金黄色葡萄球菌新型肠毒素基因构建与表达

目的 从金黄色葡萄球菌SD和104菌株中克隆肠毒素基因,以期获得新型肠毒素。方法采用已知的金葡菌肠毒素基因保守序列设计引物,以SD和104菌株基因组为模板,PCR扩增产物插入表达载体pET28a并转化大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍离子金属螯合(Ni⁺-NTA)亲和层析纯化重组蛋白,测定重组蛋白超抗原活性及体外抑瘤效果。结果 成功扩增到2个新型肠毒素P基因;带有质粒pET28a-SEP_SD和pET28a-SEP₁₀₄的重组大肠埃希菌,在1 mmol/L IPTG诱导下高效表达,重组蛋白纯度>95%;纯化蛋白刺激人淋巴细胞增殖率分别>30%;抑瘤率明显高于金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2),200 ng/mL时抑瘤效果最佳,分别达到82%和86%。结论 成功克隆到金葡菌新型肠毒素P基因,SEP_SD和SEP₁₀₄重组蛋白具有与SEC2相近的活性并有较高的抑瘤效果。     

PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素C的快速敏感PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌肠毒素C基因编码序列,设计1对PCR引物来特异性扩增靶基因片段,片段长度为600 bp,通过对1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株和5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株进行检测来评价该方法的特异性;对金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株做一系列10倍稀释后进行PCR检测,并对其进行敏感性分析,对PCR扩增产物进行电泳和测序鉴定。结果1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应呈阳性,5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应为阴性;通过基因测序证实了PCR产物的特异性;PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的检测下限为1.5×10^2cfu/ml。结论本研究建立了一个快速、特异、敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素C基因PCR检测方法。     

金黄色葡萄球菌食物中毒菌株肠毒素检测及基因分析

目的:了解一起食物中毒中分离到的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的生物学特性及其肠毒素基因检测。方法:采用VITEK-32全自动微生物鉴定/药敏分析系统对分离到的金黄色葡萄球菌菌株进行生化鉴定和药敏试验,并采用mini-VIDAS全自动荧光酶标免疫仪对菌株进行肠毒素检测,再采用PCR技术对产肠毒素的菌株进行基因分型。结果:总共分离到的19株金黄色葡萄球菌,所有分离株均对青霉素G耐药,均分泌β-内酰胺酶,肠毒素基因分型检测均为SEA与SEE。结论:19株分离株均携带肠毒素,经鉴定均为SEA与SEE肠毒素混合型,由此对食物中毒的原因有一个较圆满的解释。     

一起食物中毒金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测

目的：检测从食物中毒中分离的金黄色葡萄球菌的肠毒素基因，明确肠毒素的基因型。对所分离的金黄色葡萄球菌进行药敏试验，检测其耐药性。方法：应用PCR扩增金黄色葡萄球菌SEA—SEJ基因，电泳检测扩增结果；用VITEK32检测药敏结果。结果：检测到金黄色葡萄球菌的肠毒素基因SEG和SEI，菌株的耐药性不强。结论：金黄色葡萄球菌的肠毒索SEG和SEI可能是这起食物中毒的因子。     

一起金黄色葡萄球菌A、C肠毒素引起食物中毒的检测分析

金黄色葡萄球菌产肠毒素菌株可引起食物中毒,且以A型肠毒素引起的食物中毒为最多见。我们报告一起由金黄色葡萄球菌产生A、C二种混合型肠毒素引发的食物中毒检测结果。 1.材料与方法:标本为剩余食物(凉拌菜、三明治蛋糕、     

金黄色葡萄球菌肠毒素D产毒基因的序列分析

目的：构建金黄色葡萄球菌肠素D（SED）毒力蛋白基因重组表达质粒。方法 根据SED已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从金黄色葡萄球毒力质粒上扩增出基因片段，克隆到原核表达质粒PET32中，转化大肠埃希菌JM109感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果 PCR扩增产物大小为317bp；重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明已正确重组，测序结果与已知序列基本吻合，结论 国内首次克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素D产毒基因，为下一步研究发病机制奠定基础。     

