基于线粒体COⅠ基因序列进行库蠓亚属(双翅目:蠓科)近似种的分子鉴定

为了更快速、准确地鉴别库蠓近似种以及弥补传统形态学在种类鉴定中存在的操作繁琐、难度大等不足,本文采用DNA测序的方法获得库蠓亚属的刺螫库蠓Culicoides punctatus、灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi等3种库蠓近似种的部分线粒体COⅠ基因序列,并对其进行分子鉴定;基于Kimura 2-parameter模型分析遗传距离,同时应用MEGA 6.0软件构建系统发育树。结果显示,序列经过Clustal W比对及人工校对后,上述3种库蠓的COⅠ序列长度为394 bp;遗传距离在种内和种间具显著差异(P﹤0.05);系统发育树中不同库蠓种类各自构成单系(群),同种类不同地理种群聚为一支。本研究初步证实了线粒体COⅠ序列可应用于库蠓近似种的分子鉴定。     

中国尖音库蚊复合组蚊虫的抗性动态和遗传多样性研究

本文通过采用生物测定、蛋白质电泳和等位酶分析等方法对4个地理种群尖音库蚊复合组蚊虫(Culex pipiens comples)的抗性水平、群体中酯酶基因表型分布和种群遗传多样性进行了研究.抗性检测结果表明,4个库蚊种群对敌敌畏、对硫磷、氯菊酯和溴氰菊酯的抗性较高,对残杀威、巴沙和胺菊酯的抗性较低.4个种群抗性大小是:山东淄川>湖北沙市>广东茂名>北京沙河,淄川种群蚊虫对敌敌畏抗性为66.7倍.酯酶电泳结果中,沙市和茂名2个库蚊种群酯酶表型多态性最高,淄川库蚊种群多态性最低,过量表达的B1比率占100%.种群遗传多样性研究表明,每位点平均等位基因数(A)为1.92,平均多态位点百分率(P)为52.78%,平均预期杂合度(He)为0.130,群体间遗传分化系数(Fst)值为0.368,平均基因流Nm=1.52,说明4个种群有较丰富的遗传多样性,群体之间存在相当多的遗传多样性,种群间的基因交流较低,遗传分化较大,表明与地理位置存在一定对应关系.     

微卫星锚定PCR技术研究云南微小按蚊群体遗传结构

目的研究云南不同地理来源微小按蚊的群体遗传结构,探讨不同群体间的遗传结构和分化现象。方法在云南省东、西、南、北及中部各选择1～2个自然村,用紫外诱蚊灯于每晚17时至次日7时诱蚊,收集雌成蚊以氯仿麻醉,经形态学鉴别为微小按蚊的样本取单蚊蚊腿,再经复合PCR方法鉴别微小按蚊A或C。采用微卫星锚定PCR技术（SSR-PCR）扩增微小按蚊单蚊基因组DNA,用BIOSIS,RAPDFST,RAPDDIST及PHILIP等软件统计分析基因位点多态性、固定指数FST及θ、种群间的迁移率（Nm）以及遗传距离、聚类分析构建系统树。结果以多态位点比例衡量各种群的遗传多态性,云南不同地区微小按蚊均共享较高多态性,其中元江（C）的变异程度较低,为43.3%,潞西（A）的变异程度较高,为78.6%。FST和θ结果提示,微小按蚊的遗传变异主要存在于种群内部。微小按蚊A与C分别或两者合并分析,Nm均大于1。系统树主要分为两支,元阳（C）、大关（C）和勐腊（C）聚为一支;另一支分为元江（C）与潞西（A）,新平（A）和临沧（C）,以及勐腊（A）共3层。结论各群体间遗传距离部分与亲缘种分类有关,未发现与地理距离相关。     

