广东登革3型病毒株的分离培养和鉴定

目的对2009年发生于广东地区的3例家庭聚集性登革热患者血清进行登革病毒的鉴定和病毒株的培养分离。方法用胶体金法检测患者血清中登革病毒特异性IgM、IgG抗体;C6／36细胞培养患者血清中登革病毒;RT—PCR扩增C．PrM基因序列的片段以检测患者血清中登革病毒RNA,PCR产物经序列测定后进行生物信息学分析。结果3例患者血清学检测均为登革病毒特异性IgM阳性、IgG阴性;特异性RT—PCR产物长约290bp,经琼脂糖电泳和测序分析,证实3例患者血清中均存在登革3型病毒;从1例患者血清中培养分离到了登革病毒株,经RT—PCR和测序证实为登革3型病毒。结论2009年发生于广东地区的3例登革热患者经病毒培养和分子生物学鉴定,证实均为登革3型病毒感染。     

登革病毒特异性抗原片段的筛选鉴定及其ELISA方法的建立

目的 筛选、鉴定登革病毒共同及型特异性抗原,用纯化抗原建立检测登革病毒抗体的ELISA方法.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E、NS1蛋白进行分析,预测可能的抗原表位.并根据表位位置和氨基酸序列的相似性,分析登革病毒的共有及型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革病毒株中的保守性.然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a、pMAl-c2x原核表达系统进行原核表达,Western blot验证其免疫学反应特异性.Western blot检测阳性抗原片段经亲和纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化.结果经系统的生物信息学分析,共预测获得登革病毒抗原表位18个,登革病毒型特异性抗原表位25个,并对其中得分值较高的5段进行了高效表达,经Western blot分析,获得登革1～4型(Den-Ag5),登革2、4型(Den-Ag3),登革1～3型(Den-Ag2)病毒共同抗原片段各一段,登革1、2、4型( Den-Ag1、Den-Ag4)共同抗原片段两段,与流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒及所用甲病毒多克隆抗体均无交叉反应.选择Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2作为检测用抗原,建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法,初步应用表明,所建立方法具备良好特异性,可检测50～200倍稀释的患者血清,S/N比值均在15以上.结论 经系统筛选,获登革病毒特异性抗原片段5段,并建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法.     

登革热病毒RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定登革热病毒（DV）及DV病毒的RNA拷贝数。方法利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对登革热病毒RNA定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果该方法检测灵敏度可达1×103copies/mL,特异性及重复性良好,对同一样品进行5次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为0.792。结论TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定登革热病毒及DVRNA载量。     

深圳市首例本地登革热3型病例的病原学检测与分析

目的对2016年深圳市报告的首例本地疑似登革热病例查明病因.分离鉴定病原体,从分子水平分析分离株的生物学特征.方法对疑似患者血清标本采用ELISA、胶体金免疫层析法和荧光RT-PCR方法分别检测登革病毒抗体、NS1抗原和病毒核酸,并用C6/36细胞分离登革病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒PrM/M-E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革毒株进行同源性比较和进化树分析.结果从患者血清标本中检测到登革病毒IgM抗体、NS1抗原和登革3型病毒核酸,并成功分离到登革3型病毒,将其命名为DENV3-SZ1648.深圳市登革3型病毒分离株SZ1648与登革3型国际标准株H87株、国内外流行株80-2、GWL-25株在PrM/M-E基因上核苷酸同源性分别为92.0％、91.8％和90.3％,而与登革1、2、4型国际标准株HAWAII、NGC、H241同源性分别为68.7％、64.2％和63.2％.进化树显示SZ1648株与2007年印度尼西亚分离株MKS-0098亲缘关系最近,在进化树的同一分支上,和85-159株(Indonedia 1985)、2167株(Tahiti 1989)、29472株(Fiji1992)等同属基因Ⅰ亚型.患者发病前1个月在深圳居住,无输血史、无外出史.结论从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该本地病例是由登革3型病毒引起,这也是深圳市首次报道存在本地登革3型病毒的疫情,该毒株最有可能来源于印度尼西亚.     

应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA

目的：采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA，为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达，深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法：根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列，设计上下游引物。从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA，采用长链RT-PCR技术进行扩增。为检验扩增产物的特异性，以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段。将含有复杂二级结构的5′非编码区扩增片段，在377A型自动测序仪进行序列分析。结果：扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子，非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有。结论：利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子。     

马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速、敏感、特异的双重实时荧光定量PCR方法,可同时检测马尔堡病毒和埃博拉病毒.方法 通过序列比对挑选出两种病毒基因组中高度保守的序列,分别设计引物及Taqman探针,两条探针分别标记FAM和Texas Red荧光报告基因,建立双重实时荧光定量PCR反应体系.结果 双重荧光定量PCR方法检测两种病毒阳性标准品的灵敏度分别为30.5拷贝/μl和28.6拷贝/μl,通过检测日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应,有较好的灵敏度和特异性.结论 建立了马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法,实现了两种病毒同时实时定量检测,在传染病防控领域有较好的应用前景.     

