免疫脂质体微泡造影剂的制备及体外靶向研究

目的制备抗人肝细胞癌免疫脂质体微泡造影剂,并探讨其体外靶向作用.方法采用静电吸附法将抗人肝细胞癌单克隆抗体HAb18结合到本试验室研制的脂膜氟烷微泡造影剂表面,制备免疫脂质体微泡造影剂;采用玻片凝集实验、荧光免疫染色实验证明抗体与脂质体微泡的结合;通过花环形成及花环形成阻断实验研究免疫脂质体微泡的靶向作用.结果静电吸附法可使单抗HAb18牢固地结合到脂质体微泡上;免疫脂质体微泡围绕靶细胞形成花环,花环形成率达90%以上.结论采用静电吸附法制备的免疫脂质体微泡造影剂在体外能与人肝癌细胞高效特异结合.     

抗VEGF抗体介导靶向超声造影剂的体外实验研究

目的以抗血管内皮因子（VEGF）抗体为配体研制能与血管内皮细胞特异性结合的靶向脂质体超声造影剂并检测其体外寻靶能力。 方法以静电吸附法将抗VEGF抗体连接到脂质体造影剂微泡的表面；体外培养ECV304人血管内皮细胞，用免疫荧光法检测靶向造影剂与其体外结合能力，以普通造影剂为对照组。 结果所制备的靶向超声造影剂与普通微泡无显著差异；免疫荧光实验结果显示靶向造影剂能在体外与血管内皮细胞特异性结合。 结论携抗VEGF抗体的脂质体靶向造影剂能通过静电吸附法成功制备，且在体外能与血管内皮细胞特异性结合。     

亲血栓性靶向超声造影剂的鉴定及体外寻靶实验研究

目的 制备亲血栓性靶向超声造影剂，探讨其体外寻靶的特点和规律。方法 在自制的白蛋白氟碳超声造影剂的基础上，采用交连法将带有荧光标记的6-肽(FITC-KV-6)与自制的白蛋白氟碳微泡结合，制备血栓靶向微泡造影剂。体外实验分3组，A组：将带有FITC-KV-6的造影剂滴加于健康人新鲜血凝块上，普通光镜和荧光显微镜下观察微泡与血块的黏附情况；B组对照：普通白蛋白氟碳造影剂；C组对照：6-肽阻断实验。结果 靶向微泡荧光免疫染色实验为阳性，对照组为阴性。体外实验显示，A组：微泡在血凝块外围形成一条凝聚带，并顺着网格状的纤维素带延伸到血块内部，而2个对照组均未见微泡与血凝块的结合。结论 采用交连法可制备亲血栓性靶向白蛋白超声造影剂；该造影剂微泡在体外能与人新鲜血凝块高效特异结合。     

生物素-亲和素介导以KDR为靶点的脂质体超声造影剂体外靶向实验研究

目的 以与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237为配体研制靶向脂质体超声造影剂并进行体外性能鉴定.方法 采用"生物素一亲和素"桥接法构建靶向微泡(P-Bio-Av-Bio-Mbs),将KDR不同程度表达的细胞LOVO、HUVECs和LS174T分别与P-Bio-Av-Bio-Mbs孵育,同时另将荧光标记生物素-亲和素桥接靶向脂质体微泡(FITC- P-Bio-Av-Bio-Mbs)、荧光标记的单纯小肽微泡复合物(FITC-P-Mbs)及荧光标记的普通脂质体微泡(FITC-Mbs)分别与LOVO细胞孵育,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合的花环形成率及荧光强度;分别以10 ?g、50 ?g的小肽K237预先与LOVO细胞孵育,再将P-Bio-Av-Bio-Mbs与LOVO细胞孵育,观察细胞周围微泡分布.结果 KDR强阳性表达的LOVO细胞周围花环形成率高达90.52%,荧光强度3级,KDR阳性表达的HUVECs周围花环形成率53.46%,荧光强度2级,KDR阴性表达的LS174T细胞周围少数微泡黏附,花环形成率5.57%.荧光强度0～1级,组间花环形成率比较差异有统计学意义(P<0.05).FITC-P-Bio-Av-Bio-Mbs、FITC-P-Mbs及FITC-Mbs与LOVO细胞结合,花环形成率分别为89.62%、7.56%、0%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),荧光强度分别为3级、0～1级、0级.10?g预处理组靶细胞周围花环结构明显减少,50 ?g封闭组靶细胞周围无花环形成.结论 以KDR为靶点携小肽K237的靶向脂质体造影剂通过生物素-亲和素桥介导成功制备,在体外能与靶细胞高效特异结合.针对KDR为靶点进行肿瘤新生血管分子靶向显像可能为肿瘤早期诊断提供新的思路.     

PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡制备和体外寻靶能力实验研究

目的探究前列腺特异性膜抗原(PSMA)单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡的制备方法,对其体外寻靶能力予以观察。方法采用静电吸附法对PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡进行制备,观察其特性,对抗体与纳米级微泡结合情况予以免疫荧光法检测,采用细胞免疫荧光法对PSMA表达以及在细胞膜上的定位予以鉴定,观察靶向微泡对前列腺癌细胞的寻靶能力,并将胃癌细胞作为对照。结果 PSMA单抗靶向纳米级微泡呈现出均匀分布状态,平均粒径为(626.25±66.02)nm;经过免疫荧光法试验,显示微泡表面存在绿色荧光;对前列腺癌细胞膜给予细胞免疫荧光检测其PSMA呈现出高表达;体外寻靶实验显示靶向微泡能够实现与人前列腺癌LNCAP、C4-2细胞的结合,但其与胃癌MKN45细胞无法结合。结论 PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡体外寻靶能力强,能够实现与前列腺癌细胞的有机结合。     

携载PSMA单抗靶向前列腺癌的纳米级脂质微泡的制备及体外寻靶能力

目的制备携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡,并观察其体外寻靶能力。方法利用静电吸附法制备携载PSMA单抗靶向前列腺癌的脂质纳米级微泡,检测其一般特性;免疫荧光法检测抗体与纳米级微泡的结合情况;用细胞免疫荧光分析鉴定PSMA的表达及其在细胞膜上的定位;普通光镜下观察靶向微泡对前列腺癌细胞的寻靶能力,同时以胃癌细胞作对照。结果携载PSMA单抗的靶向纳米级微泡分布均匀,平均粒径为(623.70±66.05)nm,免疫荧光法显示微泡表面可见绿色荧光,细胞免疫荧光检测前列腺癌细胞膜高表达PSMA,体外寻靶实验显示该靶向微泡可与人前列腺癌LNCAP及C4-2细胞牢固结合,而与胃癌MKN45细胞不结合。结论本实验成功制备的携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡具有较强的体外寻靶能力,能特异性地与前列腺癌细胞结合。     

亲血栓性靶向超声造影剂的制备及体外实验初步研究

目的 制备亲血栓性靶向超声造影剂，探讨其体外寻靶的特点和规律。方法 在自制的白蛋白超声造影剂的基础上，采用交连法制备血栓靶向微泡造影剂。体外实验分3组：A组，将靶向造影剂滴加于健康人新鲜血凝块上，光镜下观察微泡与血凝块的粘附情况；B组对照，普通白蛋白造影剂；C组对照，6—肽阻断实验。结果 A组微泡在血凝块外围形成一条凝聚带，并顺着网格状的纤维素带延伸到血块内部，而两对照组均未见微泡与血凝块的结合。结论 采用交连法可制备亲血栓性靶向白蛋白超声造影剂；该造影剂微泡在体外能与人新鲜血凝块高效特异结合。     

L-S靶向超声造影微泡的制备及声学性质的实验研究

目的探讨将淋巴细胞选择素(Lymph-Selectin,L-S)链接到脂质超声造影微泡膜表面的可行性,并体外验证其声学性质,为淋巴结特异靶向超声造影制备靶向微泡。方法采用静电吸附法将L-S链接到普通脂质超声微泡膜表面制备成L-S靶向超声造影微泡,荧光免疫染色实验验证L-S与脂质微泡膜的结合;流式细胞仪检测不同浓度L-S与微泡的结合率;超声体外验证L-S靶向微泡声学性质。结果 L-S靶向微泡的免疫荧光染色实验为阳性;L-S抗体浓度为5、15、35 μg/ml时L-S与脂质微泡的平均结合率分别为(9.88±1.49)%、(29.59±2.23)%、(86.66±4.71)%,两两比较均有统计学意义(P0.01);体外声学造影实验中,普通微泡组(UCM)和L S靶向微泡组(TUCM)平均灰度值分别为:(75.77±7.08)dB和(73.72±8.19)dB(P0.05)。结论采用静电吸附法可将L-S链接到脂质超声微泡膜表面制备成L-S靶向超声微泡,其结合率与加入的L-S抗体浓度有关。L-S的链接不会破坏靶向微泡的声学特性。     

