内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压的研究进展

肺动脉高压(pulmonaty arterial hypertension,PAH)是一种预后差、病死率高的疾病,其主要特征为肺动脉阻塞引起的肺血管阻力和肺动脉压力持续性升高,并伴不可逆性肺血管重构,最终导致有心衰竭而死亡。2008年WHO第4次肺动脉高压会议上将PAH的诊断标准定义为:静息状态下肺动脉平均压(PAP)大于25 mmHg;肺血管阻力(PVR)大于3个Wood单位。将PAH归属为第1类肺动脉高压,其中包括:特发性PAH(IPAH)、遗传性PAH、药物或毒物诱导的PAH,以及(结缔组     

肺动脉高压大鼠循环内皮祖细胞及血浆一氧化氮水平的实验研究

目的探讨肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)模型大鼠循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)水平的变化及其与血浆一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度的关系。方法利用野百合碱诱导大鼠发生肺动脉高压,使用流式细胞仪对其外周血CD45阴性、CD34/FLK-1双阳性的单个核细胞,以表示循环EPC,同时采用Greiss法对其血浆NO浓度进行检测。利用简单线性回归分析二者之间的关系。结果 PH模型组循环EPC水平明显低于对照组(0.016%±0.007%vs 0.031%±0.011%,t=3.144,P<0.01)。血浆NO浓度亦显著下降(19.66±2.78μmol/L vs 54.31±3.81μmol/L,t=20.784,P<0.01)。二者之间呈正相关(r=0.792,P<0.05)。结论 PH的发生可能与血浆NO浓度降低导致循环EPC水平下调有关。     

内皮祖细胞移植治疗儿童原发性肺动脉高压的初步探讨

目的探讨内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC)移植治疗儿童原发性肺动脉高压的可行性、安全性和有效性。方法分别将(0.5±0.3)×107内皮祖细胞经右心导管注射于13例原发性肺动脉高压患儿的肺动脉。观察治疗前后6min步行距离及血液动力学参数(平均肺动脉压、心排血量和肺血管阻力)。结果随访3个月,患者行EPC移植治疗后,6min步行距离从(230±56)m增加至(313±65)m(t=3.252,P<0.01);平均肺动脉压从(62±10)mmHg下降至(53±12)mmHg(t=3.213,P<0.01);心排血量从(3.6±1.2)LOmin增加至(4.2±1.1)LOmin(t=3.356,P<0.01);肺血管阻力从(1195±437)dyn.sec.cm-5下降至(905±427)dyn.sec.cm-5(t=3.206,P<0.01)。治疗期间未见明显的与内皮祖细胞移植相关的副作用。结论内皮祖细胞移植治疗儿童原发性肺动脉高压是可行、安全和有效的。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的体外扩增培养

目的探讨建立体外培养内皮祖细胞（EPC）的方法。方法通过密度梯度分离法从大鼠骨髓中分离单个核细胞,培养7 d后,行Dil-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色,并行流式细胞检测及细胞迁移实验。结果细胞培养7 d后,可见梭形细胞呈优势生长,Dil-acLDL与FITC-UEA-1荧光标记的双阳性细胞占细胞总数的比例为82.7%±5.1,培养第10天开始出现铺路石样细胞集落,培养后第7、14天CD34阳性细胞所占的比例分别为（32.3±3.2）%、（39.2±4.4）%（t=5.18,P〈0.01）,FLK-1阳性细胞所占的比例分别为（28.7±3.2）%、（44.5±3.8）%（t=5.32,P〈0.01）。培养7 d后迁移至膜下层的EPC数为（10.4±1.9）个,培养14 d后迁移至膜下层的EPC数为（11.8±2.5）个（t=0.83,P〉0.05）。结论分离大鼠骨髓单个核细胞,用选择性内皮生长体系培养EPC,再通过细胞免疫及细胞功能检测所分离的细胞,是一种较为良好的分离与鉴定EPC的方法。     

