MRI活体示踪PEG/PEI-SPIO标记脂肪源性干细胞移植治疗AD大鼠模型

目的 观察采用聚乙二醇/聚乙烯亚胺修饰超顺磁性氧化铁（PEG/PEI-SPIO）MRI活体示踪脂肪源性干细胞（ADSC）移植治疗阿尔茨海默病（AD）的可行性。方法 将48只AD模型大鼠随机均分为标记组、未标记组和磷酸缓冲盐溶液（PBS）组,分别向侧脑室内注入PEG/PEI-SPIO标记或未标记ADSC及PBS液;另取16只大鼠作为假手术组。分别于第7、14、21、28天行头部MRI,检测海马、颞顶叶皮质、小脑T2值及脑组织铁含量。结果 移植后各时间点标记组海马区及皮质区T2值均较其余3组缩短（P均<0.05）;第7、14天其皮质区T2值小于海马及小脑,第21、28天海马区T2值小于皮质及小脑（P均<0.05）。相同时间点标记组各脑区铁含量均较其余3组增加（P均<0.05）;移植第7、14天,标记组颞顶叶皮质区铁含量较海马及小脑增加（P均<0.05）,第21、28天海马区铁含量较颞顶叶皮质及小脑增加（P均<0.05）。结论 PEG/PEI-SPIO标记ADSC可反映其在AD模型鼠脑内的分布及迁移,并可通过MRI进行活体示踪。     

自体干细胞移植治疗兔后肢缺血中超顺磁氧化铁纳米颗粒标记磁共振体内示踪的研究

目的探讨自体骨髓间充质干细胞（BMSC）移植治疗兔后肢缺血中超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPION）标记磁共振成像（MRI）体内示踪的可行性和有效性。方法新西兰大白兔14只，分成A、B两组，各7只。制作后肢缺血模型。A组移植SPION与5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）共标记的自体BMSC；B组作为对照。术后MRI示踪，组织学检查，免疫组织化学染色。结果鉴定显示BMSCCD34和CIM5阴性，CD44阳性。B组中1只死亡。A组毛细血管密度198．9±2．3，B组80．5±5．1．A组毛细血管／肌纤维比值0．84±0．03，B组0．35±0．04，两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。A组：电镜发现血管内皮细胞胞质内含SPION；对应部位组织切片血管壁细胞普鲁士兰铁染色、BrdU和CD34染色均阳性；MRI显示术后即时A组注射部位圆形低信号影，术后1—3周向周围扩散，部位与组织学检查结果一致。B组仅能见到普鲁士兰阳性颗粒游离于组织间隙，并非位于血管内皮细胞；MRI低信号影局限于注射局部，无扩散。结论自体BMSC移植治疗兔后肢缺血中SPION标记MRJ体内示踪可行、有效。     

以超顺磁性氧化铁标记的神经干细胞移植后的磁共振成像示踪研究

目的探讨神经干细胞移植后存活细胞迁徙及分化的无创性监测方法。方法采用超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米粒子和5溴2脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）在体外对神经干细胞进行双标记，然后移植至大脑中动脉梗死大鼠模型（MCAO）的脑内（健侧）。术后1d以及1、2、3、4、5和6周，采用磁共振仪检测标记细胞的迁徙。第6周磁共振扫描后处死大鼠，依据磁共振成像（MRI）提示的移植细胞迁徙部位切取脑组织，进行普鲁士蓝染色和免疫组织化学染色，观察神经干细胞的迁徙及分化情况。结果移植后3周，MRI显示细胞沿胼胝体迁徙的条带状低信号，并在随后的定期MRI中观察到其向中线移动，脑组织标本普鲁士蓝染色及免疫组织化学染色的阳性位置与MRI结果一致，而且移植的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞及神经元。结论MRI可动态监测SPIO标记的神经干细胞移植后在体内的迁徙路径，且对受者无创。     