三峡库区上、下游血吸虫病流行区钉螺线粒体cox1基因遗传变异研究

目的研究三峡库区上、下游血吸虫病流行区钉螺线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚单位t（c毗1）基因的遗传变异。方法采集三峡库区上游四川、云南及下游安徽、湖北4省共7个地、市的钉螺样本,提取基因组DNA,PCR特异性扩增线粒体cox1基因并测序,用ClustalX（1．81）软件进行多序列比对,MEGA（4．0）软件Kimura2-parameter法计算遗传距离,邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建系统发生树。结果上游与下游不同地域株钉螺间cox1基因差异约为16％．下游地区的肋壳与光壳钉螺cox1基因差异约为3．7％,上游不同地域株钉螺碱基差异约为5．4％。遗传距离显示,上游四川与云南地域株的遗传距离为0．022～0．050,下游安徽与湖北地域株的遗传距离为0．014～0．027,而上游与下游各地区螺群间的遗传距离在0．127～0．138之间,明显大于上游或下游各地区螺群内的遗传距离。进化树结果表明,下游湖北的荆州、石首和安徽的芜湖、宁国钉螺形成一支系,上游四川的绵竹、新都钉螺同属一支系。但两种方法构建的进化树在云南大理钉螺的归属上存在差异,MP法提示大理钉螺从上游的分支中独立出来,单独形成一类。结论上游与下游不同地域株钉螺cox1基因遗传差异较显著,下游肋壳和光壳钉螺种群内遗传变异较小,而上游光壳钉螺种群内遗传变异较大。     

12个非综合征型遗传性耳聋家系mtDNA12SrRNA,tRNA~(Leu(UUR)),tRNA~(Ser(UCN))及16SrRNA基因序列分析

目的　探讨 mt DNA突变与遗传性耳聋的关系 ,以及突变家系对氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotic,Am An)耳毒敏感性差异的原因。方法　调查了 12个非综合征型耳聋家系 ;抽取外周血 ,提取 DNA;PCR扩增线粒体 DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)目的片段 ,分别以 Alw2 6 、Apa 及 Xba 限制性内切酶检测 15 5 5 G、32 43G及 744 5 G 点突变 ;行 mt DNA 12 S r RNA、t RNALeu(UUR) 、t RNASer(UCN)及 16 S r RNA基因序列测定。结果　经酶切及测序证实 12个家系具有 mt DNA突变 ,形式为 :15 5 5 G突变家系 10个 ,744 5 G突变家系 2个 ,未发现 32 43G 突变家系。基因测序显示 mt DNA 16 S r RNA基因序列变化形式为 :2 2 30 G点突变、2 2 30 AG插入、2 2 43AG插入及 2 2 30 AA插入突变 ,它们在家族性 Am An耳毒敏感性家系中被发现 ,且呈母系遗传 ;在 Am An不敏感家系中未被发现。结论　单纯 15 5 5 G或 744 5 G突变家系表现为无诱因的渐进性遗传性耳聋或先天性聋 ;15 5 5 G或 744 5 G突变合并 16 S r RNA基因突变者对Am An高度敏感 ,表现为家族性敏感致聋。     

非综合征型遗传性耳聋两家系线粒体基因突变分析

目的 探讨母系遗传非综合征型耳聋发病机理及7445^G点突变在这类家系及散发感音神经性耳聋病例中的发生率，为建立相应的基因诊断方法提供依据。方法 收集两个母系遗传非综合征型耳聋家系和14个感音神经性耳聋散发病例；抽外周血标本，从白细胞中提取DNA；聚合酶链反应扩增线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）目的片段，分别以Alw 26Ⅰ、ApaⅠ及XbaⅠ限制性内切酶检测1555^G、3243^G及7445^G点突变；行mtDNA 12S r RNA、tRNA^Leu(UUR)、tRNA^Ser(UCN)基因测序。结果 经酶切检测，两家系中12例为7445^G点突变阳性，其余6例及14例散发病例均为阴性，所有病例1555^G、3243^G点突变均阴性；7445^G点突变呈母系遗传。mtDNA测序显示，所有病例1555^G、3243^G点突变均阴性；酶切显示为7445^G突变阳性病例经基因测序均发现有（nt)7445A→G替换。结论 7445^G点突变在母系遗传非综合征型耳聋家系中有较高的发生率，而在散发病例中发生率很低；7445^G结合1555^G点7突变筛查对这类耳聋的诊断有重要意义。     