辛伐他汀干预对大鼠肺动脉高压及其内皮祖细胞的影响

目的：探讨辛伐他汀治疗大鼠实验性肺动脉高压（PH）的疗效及其对循环内皮祖细胞（EPC）数量和功能的影响。方法选取Sprague‐Dawley大鼠24只,随机分为3组：模型组、干预组、对照组,每组8只。利用野百合碱皮下注射制备PH模型,干预组大鼠于第3天应用辛伐他汀对其进行治疗,第21天测定比较各组大鼠右室收缩压（RVSP）、肺血管结构和循环 EPC的数量,同时体外培养各组EPC ,对各组EPC的产量和功能进行分析比较。结果干预组循环EPC含量明显高于模型组及对照组（P＜0．01）;和模型组比较,干预组RVSP、肺小动脉中膜厚度与血管外径比值显著降低（P＜0．01）,管腔面积与血管总面积比值（VA/TAA）显著增高（P＜0．01）;体外培养下,干预组EPCs的产量以及增殖、黏附、迁移能力均较模型组显著增高。结论辛伐他汀能够通过有效上调PH模型大鼠循环EPC的数量及功能,从而达到对PH的治疗目的。     

糖尿病大鼠骨髓内皮祖细胞的培养与鉴定

目的 探讨糖尿病大鼠骨髓来源的内皮祖细胞体外诱导、培养和扩增的方法. 方法 用密度梯度离心法采集糖尿病大鼠骨髓单个核细胞,在含有血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中进行体外培养.应用免疫组织化学和免疫荧光法鉴定内皮祖细胞的CD34和CD133,并通过检测其对FITC标记的UEA-1的吸附和Dil-acLDL的吞噬来进行细胞功能的鉴定. 结果 在培养2天后部分细胞开始贴壁、变大,并逐渐伸展呈梭形.第7天时贴壁细胞增生明显,"集落"样生长.培养第7天细胞CD34和CD133均呈阳性,激光共聚焦显微镜观察显示EPC可以同时吞噬ac-LDL并结合UEA-1. 结论 糖尿病大鼠骨髓可以分离培养出内皮祖细胞,并能体外扩增,为糖尿病内皮祖细胞的移植研究奠定了基础.     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及其生物学特性

目的：探讨大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养方法及其生物学特性。方法：采用二次贴壁法体外扩增培养大鼠骨髓内皮祖细胞,观测细胞增殖能力;免疫化学检测细胞CD133、CD34、Flk1、CD31的表达;三维培养细胞并观察其体外成血管能力。结果：细胞培养第4天集落样生长,呈圆形或梭形;第10天细胞长满瓶底,呈鹅卵石样外观。原代血管内皮祖细胞CD133、CD34、Flk1均表达阳性;第2代细胞CD34、CD31、Flk1均表达阳性,CD133表达阴性。三维培养第2代血管内皮祖细胞在胶原内有＂出芽式＂生长现象及管腔样结构形成。结论：体外扩增法可以从骨髓中分离培养出内皮祖细胞,三维培养发现其具有体外成血管能力。     

FSGS大鼠骨髓内皮祖细胞数量和功能的变化及其意义

目的观察阿霉素肾病大鼠骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量和功能的改变,探讨EPCs在局灶节段性肾小球硬化(FSGS)发生发展中的可能意义。方法选择阿霉素诱导的FSGS大鼠(FSGS组)和正常对照组大鼠(对照组)各10只,密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,将其接种在培养板培养6d,对贴壁细胞进行免疫细胞化学分析。激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记的荆豆凝血素1(FITC-UEA-1)和DiI标记的乙酰低密度脂蛋白(DiI-acLDL)免疫双荧光阳性细胞为正在分化的EPCs。改良的Boyden小室和黏附能力测定观察EPCs的迁移和黏附能力。结果阿霉素诱导的FSGS大鼠骨髓EPCs数量明显减少〔EPCs/(视野×400)分别为(30.2±2.4)与(51.1±13.9),P<0.05〕,且FSGS组大鼠骨髓EPCs的黏附和迁移能力明显受损。结论FSGS的发生、发展可能与骨髓EPCs数量减少、迁移、黏附功能减退有关。     

