验室建立了基于COL1A1启动子的高通量筛选细胞模型。该细胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COL1A1启动子及荧光素酶报告基因的表达,而该激活作用可以被候选化合物抑制。作者首先构建COL1A1启动子和荧光素酶报告载体p GL4.17的重组质粒。采用双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子的活性进行检测,发现重组质粒比对照组荧光素酶活性高15.98倍。该质粒转染到人肝星状细胞株LX2中,用无限稀释法得到单克隆细胞株,并利用活体成像仪筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL。经TGF-β1诱导后检测该单克隆细胞株LX2-COL对候选化合物(S1~S7)的反应性,其中S7对启动子活性抑制作用最强。Real-time RT-PCR和Western blotting验证了经该细胞模型筛选得到的化合物S7能够抑制Ⅰ型胶原m RNA和蛋白水平的表达。结果表明,该细胞模型的建立能够实现对潜在的抗肝纤维化化合物的高通量筛选。     

利用组合筛选模型筛选海洋微生物抗肿瘤活性物质

建立了镰刀菌筛选模型并进行了验证，将镰刀菌筛选模型与肿瘤细胞毒筛模型组合。应用于海洋微生物抗肿瘤活性物质的筛选，从1585株海洋微生物中筛选到12株微生物，其发醇产物对体外培养的肿瘤细胞有较好的抑制作用。其中活性最强的细菌菌株为QK1-2708，其发酵产物对CNE，SMMC-7721和P388细胞的ID50分别是3520，3078，5061。     

化合物药物活性的高通量筛选

介绍高通量药物筛选系统的组成及其相关技术。结合国家药物筛选中心的工作,详细介绍了化合物药物活性的高通量筛选的４ 个组成部分及其在药物发现过程中的作用。高通量药物筛选系统是一个涉及多个学科的、以分子生物学、新型检测技术技术为基础的新型药物发现系统。高通量药物筛选系统的顺利开展可以加速我国的新药研究     

基于诱导多能干细胞的高内涵筛选平台在药物研发中的应用

制药企业药物研发的效率近年来呈逐年下降的趋势,迫切需要更加经济有效的研发平台提高药物研发的成功率。近些年发展起来的诱导多能干(induced pluripotent stem,i PS)细胞技术已日趋成熟,其与传统药物研发模型相比具有众多优势;高内涵筛选(high content screening,HCS)可以在一次实验中获得大量数据信息,是一项重要的药物筛选和研究工具。本文介绍了结合i PS细胞与HCS技术,应用于药物研发的不同阶段和领域,为新药的研发提供更多的潜能。     

利用诱导多能干细胞构建流产毒性药物的体外筛查模型

妊娠期用药不可避免,如何帮助孕妇合理用药以减少自发流产、早产和低体重儿的发生,对于医务工作者至关重要.本研究建立了药物流产毒性的检测模型,可筛除疑似流产的药物,避免用药不当导致的孕妇流产.通过三维悬浮培养诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的方式,诱导其形成拟胚体(...     

CD133和Oct4在喉癌中的表达及临床意义

目的:探讨CD133和Oct4在喉癌中的表达及与喉癌临床病理学特征之间的关系.方法:利用免疫组织化学方法检测56例喉癌组织及10例癌旁正常组织中CD133和Oct4的表达,比较二者的表达与临床病理参数之间的相关性.结果:CD133和0ct4在喉癌组织内表达阳性率分别为69.6%、25.0%,均明显高于正常组织;CD133与Oct4在中、低分化喉癌组织内表达均高于高分化者(P<0.05);CD133的表达与喉癌的TNM分期和淋巴结转移具有相关性(P<0.05),而与患者的年龄、性别和肿瘤生长部位无相关性.Oct4的表达与以上因素均无相关性;二者在喉癌组织中的表达呈正相关.结论:CD133和Oct4可共同作为喉癌的肿瘤干细胞标志物,作为喉癌恶性程度的判断指标;CD133的表达在喉癌发生、发展及转移中发挥重要作用,为喉癌的诊断和治疗提供依据:Oct4与喉癌的关系有待进一步研究证明.     

基于STAT3转录调节的筛药模型的建立

目的　依据造血生长因子信号转导途径中重要转录因子STAT3的转录调节作用建立基于报告基因的靶向STAT3转录调节的筛药模型 ,用此模型筛选具有G CSF样活性的化合物。方法　构建诱导性表达载体 pTKS3 CAT并转染入表达G CSF受体的NFS 6 0不依赖细胞 ,筛选报告基因CAT表达受rhG CSF诱导的阳性克隆 ,采用ELISA法检测化合物对CAT表达活性的影响。同时 ,对模型的特异性和灵敏性进行检测。结果　在转染有重组质粒的NFS 6 0不依赖细胞中 ,CAT表达受rhG CSF诱导并呈剂量依赖关系 ,EC50 等于 0 0 44nmol·L-1,而rhEPO不能诱导CAT表达。结论　以上模型的CAT基因表达活性能够被其特异性配体强诱导表达 ,利用此模型在 96孔板上用ELISA法测定CAT基因的诱导表达水平可筛选具有G CSF样活性的化合物。     

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法　五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果　293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论　马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。     

CYP3A4高表达细胞模型及其应用于药物代谢研究进展

细胞色素P450酶3A4(cytochrome P450 3A4,CYP3A4)属于细胞色素P450酶家族,参与多种化合物代谢及相互作用,是药物(尤其是口服药物)筛选和代谢研究的重要对象。该文按年代顺序对国外文献中CYP3A4高表达细胞模型的建立及在药物代谢中的应用进行综述,旨在将这一有价值的模型引入到新药研究中。     

Sense and sensibility: the use of cell death biomarker assays in high-throughput anticancer drug screening and monitoring treatment responses

Cell-based screening allows identification of biologically active compounds, for example, potential anticancer drugs. In this review, various screening assays are discussed in terms of what they measure and how this affects interpretation and relevance. High-throughput (HT) assays of viability based on the reduction of exogenous substrates do not always reflect viability or cell number levels. Membrane integrity assays can be used for HT quantification of cell death, but are non-specific as to the death mode. Several HT assays monitor end point apoptosis. Screening libraries at a single concentration (micromolar) can prevent detection of potent apoptosis inducers, as high concentrations may induce mainly necrosis. Using monolayer cultures limits the significance of cell-based screening as the properties of monolayer cells differ from tumours in vivo. Spheroid cultures are more physiological, but are impractical for screening by conventional methods. The authors have developed an assay quantifying accumulation of a caspase-cleaved protein specific for epithelial cells. It provides an integrated measure of apoptosis in two- and three-dimensional cultures and can be used as a blood biomarker assay for tumour apoptosis in vivo.     

以GLP-1受体为靶点的药物筛选细胞模型的建立和应用

建立以GLP-1信号通路为靶点的药物筛选细胞模型,用于筛选GLP-1受体激动剂类的新型抗糖尿病药物。首先构建GLP-1受体信号通路调控的特异应答元件（RIP-CRE）多拷贝序列及报告基因E-GFP的重组载体。将该载体转染胰岛NIT-1细胞株,以检测转染细胞对GLP类似物的反应性和特异性,并通过稳定转染和单克隆培养,获得对GLP-1类似物特异应答的单克隆细胞株。该细胞模型在GLP-1类似物Exendin 4刺激下激活表达报告基因,激活作用可以被GLP-1受体阻断剂Exendin 9-39完全阻断,且激活途径非cAMP-PKA依赖,具有GLP-1受体特异性。构建该细胞模型,可以对肽类或非肽类GLP-1类似物进行高通量筛选。