Kadipiro病毒TaqmanReal—timePCR检测方法的建立

目的利用TaqManReal—timePCR技术，建立Kadipiro病毒（KDV）实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank发表的KDV基因序列资料分析结果，在其第12片段基因区段设计KDV特异引物与探针，利用14株不同科属病毒核酸验证方法特异性，重复实验检验方法稳定性，利用体外转录的定量RNA标准品建立基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针具有良好的特异性，同一样品重复检测D值的变异系数均〈1．8％，定量分析模型的灵敏度为100拷贝／反应。结论建立了一种特异、灵敏、高效的KDV一步法TaqManReal-timePCR检测方法，为今后该病毒的监测与研究工作提供技术手段。     

人3型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立人3型腺病毒荧光定量PCR检测方法,快速鉴定人3型腺病毒感染,为早期诊断提供依据。方法以人3型腺病毒感染的细胞和常见的呼吸道消化道感染的病原体为研究对象,根据病毒六邻体高度保守的序列,设计荧光定量PCR反应体系,并分析实验的敏感性和特异性。结果人3型腺病毒TCID50细胞培养液中病毒核酸最低检出稀释度是10^-6,对应的拷贝数分别是5．802×10^3copies／mL和6．968×10^2copies／mL．呼吸道和消化道感染常见的病原体未出现交叉反应。结论荧光定量PCR的应用,可有效缩短检测时间,提高检测的敏感度。     

登革病毒的Y型引物四重荧光定量RT-PCR方法的建立与评价

目的:利用Y型引物和荧光定量RT-PCR技术建立一种用于登革病毒(dengus virus, DENV)快速分型的四重荧光定量RT-PCR检测方法。方法:用DENV四种分型体外转录RNA对该方法的灵敏度、特异性进行评价及用临床样本进行验证。结果:DENVⅠ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型最低检出限分别为5.01反应/PCR、6.1...     

我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因免疫原性的研究

目的 构建含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因片段的真核表达质粒,观察重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价疫苗的研究提供依据。方法 首先将包含我国登革2型病毒43株E蛋白Ⅰ/Ⅱ抗原区和4型病毒B5株E蛋白Ⅲ抗原区的嵌合E基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过测定确定嵌合基因序列的正确性。然后将重组质粒以肌肉注射途径,免疫Balb/C小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 构建的含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因的真核表达质粒pcDNA-D2/4,经序列测定表明,导入的嵌合E基因片段的序列是正确的。将重组质粒DNA免疫小鼠,在初次免疫后的第3周,可同时检测到针对登革2型和4型病毒的特异荧光。结论 所构建的含有不同血清型的我国登革病毒株嵌合E基因片段的真核重组质粒,可诱导小鼠同时产生针对两个血清型病毒的特异抗体,该研究为新型登革多价疫苗的研制提供了依据。     

H9N2禽流感病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立

目的 建立一种可同时检测禽流感病毒H9N2的HA和NA基因一步法双重荧光RT-PCR方法.方法 针对H9N2禽流感病毒的HA和NA基因保守区,设计相应的特异性引物以及探针,优化检测体系及反应条件,建立一步法双重荧光定量RT-PCR方法.对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行验证与评估,并对家禽粪便标本进行应用检测,以单重实时荧光RT-PCR方法作为参照,检测结果不一致的样本采用测序进行验证.结果 该方法特异性强,与H1、H3、H5、H7亚型禽流感病毒、鸡新城疫及鸡传染性支炎病毒均无交叉反应,对HA和NA基因的最低检出限分别可达50拷贝/μL和25拷贝/μL,组间与组内的变异系数在0.20 ～0.79％之间.对82份粪便标本进行检测,H9N2禽流感病毒的阳性率为8.14％ (7/82),与单重实时荧光RT-PCR法检测结果一致.结论 该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可应用于临床禽流感样本的检测.     