大鼠PnNOS基因修饰脂肪源性干细胞的构建

目的 构建过表达大鼠阴茎神经源性一氧化氮合酶（PnNOS）基因大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）,为基因修饰ADSCs移植治疗勃起功能障碍（ED）大鼠模型提供种子细胞.方法 获取大鼠PnNOS基因,并与线性化的腺病毒真核表达载体pDC315-EGFP定向克隆连接.构建正确的pDC315-PnNOS-EGFP穿梭质粒转染293 T细胞,采用Western Blot检测PnNOS基因在293 T细胞中的表达情况.利用AdMax腺病毒包装系统包装产生重组腺病毒,包装后扩增纯化并测定病毒滴度.PnNOS基因重组腺病毒转染大鼠ADSCs,观察GFP表达情况和Western Blot检测PnNOS基因表达情况.结果 经PCR鉴定、限制性酶切分析、测序鉴定和目的质粒Western Blot表达检测鉴定,证实pDC315-PnNOS-EGFP重组腺病毒载体构建成功.重组腺病毒包装成功且病毒滴度为5.0×109 PFU/ml.Western Blot于大鼠ADSCs中检测到约161 KDa大小条带,其与PnNOS蛋白分子量大小基本相一致.结论 大鼠PnNOS基因修饰的ADSCs构建成功,从而为基因修饰ADSCs移植治疗ED提供了良好的基因工程细胞.     

脂肪源性干细胞治疗骨关节炎研究进展

脂肪源性干细胞(ADSC)具有促进软骨修复作用,成为治疗软骨缺损与关节退行性变的新方向。虽然ADSC治疗OA机制尚未完全阐明,但其促进软骨分化与再生的作用已得到肯定。目前应用ADSC治疗骨关节炎(OA)的主要方式有经关节镜检查清理关节腔后,在关节腔内注入自体臀部或腹部的ADSC,或联合富血小板血浆一同注入,对不同程度OA患者疗效不同。但是,对于ADSC的取材部位、诱导分化方法及治疗OA最佳应用方式、剂量、疗程尚无定论。该文对ADSC治疗OA研究进展作一综述。     

脂肪源性干细胞与整形美容医学

1976年Fridenstein等首先报道从骨髓中分离出克隆源性的具有多向分化潜能的基质细胞-骨髓间充质干细胞(marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs).在MSCs被轰轰烈烈地用于治疗血液系统疾病25年后,Zuk等于2001年发现脂肪组织中除了含有已经定型的前脂肪细胞外,也包含一种具有多向分化潜力的细胞群,其性质与MSCs十分相似,但又不完全相同.这些细胞已被证实不仅具有分化成为骨骼、软骨、脂肪、心肌、神经等组织的能力,而且同样具有促进伤口愈合、损伤组织细胞再生和减少瘢痕的能力及抗衰老能力.     

MRI活体内示踪SPIO标记BMSCs的动物实验研究

目的研究活体内运用超顺磁性氧化铁颗粒(Superparamagneticiron oxide particles,SPIO)标记骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在核磁共振下的示踪情况。方法本研究挑选SPIO合适的离子浓度、合适的磁共振显影序列,利用SPIO核磁共振显影差异特性,在活体内示踪干细胞移植后的存活、修复、迁移及分化过程。结果利用SPIO核磁共振显影差异特性,活体内从影像学上直观证实了SPIO活体示踪干细胞的时限性、可行性及有效性,损伤小灵敏度高,可连续跟踪,为干细胞移植运用于骨科临床治疗及疗效判断提供了明确的体内监测手段。结论 MRI活体内示踪SPIO标记BMSCs可以帮助研究干细胞的作用过程、机理及转归。     

磁标记猪骨髓间充质干细胞自体肝内移植后MR活体示踪研究

目的探讨利用磁共振成像对移植肝脏的磁标记猪骨髓间充质干细胞进行活体示踪的可行性。方法获取猪自体骨髓间充质干细胞,分离、培养、扩增。应用菲立磁（Feridex）标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,标记细胞组（n=6）和未标记细胞组（n=4）行经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6h、3d、7d行磁共振T1WI,T2WI,GRE序列成像,7d后行组织切片普鲁士蓝染色。结果：普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达接近100％,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T2＊WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后7d,组织切片普鲁士蓝染色显示7d后肝内仍有移植的磁标记细胞存在于肝实质及肝窦中。结论利用SPIO可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,磁共振成像可以对经门静脉移植到肝内的磁标记MSCs进行活体示踪。     