食品中金黄色葡萄球菌污染状况及其肠毒素基因分析

目的了解南平市食品中金黄色葡萄球菌污染状况及该菌携带肠毒素的基因分型,为食源性疾病的防控提供依据。方法共采集8大类食物样品共454份,依据GB 4789.10-2010对样品进行金黄色葡萄球菌培养、分离和鉴定,用Real-time PCR法检测菌株携带肠毒素SEA-SEE情况。结果454份样品中检出金黄色葡萄球菌38株(8.4%),其中肉与肉制品和速冻米面制品的检出率13.3%,其次是餐饮食品(9.3%)、自制饮料和食用冰(8.8%)、冷冻饮品(3.3%),婴幼儿食品、乳及乳制品和膨化食品均未检出。38株金黄色葡萄球菌中,产肠毒素阳性8株(21.1%),主要携带SEA、SEB和SED。结论南平市部分食品受一定程度金黄色葡萄球菌的污染,肉与肉制品和速冻米面制品的污染情况较严重,控制生肉制品类的污染,特别应防止其交叉污染,可有效控制该菌引起食物中毒的发生,但更应重视的直接入口食品的污染。     

一起金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒

1998年6月10日20时～11日2时,驻津某军校发生一起食物中毒。经流行病学调查、临床诊断和病原学鉴定,证实为一起食用猪肉引起金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒。1　发病情况　　6月10日下午6时,该校护士大队集体用餐后2ｈ,数名学员出现不同程度的恶心、呕吐、腹痛、腹泻、全身不适等症状。22时起,患者陆续增多,至次日2时,共有210人发病,发病率60%(210/350)。其中男性9人,女性201人。经治疗,患者于6月12日全部治愈,病程10ｈ～2ｄ。2　临床症状　主要表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状。其中恶心210例(100%),呕吐1～3次150例(71.4%),4…     

金黄色葡萄球菌及其肠毒素研究进展

本文对金黄色葡萄球菌及其肠毒素的检测方法及其发展趋势进行了综述。金黄色葡萄球菌在分型方面一般不作血清学分型 ,而噬菌体分型 ,辨别力强 ,重复性好 ,在实验室里得到广泛的应用 ,但是分子生物学分型技术性强、需要特殊设备 ,所以不能普及。金黄色葡萄球菌快速检测方法的应用将大大缩短检测时间 ,而金黄色葡萄球菌肠毒素检测的应用将有利于食物中毒的快速、灵敏的诊断。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的出现 ,萌生了我们进行金黄色葡萄球菌疫苗的研究     

一起产A型肠毒素金黄色葡萄球菌引起食物中毒的分析

2005年4月，宁波市某校学生在学校小卖部就餐，发生一起食物中毒，4名学生向卫生监督部门投诉，经流行病学调查、临床症状和实验室检查，证实为一起产A型肠毒素金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，现将结果报告如下。     

压电免疫传感器检测食品中C_2型葡萄球菌肠毒素(SE)的研究

采用压电免疫（ＰＥＩ）法固化抗体制作的传感器测定抗原，浓度在１０μｇ／Ｌ～２ｍｇ／Ｌ范围内线性较好。此传感器应用于食品检测，表现出较好的特异性、选择性，不但可以检测Ｃ２型葡萄球菌肠毒素（ＳＥ），对ＳＥ还可以进行分型     

基于微孔板的人HepG2细胞体外彗星试验方法的研究

目的运用微孔板体外培养技术,建立人HepG2细胞的体外彗星试验方法,为进一步建立体外高通量筛选方法提供依据。方法选用人HepG2细胞,运用96孔板体外细胞培养技术,建立微孔板的彗星试验方法,结合中性红检测细胞毒性的方法,选择20种化合物对所建方法进行验证。结果阳性和阴性对照物用所建方法与体内试验所获结果一致,验证结果显示,8种遗传毒物在体外彗星试验中均获得阳性结果,灵敏度为100%,且当细胞的相对活力>50%时,拖尾率及尾长均与剂量呈正相关。12种非遗传毒物中,11种物质呈阴性反应,1种物质呈阳性反应,特异性为91%。结论运用微孔板体外细胞培养技术,可在1块96孔板上同时检测4~5种受试物,并在无S9的情况下能检测出直接与间接诱变剂,并可界定出引起遗传毒性的作用剂量,提高了筛选的速度,减少了受试物等的用量,具有发展成为体外高通量筛选方法的良好条件。     

First identification of Porcine Circovirus Type 2b mutant in pigs from Uruguay

Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) is a worldwide distributed virus and is considered an important emerging pathogen related to several distinct disease syndromes in pigs.PCV2 strains are classified into three genotypes: PCV2a, with five subtypes (2A–2E), PCV2b with three subtypes (1A–1C) and PCV2c, only found in Denmark.Recently, several reports suggested the circulation of newly emerging PCV2b mutants (mPCV2b) isolated from pigs with PCVAD in cases of suspected vaccine failure.In this work, we report for the first time the identification of mPCV2b in pigs from Uruguay, providing an additional evidence of a global circulation. Complete genome characterization and phylogenetic analysis reveal that Uruguayan strains, as well as mPCV2b previously reported are closely related to other sequences already classified as PCV2b-1C. Furthermore, results showed that mPCV2b presented different genetic markers in the capsid protein compared with classical PCV2a/b strains. Further investigation about antigenic shift of the mPCV2b strains including the Uruguayan isolates is needed.     