宁夏双翅目蠓科昆虫研究

为了研究掌握宁夏双翅目蠓科Ceratopogonidae昆虫,采用人帐诱法、畜诱法、灯诱法和网捕法对其种群组成和数量动态做了调查研究.研究获得宁夏蠓科4亚科6属40种,即细蠓亚科 Subfamily Leptoconopinae,细蠓属 Leptoconops Skuse 17种;毛蠓亚科 Subfamily Dasyheleinae,毛蠓属 Dasyhelea Kieffer 2种;铗蠓亚科 Subfamily Forcipomyiinae,铗蠓属 Forcipomyia Meigen 3种;蠓亚科 Subfamily Ceratopogoninae,库蠓属 Culicoides Latreille 16种,尼蠓属 Nilobezzia (Kieffer 1种和贝蠓属 Bezzia Kieffer 1种.在采获的标本中以细蠓属和库蠓属种类最多.是宁夏双翅目蠓科的主要构成者.银川平吉堡地区细蠓活动的盛季是在5月中旬至7月上旬,6月中旬为一年活动之最高峰;库蠓活动的盛季是在6月中旬至8月下旬,7月中、下旬为一年活动之最高峰;非吸血蠓活动盛季同库蠓,但一年中的活动高峰是在8月上旬.蠓虫几乎全天都有活动,但不同蠓种活动时域不同.库蠓是日出前和日落后1 h活动高峰的主要构成者,而白天蠓虫活动的高峰,确是以细蠓为主.细蠓的婚舞活动以上午为主,自然界细蠓受精率较低(53.85%),而马厩内受精率较高(94.34%).细蠓平均产卵30枚,产卵后平均寿命4.2天;孳生地主要为陆栖型和水陆过渡型,在地表湿润处其幼虫主要活动于2 cm厚范围.     

人类线粒体DNA长度突变

动物不同个体和种类的线粒体DNA(mt DNA)的遗传变异早期研究表明,几乎所有mt DNA的突变都属碱基替换。长度突变即碱基的增加或减少仅存在D环中。本文对人类不同地理分布和种族的112例mtDNA标本进行研究,通过高分辨的mtDNA限制图,研究433个切制位点的位置,结果表明,这些位点广泛分布于mtDNA分子全部13个编码蛋白质的基因,包括8个未知基因和5个已知基因即3个细胞色素氧化酶亚单位基因(CO1,2和3),1个ATP酶基因和一个细胞色素b基因(Cytb);2个rRNA基因(12S和16S)和22个tRNA基因中的21个以及D环和其它非编码区,这些位点中的278     

六种蚊虫DNA条形码序列分析

传统分类学鉴定需要有完整无残缺的成虫标本,对于非昆虫分类学研究人员应用传统分类学方法鉴定蚊虫较为困难;本研究旨在发掘更多适用于蚊类鉴定的DNA条形码,实现口岸一线蚊类的快速准确鉴定。本文通过提取14个蚊虫样品的基因组DNA,使用通用引物PCR扩增ITS1、ITS2、Cytb、COI基因及序列,PCR产物双脱氧法测序,结合NCBI中相关数据分析部分ITS2、Cytb、COI序列的相似性和遗传关系。结果显示:获得了14个蚊虫样品的部分ITS1、ITS2、Cytb、COI序列的非全长碱基序列共计39条;依据种内遗传距离和相似度将14个未知蚊虫分子分类鉴定为6种蚊虫:凶小库蚊、致倦库蚊、尖音库蚊、赫坎按蚊、白纹伊蚊、里海伊蚊;碱基使用率统计表明所测样品的Cytb、COI基因符合昆虫线粒体DNA碱基组成;构建基因ITS2、Cytb、COI系统进化树,符合蚊虫系统发育遗传进化理论。本研究对14个未知蚊虫样品的进行了分子鉴定,为蚊类的快速准确识别鉴定提供基础数据。     