自体脂肪源性干细胞辅助脂肪移植治疗面部凹陷畸形

目的 探讨自体脂肪源性干细胞辅助脂肪移植治疗面部凹陷畸形的可行性和临床效果.方法 预估面部凹陷畸形软组织缺损量,吸脂或切脂获取脂肪组织,采用标准分离、纯化程序获取人自体脂肪来源干细胞,将干细胞与颗粒脂肪混合体,用螺旋推进注射器施行皮下软组织缺损区移植.采用面型观察、B超、MRI检查确定临床疗效.定期判定随访患者对治疗效果的满意度.结果 本组共23例患者,术后随访1～24个月,未发现感染、硬结、皮下包块、囊肿或其他并发症.治疗后,畸形明显改善者14例,有效者9例.结论 自体脂肪源性干细胞辅助脂肪移植治疗面部凹陷畸形,其操作方法安全、有效,临床效果明显.     

超顺磁性氧化铁标记内皮祖细胞治疗静脉血栓的示踪研究

目的研究血管内皮祖细胞（EPCs）磁标记后从尾静脉移植人静脉血栓模型中进行干细胞活体示踪,为EPCs促进深静脉血栓机化再通提供一种有效的监测方法。方法首先分离、培养并鉴定大鼠EPCs,配制新型超顺磁性氧化铁（SPIO）并体外标记EPCs。制作大鼠下腔静脉血栓模型并将其分为4组：移植SPIO标记的EPCs（SPIO组）、移植Dil标记的EPCs（Dil组）、移植单纯EPCs（对照组）、移植1mL培养基（空白对照组）。术后各组分别行磁共振成像（MRI）检查、血管性血友病因子（vWF）免疫组织化学染色、HE染色,并计数新生毛细血管数目。结果MRI观察到SPIO组的EPCs定向迁移至下腔静脉血栓内,呈团块状信号影,信号密度随时间延长而增强,第14～21d磁信号达到最强并由此开始转弱。移植术后取血栓标本行常规病理HE染色及免疫组织化学染色的结果显示,SPIO组、Dil组及对照组均可观察到血栓中出现大量新生毛细血管管腔,3组间新生毛细血管数目比较差异无统计学意义（P〉0．05）,但这3组新生毛细血管数目明显多于空白对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论相比较Dil标记的示踪方法,SPIO标记的EPCs移植入深静脉血栓中进行活体MRI示踪安全、无创、有效、可行。     

多元醇法合成SPIO标记大鼠ADSCs的成神经诱导潜能及体外MR成像

目的探讨采用多元醇法合成的SPIO标记SD大鼠脂肪来源干细胞(ADSCs),进行成神经诱导和体外MRI成像的可行性。方法分离、纯化、鉴定SD大鼠来源的ADSCs;确定安全有效的标记浓度和时间后,将SPIO与ADSCs共孵育。体外MRI条件下,采用T2-mapping序列观察标记组的标记细胞数、标记持久性,以及标记后标记组与未标记组间信号强度和T2值的差异。ICP-AES检测MRI中标记细胞的单铁含量。结果 12μg/ml、25μg/ml PEG/PEI修饰的SPIO和25μg/ml PEG/PVP修饰的SPIO孵育12h后,可安全有效地对ADSCs进行标记;成神经诱导后,神经标记物Nestin、NSE有明显表达。体外MRI显示标记组的T2WI信号强度和T2值与未标记组差异均有统计学意义(P均0.001);103个细胞量即可引起T2WI信号和T2值的改变;PEG/PEI修饰的SPIO标记持久性维持到20天,PEG/PVP修饰的标记持久性维持到15天。当铁含量为1.56~1.8pg/cell时,标记细胞的T2值与未标记细胞差异无统计学意义(P0.05)。结论多元醇法合成的SPIO可直接对ADSCs进行标记,标记后不仅可向神经方向诱导分化,还可进行体外MRI示踪成像。     