诺如病毒遗传组I型TaqMan—MGB探针实时荧光RT-PCR的研究

目的建立诺如病毒遗传组I型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR快速、特异、灵敏的检测方法，为疾病预防控制提供可靠的依据。方法根据GenBank诺如病毒遗传组I型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan-MGB探针，建立一步法实时荧光RT-PCR快速检测反应体系，优化反应条件，评价反应体系的灵敏度、特异性、重复性．并与常规RT—PCR比较。结果诺如病毒遗传组I型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR检测时限短。仅1h就出结果。与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒、诺如病毒遗传组Ⅱ型无交叉反应，最低检出下限为100拷贝／反应，比常规RT—PCR灵敏100倍，5份浓度不同的诺如病毒遗传组I型标本重复检测5次。平均Ct值变异系数范围为0．39％-1．02％。结论诺如病毒遗传组I型TaqMan-MGB探针实时荧光RT—PCR快速、特异、灵敏、重复性好，可应用于突发公共卫生应急检测和诺如病毒遗传组I型监测，提高快速检测能力。     

登革2型病毒ZS01/01株病毒样颗粒免疫原性研究

目的 研究登革2型病毒（Dengue virus type 2,DENV-2）病毒样颗粒（virus-Like particles,VLPs）的免疫原性.方法 利用已构建的DENV-2 ZS01/01株病毒样颗粒的表达质粒转染293T细胞,对分泌型VLPs进行大量培养并通过蔗糖密度梯度离心法对其进行纯化.纯化的VLPs经Western Blot及透射电镜观察等方法鉴定后免疫BALB/c小鼠.利用ELISA及中和试验等方法对体液免疫反应进行检测,ELISPOT法测定细胞免疫水平.结果 登革2型病毒样颗粒表达质粒转染哺乳动物细胞所得上清经蔗糖密度梯度离心后,电镜下可观察到类似于天然登革病毒的大小在45～55nm之间的病毒样颗粒.体液及细胞免疫检测结果显示登革2型VLPs可以刺激小鼠产生较高水平的登革E蛋白特异性抗体及一定水平的中和抗体,免疫小鼠脾淋巴细胞经体外刺激后IFN-γ水平显著升高.结论 登革2型病毒病毒样颗粒免疫BALB/c小鼠后可引起一定水平的细胞免疫及体液免疫反应,该研究结果为四价登革病毒样颗粒疫苗的研制奠定了基础.     

B型流感病毒Yamagata系和Victoria系双重荧光PCR诊断方法的建立与应用

目的 建立一种新型的双重荧光PCR诊断方法,用于B型流感病毒By (B/Yamagata)和Bv(B/Victoria)亚系的准确分子分型.方法 从GenBank随机下载By和By HA(hemagglutinin)基因各50条序列,通过MEGA分析,利用Primer Primer软件设计亚系特异性引物和通用探针,建立双重荧光PCR诊断方法.用HAI(hemagglutination inhibition)实验确认的B型流感病毒亚系分离毒株和A型流感病毒进行特异性验证,用体外转录核酸拷贝数进行灵敏度实验.结果 2006-2010流感监测年份,对17 765份流感样病例咽拭标本中分离到B型流感病毒793株,本方法鉴定有152株By和641株Bv病毒,与HAI鉴定结果一致.本诊断方法的检测特异性达100％,灵敏度达102拷贝/μl,重复性变异系数＜3.5％.结论 本研究所建立的荧光PCR方法为流感实时监测提供了有力的技术支撑,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断.     

双色荧光定量PCR快速分型、定量高危型人乳头状瘤病毒

目的针对高危型人乳头状瘤病毒（humanpapillomavims，HPV）亚型的多样性以及感染病毒载量的高低，旨在建立高危型HPV的定量与分型的快速检测方法，为HPV筛查与治疗提供依据。方法利用2种荧光染料分别标记HPV-16、HPV-33／52／58／67和HPV-18／45、HPV-31探针，同时以B球蛋白基因作为内对照，对120份疑为HPV感染的宫颈脱落细胞样本进行I{I＇V分型与定量，定量范围为5×10^1-5×10^7拷贝/ml，以HC-2杂交捕获法作为“金标准”，评价该方法的特异性与灵敏度。结果荧光定量PCR阳性检出率为52．5％（631120），其中HPV-16、HPV-18／45、HPV-31和m．V-33，52，58，67阳性率分别为36．51％（23／63）、11．11％（7／63）、12．70％（8／63）、58．73％（37／63）；HPV感染的平均病毒载量为1．08×10^7拷贝/ml。荧光定量PCR的特异性为100％，灵敏度为81．82％。结论双色荧光定量PCR能快速分型、定量高危型HPV，可用于HPV感染的筛查与宫颈病变程度预测以及疗效观察。     