Increased serum bactericidal activity of autologous serum in C2 deficiency after vaccination against Haemophilus influenzae type b,and further support for an MBL-dependent C2 bypass mechanism

Deficiencies of C2 and other components of the classical pathway of complement are associated with increased risk of infections with encapsulated bacteria, such as Haemophilus (H.) influenzae. Defense against H. influenzae is dependent on specific antibodies and complement, which mediate serum bactericidal activity (SBA) and opsonization. Due to lack of normal classical and lectin complement pathway function in C2 deficiency (C2D), SBA would have to depend either on the alternative pathway or on C2 bypass mechanisms. Here we studied SBA against H. influenzae type b (Hib) before and after vaccination in a group of C2-deficient persons, as the bactericidal capacity of antibodies in autologous complement in relation to vaccination has not been investigated at group level in C2D.Sera from 22 persons with C2D and 26 healthy controls were available. Out of these, 18 persons with C2D and all controls had been vaccinated with Act-HIB®. SBA against Hib bacteria was analyzed with autologous serum as the only complement source. Antibodies to Hib capsular polysaccharide had been analyzed previously. Concentrations of mannose-binding lectin (MBL) and other complement components were measured in serum.SBA of both C2-deficient persons and controls was significantly more efficient after vaccination (p = 0.002 and p < 0.0001, respectively). After vaccination, all but two C2-deficient sera and one control serum showed sufficient SBA (<50% surviving bacteria). Before vaccination, SBA of C2-deficient sera was negatively correlated to serum concentrations of MBL (lower proportion of surviving bacteria with higher MBL concentration; r = ?0.55, p = 0.008). After vaccination, SBA of C2-deficient sera was negatively correlated to serum concentrations of IgG Hib antibodies (r = ?0.56, p = 0.01).In conclusion, SBA against Hib in autologous serum is increased after vaccination in persons with C2D. In unvaccinated C2-deficient persons SBA was correlated to MBL concentration, providing further support for an MBL-dependent C2 bypass mechanism operating in C2D.     

HBV阳性血清体外感染HepG-2细胞方法建立

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)阳性血清体外感染人肝癌细胞系HepG-2的方法。方法低温同步化处理HepG-2细胞后用高浓度HBV阳性血清与含有4%聚乙二醇的无血清伊格尔极限必需培养基(MEM)共孵育HepG-2细胞,设阴性对照组和空白对照组;18 h后加入含10%胎牛血清的MEM继续培养6 d,每隔24 h收集细胞和培养上清,荧光定量PCR检测HBV DNA,间接免疫荧光技术检测细胞内乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。结果 HBV阳性血清感染组HepG-2细胞内和培养上清中在感染后第1 d可检测到HBV DNA,分别为(16.04±7.99)×10³、(8.84±3.97)×10³ copies/mL,细胞内DNA含量在第2 d达到(3.51±1.86)×10⁵ copies/mL,然后逐渐下降,在第4 d降到检测下限以下,而培养上清中病毒DNA在检测的时间内逐渐升高,在第6天达到(8.41±5.34)×10⁵ cop-ies/mL;间接免疫荧光检测感染组细胞膜和胞浆中均有HBsAg表达;传代培养感染细胞后,在第1代细胞培养上清和细胞内均可检测到HBV DNA(3.58×10⁵、7.34×10⁵ copies/mL),第2代培养上清中可检测到少量HBV DNA(2.89×10³ copies/mL),但细胞内检测到HBV DNA低于检测下限(896 copies/mL),第3代细胞的上清和细胞内均未检测到HBV DNA。结论 HBV阳性血清在一定条件下可以感染HepG-2细胞,病毒能在细胞内进行短期复制。     