人卵巢癌靶向超声造影剂的制备及其体外寻靶能力观察

目的 制备人卵巢癌细胞靶向超声造影剂(TUCA),对其进行鉴定,观察其体外寻靶能力.方法 采用共价结合法制备TUCA即黄体生成素释放激素-脂质体微泡(LHRH-LM):免疫荧光染色试验证明配体LHRH与LM的结合,倒置显微镜下观察TUCA与人卵巢癌细胞株OVCAR-3的结合情况,观察LHRH-LM对OVCAR-3细胞的体外寻靶能力;同时以LM为对照,并用LHRH做阻断试验.结果 LHRH-LM的荧光免疫染色试验阳性;体外寻靶试验显示携带配体LHRH的LM能较好的黏附在OVCAR-3细胞上,经反复洗涤不掉,而作为对照的LM与OVCAR-3细胞株混合反应后经反复洗涤,微泡与细胞完全分离,无结合;LHRH成功阻断TUCA与癌细胞的结合.结论 采用共价结合法成功制备了靶向超声造影剂,该造影剂在体外能高效地与人卵巢癌细胞株OVCAR-3结合.     

携IL-8单抗的靶向超声造影剂对损伤心肌细胞的体外寻靶实验研究

目的 通过体外寻靶实验评价携IL-8单克隆抗体(简称单抗)靶向超声造影剂的靶向粘附效能,探讨IL-8在心肌梗死早期的作用机制。方法 采用共价偶联法制备携IL-8单抗靶向超声造影剂,利用使细胞缺氧、缺糖的方法制备损伤心肌细胞,通过靶向超声造影剂与损伤心肌细胞的体外结合实验检测其寻靶能力。结果 携IL-8单抗靶向微泡与损伤及损伤初期心肌细胞的粘附作用明显高于SonoVue微泡(P<0.05),且随着损伤程度的加重,携IL-8单抗靶向微泡与心肌细胞的黏附作用逐渐加强(P<0.05)。结论 携IL-8单抗靶向超声造影剂对损伤心肌细胞具有较强的靶向性。     

黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响研究

目的研究黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响,为临床肝癌的治疗提供科学的参照。方法选取人的SMMC-7721型肝癌细胞,分别在加入500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.25μM、0μM黄连素的培养液中进行体外培养。于0 h、24 h、48 h、72 h时使用MTT方法对细胞活性进行测定,基于统计学处理方法,分析黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响作用。结果黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞的生长具有显著的抑制作用,且随着作用时间和作用浓度的增加抑制作用呈上升趋势,但黄连素不会影响SMMC-7721人肝癌细胞的复制增殖周期。结论黄连素对能够显著抑制SMMC-7721人肝癌细胞的生长,并诱导细胞的凋亡,作用程度与作用时间和浓度呈正相关,但对细胞的增殖周期没有影响。     

超声辐照载羟基喜树碱微泡对肝癌SMMC-7721 细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的 研究超声辐照载羟基喜树碱微泡对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响,并探讨其诱导细胞凋亡的分子机制.方法 SMMC-7721细胞随机分为6组,即对照组、空白脂质微泡+超声组、载羟基喜树碱微泡组、羟基喜树碱组、羟基喜树碱+超声组及载羟基喜树碱微泡+超声组.采用Annexin V-FITC/PI双染法和TUNEL法检测细胞凋亡状况;免疫细胞化学法检测Bel-2、Bax蛋白表达.结果 载羟基喜树碱微泡+超声组用Annexin V-FITC/PI检测细胞早期凋亡率为(12.18±1.38)%;TUNEL法显示染成棕黄色的凋亡细胞,细胞中晚期凋亡率为(34.25±1.83)%;免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达升高,Bel-2/Bax比值明显下降.以上结果与其他组的检测结果相比,差异具有统计学意义.结论 超声辐照载羟基喜树碱微泡能明显诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡,其机制可能与降低Bcl-2/Bax比值有关.     