利用几何形态学工具探讨库蠓属三近似种翅形变异及其亲缘关系(双翅目:蠓科)

为了实现对库蠓近似种的快速、准确鉴别,弥补传统鉴定方法中的不足,采用几何形态学方法对库蠓3近似种(东方库蠓Culicoides orientalis、凹缘库蠓Culicoides holcus、连斑库蠓Culicoides jacobsoni)进行翅型的差异性分析及亲缘关系探讨。通过地标点法对3种库蠓翅分别标记13个地标点,再利用普氏叠加、主成分分析、薄板样条法、变形网格、典型变量分析法及聚类分析法来分析其翅形的主要变化部位、变化趋势以及不同种类间的亲缘关系。结果显示,3种库蠓翅形存在明显差异,其变异主要集中在径中横脉、翅基部、径1室、径2室、中2室近端部和中4室,通过翅形能准确区分上述种类,聚类分析显示凹缘库蠓和东方库蠓亲缘关系最近,东方库蠓与连斑库蠓亲缘关系最远。翅形变异可用于库蠓近似种间的分类研究及亲缘关系探讨。     

DNA 条形码技术在黑瞎子岛鼠类鉴定中的应用

为了探索基于COⅠ基因的DNA条形码技术在鼠类鉴定中的应用,本研究检测了黑瞎子岛地区2科3属4种41只鼠类的COⅠ基因序列,进行比对分析,基于Kimura双参数模型计算种内种间遗传距离,用NJ法构建系统发育树,结果表明种间遗传距离显著大于种内遗传距离,聚类分析表现为很短的种内分支和较长的种间分支,同种个体聚为高支持度的单一分支。5只红背Clethrionomys rutilus 被误判为棕背 Clethrionomys rufocanus,24只莫氏田鼠Microtus maximowiczii被误判为东方田鼠Microtus fortis,1只大林姬鼠Apodemus peninsulae被误判为东方田鼠。研究结果表明, DNA条形码不仅能够纠正形态学鉴定中的错误,还能鉴别形态相近的近缘种。基于COⅠ基因的DNA条形码技术能够方便、快捷、准确的鉴定鼠类。     

中国人群16号染色体q12区存在系统性红斑狼疮易感基因

目的：明确16号染色体与中国人系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE)相关性，并对其进行易感基因定位以期发现疾病侯选基因。方法：以16号染色体遗传距离57．79－65．1cM的5对微卫星标记，对157个SLE患者家系DNA进行扩增，产物经377DNA测序仪电泳，所得数据由Genescan软件收集，并以ETDT及Genehunter软件进行统计处理。在阳性位点处寻找疾病侯选基因以实时PCR进行基因表达研究。结果：D16S409及D16S517与SLE存在传递不平衡，其中尤以D16S517最为显著（P＜0．0001）。D16S517中，271bp等位基因优先传递给患病子代，277bp等位基因则优先传递给正常子代。对侯选基因的研究显示OAZ（OLF1／EBF－associated zinc finger protein)基因表达显著高于正常对照。结论：中国人群16q12区（58．46cM)与SLE发病相关联，OAZ是该区域可能的疾病基因，其疾病机理有待进一步研究。     

微小按蚊复合体Rdna-ITS2序列差异及遗传多态性研究

本研究对我国微小按蚊广西、云南、海南 6个地理株和越南Caonguen株rDNA ITS2PCR扩增片段和序列差异作分析 ,获得基因片段总长为 5 6 1bp～ 5 6 3bp ,发现地理株间ITS2序列差异程度不同 ,分析表明元江株为微小按蚊C型 ;其余 6个地理株为A型。应用限制性内切酶Sau96Ⅰ对微小按蚊复合体rDNA ITS2PCR扩增片段作酶切分型 ,结果同样显示两型差异 ,从而简化微小按蚊复合体分类方法     