年龄对骨髓内皮祖细胞功能的影响及意义

目的 观察大鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）功能随年龄的改变,探讨年龄因素对EPC功能与活性的影响。方法 选择4月龄、18月龄SD大鼠各10例,用密度梯度离心法从骨髓获取单个核细胞,培养7d后激光共聚焦显微镜鉴定DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL）和FITC标记荆豆凝血素I（FITC-UEA-I）双染色阳性细胞为正在分化的EPC。采用改良的Boyden小室和粘附能力测定实验观察EPC的迁移和粘附能力。另选取18月龄SD大鼠20只,均分为两组,分别接受4月龄组和18月龄组EPC移植,于移植14d后提取主动脉内皮细胞DNA,检测内皮细胞端粒长度的改变。结果 随年龄的增加EPC迁移、粘附及修复损伤内皮功能减退。结论 年龄增加可导致大鼠骨髓EPC功能减退。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的研究大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）分离、培养并向内皮细胞方向诱导分化的方法和条件。方法从大鼠骨髓中分离单个核细胞．经差速贴壁后取二次贴壁细胞选择性诱导培养2W。以Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色法以及vWF、Flk-1免疫荧光染色法鉴定EPC;流式细胞术（FACS）检测EPC纯度;细胞培养液一氧化氮（NO）含量测定分析EPC功能。结果二次贴壁细胞经诱导培养后3d开始伸展,5d形成集落,7～10d增殖加速并出现条索状结构,2W大部分细胞呈多角形。Dil—ac—LDL、FITC-UEA-1双染．vWF及Flk-1免疫荧光染色阳性率均〉70％。FACS检测其中vWF阳性细胞占77．93％．Flk-1阳性细胞占81．50％。二次贴壁并经诱导培养的细胞培养液中NO含量明显高于普通培养的细胞．但低于成熟内皮细胞（P〈0．05）。结论大鼠骨髓富含EPC,体外诱导培养后可以表现出内皮细胞的部分特征。     

原发性高血压条件下骨髓来源内皮祖细胞数量及功能的变化

目的了解原发性高血压对体外培养骨髓来源内皮祖细胞（EPC）数量及功能的影响。方法将自发性高血压大鼠（SHR）分为6、12周龄组,以同周龄正常血压Wistar-Kyoto（WKY）大鼠为对照。以密度梯度离心法分离骨髓来源单个核细胞体外培养．差速贴壁法培养7d后收集贴壁细胞并行鉴定为骨髓来源内皮祖细胞,测定EPC数量、细胞增殖活力（MTT法）、NO分泌及细胞凋亡率。结果6周龄SHR骨髓来源EPC数量与6周龄WKY大鼠比较差异无统计学意义（P〉0．05）,细胞增殖能力、NO分泌能力受损（P〈0．05）,凋亡率稍增多但差异无统计学意义（P〉0．05）。12周龄SHR骨髓来源EPC数量与12周龄WKY大鼠比较明显减少（P〈0．01）,细胞增殖能力、NO分泌能力受损（P〈0．01）,凋亡增多（P〈0．05）。结论随着SHR血压升高和原发性高血压病程延长．骨髓来源内皮祖细胞数量减少。功能减退,凋亡增多。     

妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞功能的研究

目的研究妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞功能的变化。方法选择2010年10月～2011年8月于我院产科住院的妊娠高血压综合征患者12例作为研究对象（妊娠高血压综合征组）,同时选取12例正常妊娠的同期入院患者作为对照组。分离两组患者外周血单个核细胞进行体外诱导培养以获得内皮祖细胞,并对其增殖、黏附、迁移能力进行检测。结果各组骨髓单个核细胞在体外培养下均能够获得内皮祖细胞．与对照组比较,妊娠高血压综合征组内皮祖细胞增殖、黏附、迁移能力均有不同程度的下降。结论妊娠高血压综合征的发生与循环内皮祖细胞功能的下调存在明显的相关性。     