肝癌干细胞标志物及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌干细胞生长的影响

目的:研究肝癌细胞系SMMC7721肿瘤干细胞表面标志物,探讨细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌细胞的生长抑制作用,以及其对肝癌细胞中具有干细胞特性群体的影响。方法:用流式细胞仪将肝癌细胞按细胞表面标志CD133、CD44进行分离,分为CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4个群体,采用脂质体法将细小病毒H-1非结构蛋白NS-1质粒转染入人肝癌细胞SMMC7721,采用G418筛选稳定转染的细胞克隆,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞NS-1基因的表达。流式细胞仪分析SMMC7721转染前后肿瘤干细胞表面标志CD133、CD90、CD44的表达和细胞生长周期,检测细胞群体的变化。以裸鼠成瘤实验和软琼脂克隆形成实验评价具肿瘤干细胞性质的肝癌细胞表面标志物以及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1转染对肝癌细胞生长的影响。结果:肝癌SMMC7721细胞分成CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4组亚群的细胞存在着异质性,4组亚群细胞中均有少数肿瘤干细胞样细胞能在软琼脂上形成克隆,其中CD133+CD44+、CD133+CD44-亚群克隆形成率分别为3.5%和1.8%,CD133-CD44+、CD133-CD44-亚群克隆形成率为0.7%和0.5%。转染细小病毒H-1非结构蛋白NS-1后,4组亚群细胞克隆的形成率都显著下降。裸鼠成瘤实验提示,CD133+表型的细胞成瘤能力强于CD133-表型细胞,CD133-CD44+亚群细胞成瘤能力最弱。流式细胞仪分析显示转染NS-1后,CD133+群体细胞被明显抑制,由31.9%下降至6.3%,而CD90+和CD44+的表达未出现改变;转染NS-1后细胞S期百分率明显下降。结论:肝癌细胞表型为CD133+CD44+和CD133+CD44-亚群中富含肝癌干细胞,转染细小病毒H-1非结构蛋白基因NS-1的部分亚群SMMC7721细胞生长被抑制,提示其对肝癌细胞株中具有干细胞特性的CD133+群体有一定的抑制效应。     

TPT1基因转染对肝癌细胞系SMMC-7721生物学行为的影响

目的：观察TPT1转染对肝癌细胞系生物学行为的影响.方法：用QIAGEN超纯质粒抽提试剂盒抽提TPT1的真核表达质粒pEGFP-N3TPT1和pEGFP-N3,通过lipofectAMINE,在24 h内连续3次转染肝癌细胞系SMMC-7721,通过荧光显微镜、RT-PCR观察转染、表达效率,通过MTT实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期分析,研究TPT1转染对肝癌细胞系SMMC-7721生物学行为的影响.结果：用此重构体转染后,在荧光显微镜下,可见细胞发出明亮的绿色荧光,转染效率约在30%左右.RT-PCR分析显示,pEGFP-N3 TPT1转染的细胞,TPT1 mRNA水平升高0.78倍（P〈0.05）.与对照组相比,pEGFP-N3TPT1转染可明显增强肝癌细胞系的增殖能力和软琼脂克隆形成能力（P值均〈0.05）,使G2＋S/M期细胞数增多.结论：pEGFP-N3 TPT1可在肝系细胞内高效表达,TPT1可增强肝癌细胞系SMMC-7721的恶性表型.     

康艾注射液对肝癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察康艾注射液对体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用。方法采用噻唑蓝（MTT）法和流式细胞技术研究康艾注射液对SMMC-7721细胞增殖和细胞周期的影响。结果康艾注射液能够抑制肝癌细胞的增殖,且呈剂量依赖性,半抑制常数IC50为185.73μl/ml;随着其作用浓度的增大,肝癌细胞G0/G1期和G2/M期细胞减少,S期细胞变化不明显;Sub-G1期变化明显,出现明显的凋亡峰。结论康艾注射液具有抑制肝癌细胞增殖和改变细胞周期分布的作用,对肝癌的治疗具有重要的意义。