五个母系遗传非综合征性耳聋和药物性耳聋的中国汉族家系

目的 通过对母系遗传非综合征性耳聋家系临床和分子遗传学特征分析,进一步探讨线粒体12S rRNA基因对母系遗传药物性耳聋的影响.方法 收集5个非综合征性耳聋患者家系,提取基因组DNA,然后进行线粒体DNA全序列和间隙连接蛋白β2(gap junction protein beta 2,GJB2)基因扩增并测序分析.结果 5个家系内和家系间的母系成员在听力损失、发病年龄和听力曲线上存在较大差异.5个家系耳聋发生的外显率分别为17.6%、50.0%、66.7%、31.3%和23.1%,平均外显率是37.7%.线粒体全序列显示家系间存在已知的1555A＞G突变和不同的多态性位点,分别属于东亚人群D4b2b、B4c1b1、F3、C1、D5a单倍型.这5个家系没有携带已知的线粒体DNA继发突变,但发现了2个保守性较高的ND1L89T和CO3 A200T突变.而且,GJB2基因上未发现与耳聋相关的突变.结论 这5个母系遗传非综合征性耳聋家系中,线粒体DNA继发突变、GJB2基因可能没有影响1555A＞G的表型表达.然而,氨基糖甙类抗生素、线粒体DNA多态性及其他核修饰基因可能对这5个耳聋家系的表型表达起到修饰作用.     

线粒体DNA D-loop区多态性与贵州四个少数民族的遗传关系

目的从母系遗传角度探讨贵州侗族、仡佬族、土家族和彝族群体的遗传结构及遗传分化关系。方法对4个群体108份样本的线粒体DNAD-loop高变区Ⅰ（hypervariable segment Ⅰ，HVSⅠ）进行序列分析，计算核苷酸多态度，并用Neighbor-Joining法构建群体间进化树。结果在所测定的497 bp序列中，共检测出86个变异位点，界定出82种单倍型；根据净遗传距离构建的群体间进化树显示：彝族、土家族和仡佬族紧密地聚在一起，最后与侗族聚类。结论彝族与土家族，可能因为有共同的祖先，或在历史上发生过频繁的基因交流与融合，故亲缘关系非常接近；土家族和仡佬族的亲缘关系较近，可能与地域上的相邻有关；彝族和侗族，可能由于历史起源不同以及存在地理隔离的原因，故亲缘关系最远。     

新疆出血热病毒分子流行病学研究

目的研究新疆出血热病毒(XHF)分子流行病学,揭示其与相关病毒之间关系,分析XHF的流行来源和分布特点。方法RTPCR检测20012002年XHF患者和蜱标本中XHF病毒S基因,阳性标本直接进行核苷酸序列测定。计算机软件进行S基因部分片段和S全基因序列同源性比较和S基因、M基因的种系发生树分析。结果不同年份人和蜱来源的病毒S基因部分片段核苷酸序列均显示较高同源性(97.3%～100%)。S基因进化树分析将病毒分成了欧洲、非洲和亚洲3组,其中亚洲毒株由中亚分离株和中国分离株组成,中国所有的XHF病毒S基因(同源性93.0%～99.5%)均集中在一个分枝下形成独立的一组,明显区别于世界上其他地区分离株(同源性81.40%～96.4%)。M基因进化树分析表明序列间差异不完全与病毒分离的地理区域相关。结论S基因分析显示XHF病毒蜱分离株与人分离株遗传背景接近,我国XHF病毒有共同的进化途径和基因结构特点,并具明显的地域性。     

我国6个弓形虫虫株线粒体cox1部分序列的比较分析

目的对采自我国的6个弓形虫虫株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基（cox1）基因部分序列（pcox1）进行比较分析，并与RH株的相应序列进行比较，研究弓形虫线粒体cox1基因与弓形虫的种群遗传关系。方法应用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫不同虫株的pcox1，并进行序列分析比较。结果每个虫株都获得599bp的pcox1序列，比较分析表明，弓形虫不同虫株的pcox1序列之间没有差异。结论弓形虫pcox1序列不能作为种群遗传变异研究的标记，也与弓形虫毒力无关。研究结果为进一步研究弓形虫的群体遗传结构奠定了一定的基础。     