磁性标记脂肪干细胞修复兔退变椎间盘

目的活体监测Gd-DTPA标记的脂肪干细胞（ADSC）在退变椎间盘内的存活、迁移和转归,观察ADSC对修复及延缓退变的作用。方法将新西兰大白兔30只制成腰椎椎间盘退变模型,2周后行Gd标记的ADSC（Gd-ADSC）移植及ADSC移植,在不同时间点摄X线片、行MR扫描及病理学检查,并与移植PBS比较。结果 Gd-ADSC移植后即刻,SPIR T1WI显示椎间盘内高信号随时间推移迅速减低。与同时间点移植PBS比较,ADSC及Gd-ADSC移植兔椎间盘退变程度较轻,髓核及纤维环内均可见胞浆丰富软骨样细胞。结论 ADSC椎间盘内移植有助于修复退变椎间盘和延缓椎间盘退变;Gd-ADSC移植后1周内可通过MRI进行监测。     

负载超顺磁性氧化铁的纳米囊泡标记人结肠腺癌细胞磁共振成像的初步研究

目的 探讨负载超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米囊泡体外标记人结肠腺癌细胞株（Lovo）进行MR成像的可行性.方法 制备负载SPIO纳米囊泡,培养人Lovo细胞.分别取含有5×105、1×106的细胞量与含不同量（50μl和500μl）的负载SPIO纳米囊泡的培养液共同培养,经培养1、3和6 h后,分别取所培养的细胞进行电镜超微结构观察和MR T1WI、T2WI成像,未标记的Lovo细胞株为对照组.结果 Lovo细胞与负载SPIO纳米囊泡培养后6 h,电镜下见SPIO进入Lovo细胞的细胞质内.MR T1WI图像上,实验组各组间、实验组与对照组间的信号无明显差异.T2WI图像上,培养1 h后,实验各组、实验组与对照组间信号无明显差异 培养3 h后,500μl SPIO标记1×106 Lovo细胞组出现轻度信号下降 培养6 h后,实验各组的信号均出现明显下降.结论 负载SPIO纳米囊泡可以标记人Lovo细胞,应用MR可以对其进行监测.     

体外标记神经干细胞脑内移植治疗大鼠创伤性脑损伤

目的 通过不同的方法对神经干细胞（NSCs）进行标记，观察NSCs脑内移植治疗大鼠创伤性脑损伤后的增殖和迁徙情况。方法 Feeney氏法制备大鼠创伤性脑损伤模型，绿色荧光蛋白（GFP）和超顺磁氧化铁（SPIO）标记NSCs后立体定向脑内移植。对移植后大鼠的神经系统行为和运动功能进行评估．免疫组织化学染色观察NSCs的存活及分化情况，并用磁共振成像的方法在体观察NSCs的存活和分布。结果 免疫组织化学检查显示脑内移植后部分GFP阳性细胞表达神经元特异性标记物β-tubilinⅢ，神经系统行为学评分显示移植组动物明显改善．NSCs脑内移植后3周磁共振成像显示移植区低信号改变。结论 移植NSCs可以有效地促进TBI大鼠神经行为功能的恢复，不同的NSCs标记方法能够综合评价细胞移植后的疗效。     