我国登革2型病毒43株包膜E蛋白MBP-B165抗原性的研究

目的 通过对我国登革2型病毒株包膜E蛋白包括B区在内的第267－432氨基酸编码基因片段的表达,研究MBP－B165蛋白的抗原性。方法 首先采用PCR方法扩增了编码B165蛋白的基因片段,并将其插入到pMal－C2核载体进行融合表达。采用蛋白印迹和ELISA法对表达产物进行特异性鉴定。用表达的融合蛋白MBP－B165免疫大白兔,产通过ELISA法检测兔免疫血清中登革2型病毒特异的抗体。结果 表达的融合蛋白MBP－B165可与我国登革2型病毒株抗体特异结合,而且与登革1、3和4型病毒参考株的多克隆抗体均具有较高的反应性。用表达蛋白免疫大白兔可产生针对我国登革2型病毒株E蛋白的特异抗体,并且该抗体与基他3个型病毒参考株有交叉反应。结论 我国登革2型病毒43株E蛋白包括B区在内的第267－432氨基酸序列具有一定的抗原性,而且具有黄病毒亚组特异的反应性表位,即4个型登革病毒的结构保守性表位。     

登革病毒在人与蚊虫细胞正选择压力下的致病性与基因序列变化分析

自然界中登革病毒在蚊虫与哺乳动物宿主内交替循环复制,研究病毒与不同类型宿主细胞间的相互作用有助于理解病毒基因突变与毒力变化的关系.本研究将登革2型病毒在人肝癌细胞(Huh-7)和蚊虫细胞(C6/36)之间交替传代模拟登革病毒在自然界中的人类与蚊虫间的交替感染,通过检测第10、18代病毒对小鼠的毒力以及在蚊虫中的感染率、...     

实时荧光定量PCR检测RAW264.7巨噬细胞中Th1/Th2型细胞因子转录水平方法的建立及初步应用

目的 建立小鼠RAW264.7巨噬细胞的Th1和Th2型细胞因子荧光定量PCR检测方法.方法 依据GenBank中小鼠的β-actin基因序列、Th1型及Th2型细胞因子的核苷酸序列设计特异性引物,以RAW264.7巨噬细胞mRNA反转录后的cDNA为模板,通过构建质粒阳性标准品,建立检测上述细胞因子转录水平的real-time PCR方法.结果 用建立的荧光定量PCR方法,检测牛型布鲁氏菌S2308株感染RAW264.7巨噬细胞后,巨噬细胞Th1和Th2型细胞因子的转录水平.最低检测量为102拷贝/μL,线性关系很好,R2≥0.982,该方法具有良好的特异性和重复性.结论 成功建立了检测巨噬细胞中Th1和Th2型细胞因子转录水平的荧光定量PCR方法.     

H5亚型禽流感灭活疫苗病毒基因的定量检测及其与HI抗体效价之间关系的分析

目的建立H5亚型禽流感病毒灭活疫苗中病毒核酸的特异、敏感、快速的定量检测方法，分析其与HI抗体效价之间的相关性。探索禽流感灭活疫苗效力体外检验的方法。方法选取H5亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）血凝素（hemagglutinin，HA）基因保守序列，使用Prinler Express 2．0软件设计了特异性引物和TaqMan MGB（minor groove binder）探针，利用实时荧光PCR技术来定量检测禽流感灭活疫苗，通过体外转录，制备含有选定检测序列的RNA标准品，绘制标准曲线。对50批H5亚型禽流感灭活疫苗进行了荧光定量PCR检测，测定了疫苗的HA基因拷贝数，同时测定了50批疫苗相应的HI抗体效价。进行了疫苗的HA基因拷贝数与HI抗体效价之间相关性的分析。结果该方法的灵敏度为10拷贝，反应，标准曲线的相关系数为0．998003，对H9亚型禽流感灭活疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应，特异性好、重复性佳。疫苗的HA基因拷贝数与HI抗体效价不相关。结论荧光定量PCR方法为H5亚型禽流感病毒灭活疫苗检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。     

我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性研究

目的 研究我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性，为构建登革病毒的感染性克隆、深入阐明病毒的致病机理奠定基础。方法 以我国登革2、3、4型病毒基因组全长cDNA为模板，用SP6 RNA聚合酶系统制备体外RNA转录体，经电穿孔转染细胞，观察其致细胞病变效应。从病变细胞培养上清中提取总RNA，用病毒特异引物进行RT-PCR扩增，以证实细胞病变为转录体RNA的恢复病毒所致。结果 我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体均可使细胞产生病变，从细胞培养上清中可扩增出登革病毒特异的片段。结论 构建的我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体具有感染性．可在蚊传代细胞内恢复为登革病毒颗粒。