降血脂体外评价技术的建立

目的建立一种降血脂的体外评价的方法。方法以HepG2细胞为模型,在培养液中加入胆固醇,测定细胞内胆固醇含量和胆固醇代谢相关蛋白及基因的表达情况来评价胆固醇模型是否成功,并用阳性降胆固醇药物洛伐他汀进行验证。培养液中加入游离脂肪酸,测定细胞内甘油三酯和培养液游离脂肪酸吸收率来评价模型是否成功,并用阳性降甘油三酯药物非诺贝特进行验证。结果培养液中加入25-羟胆固醇后,细胞内胆固醇含量显著升高,HMG-CoA还原酶、SREBP-2及LDLR表达降低,表明胆固醇模型成功。阳性药洛伐他汀能够显著降低细胞内胆固醇含量,上调SREBP-2及LDLR的表达,发挥降胆固醇的功效。培养液中加入50μmol油酸6h后油酸吸收率达到40%,细胞内甘油三酯有升高趋势即表明高甘油三酯模型成功。非诺贝特能够促进游离脂肪酸的吸收并且不增加细胞内甘油三酯的含量达到降低甘油三酯的作用。结论在体外可以将HepG2细胞作为细胞模型进行降血脂功能因子的筛选。     

血清胱抑素C与2型糖尿病慢性并发症的相关性分析

目的：探讨血清胱抑素C（CysC）与2型糖尿病（T2DM）慢性并发症的相关性。方法：510例T2DM患者根据是否合并T2DM慢性并发症分为无合并糖尿病并发症的糖尿病对照组（NC组）,合并周围血管病变（PAD）组、合并肾脏病变（DN）组、合并视网膜病变（DR）组,合并周围神经病变（DPN）组,记录患者的年龄、病程、身高、体重、腰围、臀围,测定空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹胰岛素（FINS）、CysC、血肌酐（Scr）、肾小球率过滤（GFR）等相关指标,计算体重指数（BMI）、腰臀比（WHR）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）,比较各组间所测指标的差异性,并分析CysC与各指标的相关性。结果：2型糖尿病合并PAD、DN、DR以及DPN组的血清Cys C水平均高于不合并糖尿病并发症的糖尿病对照组（NC组）（P〈0.05）。结论：血清Cys C升高可作为提示糖尿病周围血管病变、肾脏病变、视网膜病变、周围周围神经病变危险性增加的参考指标,并可能是T2DM患者慢性并发症的独立危险因素。     

Increasing leucine concentration stimulates mechanistic target of rapamycin signaling and cell growth in C2C12 skeletal muscle cells

Leucine is a key amino acid for initiating translation in muscle cells, but the dose-dependent effects of leucine on intracellular signaling are poorly characterized. This study examined the effect that increasing doses of leucine would have on changes in mechanistic target of rapamycin (mTOR)–mediated signaling, rates of protein synthesis, and cell size in C2C12 cells. We hypothesized that a leucine “threshold” exists, which represents the minimum stimulus required to initiate mTOR signaling in muscle cells. Acute exposure to 1.5, 3.2, 5.0, and 16.1 mM leucine increased phosphorylation of mTOR^Ser2448 (~1.4-fold; P < .04), 4E-BP1 ^Thr37/46 (~1.9-fold; P < .001), and rpS6^Ser235/6 (~2.3-fold; P < .001). However, only p70S6k^Thr389 exhibited a dose-dependent response to leucine with all treatments higher than control (~4-fold; P < .001) and at least 5 mM higher than the 1.5-mM concentration (1.2-fold; P < .02). Rates of protein synthesis were not altered by any treatment. Seven days of exposure to 0.5, 1.5, 5.0, and 16.5 mM leucine resulted in an increase in cell size in at least 5 mM treatments (~1.6-fold, P < .001 vs control). Our findings indicate that even at low leucine concentrations, phosphorylation of proteins regulating translation initiation signaling is enhanced. The phosphorylation of p70S6k^Thr389 follows a leucine dose-response relationship, although this was not reflected by the acute protein synthetic response. Nevertheless, under the conditions of the present study, it appears that leucine concentrations of at least 5 mM are necessary to enhance cell growth.     

CysC对2型糖尿病慢性并发症的相关性分析

目的：探讨血清胱抑素C与2型糖尿病（T2DM）慢性并发症的相关性。方法：100例T2DM患者根据是否合并T2DM慢性并发症分为无合并糖尿病并发症的糖尿病对照组（NC组）,合并周围血管病变（PAD）组、合并肾脏病变（DN）组、合并视网膜病变（DR）组,合并周围神经病变（DPN）组,测定空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（Hb A1c）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹胰岛素（FINS）、血清胱抑素C并分析血清胱抑素C与各指标的相关性。结果：2型糖尿病合并PAD、DN、DR以及DPN组的血清CysC水平均高于不合并糖尿病并发症的糖尿病对照组（NC组）（P〈0.05）。结论：血清胱抑素C升高可作为提示糖尿病周围血管病变、肾脏病变、视网膜病变、周围周围神经病变危险性增加的参考指标,并可能是T2DM患者慢性并发症的独立危险因素。