脑源性神经营养因子基因修饰脂肪间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤

目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰脂肪间充质干细胞(ADSCs)治疗大鼠急性脊髓损伤效果.方法 获取大鼠ADSCs细胞,观察其生物学特征,行溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记及腺病毒BDNF基因转染.将36只SD大鼠随机分为3组:脊髓损伤对照组(A)、ADSCs治疗组(B)及BDNF转染的ADSCs治疗组(C).在脊髓损伤部位行相应处理:A组植入明胶海绵;B组植入含3.0μl(3×1010/L) ADSCs的明胶海绵;C组植入含3.0μl(3×1010/L)转染ADSCs的明胶海绵.行为学评分及观察免疫荧光染色.结果 成功分离并培养ADSCs,可于体外稳定增殖.术后7、14、28 d,C组运动功能评分为(10.55±0.80、14.39 ±0.25、19.71 ±2.14)分,明显高于A组(5.35 ±0.68、7.93±0.45、10.78 ±1.18)分、B组(7.01 ±0.39、10.33±0.27、14.87 ±0.37)分.免疫荧光染色显示移植ADSCs脊髓组织内,均可见不同程度的分布有BrdU阳性标记细胞;荧光染色结果提示部分BrdU阳性的移植细胞同时呈胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性.结论 ADSCs在移植后能在宿主体内存活、迁移并分化.移植ADSCs之后,运动功能可见改善,证实ADSCs移植能改善中枢神经系统功能.     

吸脂组织中脂肪干细胞分离和定向分化的研究

目的探讨吸脂组织中的干细胞分离和体外诱导分化为表皮样细胞、成骨细胞及脂肪细胞的可能性。方法通过电动负压吸引获取1例行吸脂手术的30岁女性腹部脂肪组织,酶消化法获取脂肪来源干细胞,体外培养扩增,通过流式细胞仪检测表面抗原的表达。取生长良好的第3代人脂肪来源干细胞,分别应用成表皮诱导培养液（70％培养液A＋30％成纤维细胞培养基上清液＋10ng／L表皮生长因子）,成骨诱导培养基（DMEM／10％FBS,0．1μmol／L地塞米松,50μmol／L维生素C,10mmol／Lβ-甘油磷酸钠,100U／ml青霉素,100U／ml链霉素）和成脂肪细胞诱导培养基（DMEM＋10％FBS＋500μmol／L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤＋1μmol／L吲哚美辛）诱导20d后,分别对成表皮诱导组进行免疫组化检测CK19表达,成骨诱导组进行碱性磷酸酶检测,成脂诱导组进行油红O检测。结果流式细胞仪鉴定结果示,人脂肪来源干细胞CD44和CD49d为阳性,CD34为阴性。诱导20d后,成表皮诱导组示免疫组织化学鉴定结构显示有CK19的表达;成骨诱导组示细胞碱性磷酸酶染色阳性;成脂肪细胞诱导组示油红O染色,胞质内脂滴均被染成红色,证实为脂性液体。结论从吸出的脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞,在体外进行了脂肪干细胞的扩增和传代,所分离的脂肪来源干细胞具备多向分化能力。     

脂肪组织来源干细胞提高游离脂肪移植存活率的研究

目的 探讨脂肪组织来源干细胞移植在体内促进游离移植脂肪组织的再血管化,提高移植脂肪组织存活率的可行性.方法 自人体吸脂术中脂质部分分离、培养AScs,行成脂、骨和软骨分化.将ASCs以DiI标记后与人体吸脂术获得的脂肪组织混合移植于18只裸鼠背部,裸鼠背部随机注入3组移植物:ASCs组(A组)、胰岛素组(B组)及培养基对照组(C组).术后6个月观察移植物情况,通过组织观察、HE染色和免疫组化进行分析.结果 抽脂术脂质部分能获取大量的ASCs,能分化成脂肪、成骨和软骨细胞.术后6个月3组移植脂肪的湿重分别为A组(165.97±5.51)mg,B组(93.42±5.12)mg,C组(67.64±5.09)lIIg.A组移植脂肪的存活率高于B、C组(P=0.000).纤维化程度的测定,"网格点计数"3组移植物的点个数分别为A组(152.2±9.8)个/10HF,B组(743.9±20.4)个/10HF,C组(892.2±16.5)个/10HF.A组移植脂肪的纤维化及坏死程度低于B、C组(P=0.000).免疫组化证实:ASCs散在分布于部分脂肪细胞及小叶间隔中,ASCs在体内能够部分转化为血管内皮细胞.结论 脂肪组织来源干细胞移植在体内可促进游离移植脂肪组织的再血管化,提高移植脂肪组织的存活率并改善了移植物的质地.AsCs辅助移植可能是一种较为理想的细胞疗法.