共培养大鼠内皮祖细胞对白体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）与自体骨髓基质细胞（BMSCs）共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离、培养大鼠BMSCs和EPCs,培养细胞分为四组：A组（BMSCs组）、B组（EPCs组）、C组（BMSCs成骨诱导组）及D组（BMSCs和EPCs联合培养组）。通过观察细胞克隆形态、免疫细胞化学、细胞增殖、碱性磷酸酶活性,从酶学、组织学及生化等不同方面观察EPCs对BMSCs成骨活性及生长情况的影响。结果免疫细胞化学染色证实C组培养的细胞具有晚期EPCs的特性。倒置相差显微镜、HE染色均证实共培养的BMSCs和EPCs生长良好,并能够形成与单纯成骨诱导培养的BMSCs相似的钙结节。MTr检测结果：各组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）。碱性磷酸酶活性检测结果：C、D组显著高于A、B组（P〈0．05）。结论EPCs和BMSCs联合培养具有良好的细胞相容性,EPCs能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力。     

兔血管内皮祖细胞的体外获取

目的:探讨如何获得高浓度的兔血管内皮祖细胞(EPC).方法:抽取兔双下肢骨髓,应用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞,进行体外培养、传代,应用细胞生长因子VEGF和bFGF联合诱导培养传代细胞,观察诱导前和诱导后第2代、3代细胞形态的变化,并对培养所得的细胞进行免疫细胞化学染色,观测CD34、CD133、CD31表达水平的变化.结果:培养细胞第2 d出现簇状贴壁生长,第4 d由圆形变成纺锤形,呈条索状排列.与诱导前相比,诱导后第2代细胞CD34、CD133和CD31阳性细胞率无明显变化,诱导后第3代细胞CD34细胞阳性率无明显改变,CD133细胞阳性率明显下降,CD31细胞阳性率明显升高(P均＜0.05).结论:兔骨髓源的单个核细胞可以在体外分离培养,诱导所得细胞具有EPC的特性.     

大鼠脾脏与骨髓源内皮祖细胞生物学特性的对比研究

目的 体外分离培养Sprague Dawley(SD)大鼠脾脏和骨髓来源内皮祖细胞(EPCs),并比较其生物学特性.方法 采用密度梯度离心法,从健康4周龄SD大鼠脾脏和骨髓中分离出单个核细胞,体外诱导分化为EPCs,对比分析两种EPCs的形态、增殖、迁移、黏附和一氧化氮(NO)分泌能力.结果 从脾脏和骨髓均可分离获得大量单个核细胞,但骨髓组织可获得的细胞数量更多,两种来源的细胞在体外诱导培养均可形成类似于血岛样集落,绝大部分细胞吞噬DiI荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白和绿色荧光标记的荆豆凝集素双染为阳性;骨髓来源的EPCs在细胞增殖、迁移、黏附扣NO分泌能力等方面均显著高于脾脏来源的EPCs.结论 骨髓较脾脏更适宜作为体外培养EPCs的组织来源.     

兔骨髓来源内皮祖细胞分离培养及鉴定

目的 研究新西兰大白兔骨髓来源内皮祖细胞(EPC)的分离培养和鉴定方法,证实骨髓是获得内皮祖细胞的理想来源之一,为后续研究提供材料准备.方法 取兔骨髓,密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC),置于DMEM-L培养基中培养,动态观察细胞生长过程,采用免疫荧光染色和细胞荧光化学法鉴定培养的细胞.结果 培养10 d的EPC能吞噬ac-LDL并与凝集素UEA-1相结合,同时表达CD34和CD31相关抗原.结论 密度梯度离心法从兔骨髓中分离的MNC在一定条件下,能够分化为具有内皮祖细胞特征的细胞,为后续的实验研究提供了细胞来源.