浙江宁海卫氏并殖吸虫ITS2序列分析

为了进一步了解浙江宁海卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)的遗传变异情况,对卫氏并殖吸虫不同种群进行ITS2序列分析研究。分别自浙江宁海小汀、宁海西溪(冷风洞)和宁海余山采集浙江华溪蟹,分离卫氏并殖吸虫囊蚴并进行ITS2序列PCR扩增分析。结果表明:浙江宁海三地卫氏并殖吸虫ITS2序列有363个碱基对,肺型肺吸虫和非肺型肺吸虫的ITS2序列完全相同;与泰国种群(AF159604,NakornNayok省)核酸同源性为97.5%,两地卫氏并殖吸虫遗传变异较大。浙江宁海卫氏并殖吸虫与日本、韩国等地的卫氏并殖吸虫的核酸同源性均较高,属亚洲东北组群。     

维吾尔族妇女宫颈癌人乳头状瘤病毒感染与人类白细胞抗原Ⅰ类基因表达缺失的关系及其意义

目的 研究维吾尔族妇女宫颈癌中人乳头状瘤病毒(HPV)感染和人类白细胞抗原Ⅰ类(HLA-Ⅰ)家族基因HLA-A、B和C表达的关系,探讨HPV感染和HLA-Ⅰ类家族基因表达缺失在宫颈癌演进过程中的作用.方法 收集维吾尔族妇女宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ和宫颈鳞癌患者的新鲜组织标本共78例,提取总RNA,采用半定量RT-PCR方法鉴定HLA-A、B和C基因的mRNA表达水平.提取组织DNA,采用HPV通用引物和HPV分型芯片确定HPV亚型.结果 HLA-A、B和C基因的总体mRNA表达缺失率随着宫颈病变的加重而增加,在宫颈炎组织内为1/12,在CIN及宫颈鳞癌分别占70.0%(14/20)和84.8%(39/46),在恶性程度高的低分化癌组织中高达90.6%(29/32),并与高危型HPV16感染呈正相关(r=0.803,P＜0.01).结论 HLA-Ⅰ类基因的表达缺失是维吾尔族妇女宫颈癌发生的重要标志,而HPV16感染可能是HLA-Ⅰ分子表达缺失的前提条件.     

试验性法医DNA数据库的研究

目的 通过对大规模样本的DNA分型，探讨DNA数据库的建库指标；评估手动系统与自动系统DNA分型的兼容性；探讨DNA数据库计算机管理和需要立法解决的有关问题。方法 对1000份样本包括血液、血痕、唾液斑、精斑、混合斑，肌肉组织进行D3S1358、D9S1118、vWA、D5S818、D16539、D8S1179、CSF1PO、D20S161等8个STR基因座的DNA分型，构建8个STR基因座的人类等位基因分型标准物；PCR扩增8个STR基因座。样本PCR产物与等位基因分型标准物同步电泳，比较样本PCR产物的电泳谱带对应分型标准物所处的位置，确定样本基因型。采用Microsoft的Access编写DNA数据库计算机管理软件。结果 完成了对1000份样本D3S1358、D9S1118、vWA、D5S818、D16S539、D8S1179、CSF1PO、D20S161等8个STR基因座的DNA分型。构建了成都市试验性法医DNA数据库。结论 明确了法医DNA数据库建立的核心目的是为侦查提供犯罪嫌疑人的线索；所选择的8个STR基因座累积个人识别能力大于0.99999999,适合在成都群体中用于建立法医DNA数据库。用于DNA分型的手工电泳银染和自动激光荧光检测系统具有可重复性和兼容性，手工电泳银染更易向基层单位推广。设计的计算机管理软件允许现场生物检材DNA分型数据缺项检索；允许DNA数据库容量任意扩大，积累的经验提示法医DNA数据库建库应首先立法确定入库的对象和解决保护个人隐私问题。为建设适合中国国情的法医DNA数据库提供了一个参考模式。