分泌抗rHuIL—6McAb杂交瘤细胞系的建立及其应用研究

应用常规方法建立了４株稳定分泌抗重组人ＩＬ－６（ｒＨｕＩＬ－６）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）小鼠杂交瘤细胞系１Ｈ３、２Ａ１０、３Ａ３和４Ｂ１。其中，１Ｈ３为ＩｇＧ２ｂ（Ｋ），２Ａ１０为ＩｇＧ１（Ｋ），３Ａ３和４Ｂ１为ＩｇＧ２ａ（Ｋ）。４株ＭｃＡｂ特异性强，与细胞因子ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＳＣＦ、ＩＣＡＭ－１，以及受体菌菌体蛋白成分均无交叉反应。间接ＥＬＩＳＡ测定小鼠腹水ＭｃＡ     

TLSFJM对PMA诱导Jurkat细胞IL—2Ra链基因表达的抑制作用

本文应用原位杂交和双ＭｃＡｂ夹心ＥＬＩＳＡ方法，探讨了来自ＪＭＴ细胞白血病细胞系产生的抑制因子（ＴＬＳＦＪＭ）对ＰＭＡ诱导的Ｊｕｒｋａｔ细胞ＩＬ－２Ｒａ链基因表达的影响。结果表明：ＴＬＳＦＪＭ可明显抑制ＰＭＡ诱导的ｊｕｒｋａｔ细胞ＩＬ－２Ｒａ链ｍＲＮＡ转录，并降低膜表面ＩＬ－２Ｒａ链ｍＲＮＡ转录，并降低膜表面ＩＬ－２Ｒａ链的表达和细胞培养上清中可溶性ＩＬ－２Ｒ（ｓＩＬ－２Ｒ）水平。     

分泌抗rHuIL－6McAb杂交瘤细胞系的建立及其应用研究

应用常规方法建立了４株稳定分泌抗重组人ＩＬ－６（ｒＨｕＩＬ－６）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的小鼠杂交瘤细胞系１Ｈ３、２Ａ１０、３Ａ３和４Ｂ１。其中，１Ｈ３为ＩｇＧ２ｂ（ｋ），２Ａ１０为ＩｇＧ１（ｋ），３Ａ３和４Ｂ１为ＩｇＧ２ａ（ｋ）。４株ＭｃＡｂ特异性强，与细胞因子ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＳＣＦ、ＩＣＡＭ－１，以及受体菌菌体蛋白成分均无交叉反应。间接ＥＬＩＳＡ测定小鼠腹水ＭｃＡｂ效价为１０（－６）～１０（－８）。应用识别不同表位的ＭｃＡｂ建立了双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＩＬ－６，敏感性为１００ｐｇ／ｍｌ。初步应用表明可用于临床标本的检测。     

人白细胞介素—15cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。     

人重组IL—1受体拮抗剂在大肠杆菌的高效表达

利用ＰＣＲ技术从分裂素刺激的人外周血细胞ｃＤＮＡ文库扩增出人白细胞介素－１受体拮抗剂（ｈＩＬ－１ｒａ）的成熟分子编码区ｃＤＮＡ，将其克隆化插进高效表达的质粒载体ｐＫｐＬ－３α后，在大肠杆菌中高效表达出ｒｈＩＬ－１ｒａ，其Ｎ端序列与预期结果一致。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，ｒｈＩＬ－１ｒａ的表达量占菌体蛋白的３０％以上。体外试验证明，该表达产物对单核细胞衍生的ＩＬ－１活性有明显抑制作用。     

HBcAg/HBeAg对慢性乙型肝炎患者PBMC中Th1/Th2类细胞应答的影响

目的 探讨ＨＢｃＡｇ／ＨＢｅＡｇ对慢性乙型肝炎患者ＰＢＭＣ中Ｔｈ１／Ｔｈ２类细胞应答的影响。方法 用套式ＰＣＲ法检测６４便慢性ＨＢＶ感染者ＰＢＭＣ中ＨＶＢ ＤＮＡ;分别用ＰＨＡ、ＨＢｃＡｇ和ＨＢｅＡｇ体外培养;ＥＬＩＳＡ法检测ＰＢＭＣ产生Ｔｈ１类细胞因子（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ）和Ｔｈ２类细胞因子（ＩＬ－４、ＩＬ－１０）的含量。结果 表明ＨＢＶ ＤＮＡ阳性组和阴性组相比,无论是在ＰＨＡ还是在ＨＢｃＡ     

人单核细胞超化蛋白—1（MCP—1）基因的PCR扩增,克隆…

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣ     

HBsAg PreS1肽段的基因工程表达与分离纯化

目的 用基因工程的方法表达和纯化ＨＢｓＡｇ－ＰｒｅＳ１（１～６５）太。方法 以ＨＢＶ全基因为模板,ＰＣＲ扩增ＰｒｅＳ１（１～６５）基因,导入谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ－１,构建ｔａｃ启动子控制下的ＧＳＴ－ＰｒｅＳ１（１～６５）融合蛋白表达质粒,转化大肠杆菌ＢＬ２１宿主。结果 工程菌ＢＬ２１ ＰｒｅＳ１（１～６５）产物为可溶性蛋白,表达量约为菌体总蛋白的２０％。用ＮＢＳ－ＢＩＯＦＬ     

水稻苯丙氨酸氨解酶基因在大肠杆菌BL21DE3中的表达

目的：探索水稻苯丙氨酸氨解酶基因在大肠杆菌中的表达及其规律，为治疗苯丙酮尿症奠定基础。方法：应用基因工程技术，将潲２苯丙氨酸氨解酶的ｃＤＮＡ（ｒＰＡＬ－１－ｃＤＮＡ）重组入大肠杆菌高效表达质粒ｐＥＴ＿２８ｃ，通过异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在大肠杆菌中获得表达。结果：ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，导１、３、５、７ｈ后，表达蛋白量占菌体总蛋白分别为２１．４０％，３０．６０％，３５     

人白细胞介素15cDNA克隆及其在大肠杆菌中表达

从ＬＰＳ活化的人外周血单核细胞总ＲＮＡ中，用ＲＴＰＣＲ方法扩增出编码成熟人白细胞介素１５（ｈＩＬ１５）的ｃＤＮＡ，并将其克隆于ｐＢｌｕｅＳｋｍ质粒中，序列测定结果与预期一致。再将ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ克隆于表达载体ｐＢＶ２２０，构建了高效表达克隆ｐＢＶＩＬ１５。热诱导４ｈ，ｈＩＬ１５蛋白表达即达高峰。表达的重组蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析，分子量约１３ｋＤ，占菌体总蛋白的３３％，经包涵体提取及ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤纯化，重组蛋白纯度达９５％以上，具有显著的促鼠Ｔ淋巴母细胞增殖作用     

hIL-1Ra基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的 :克隆hIL 1Ra基因并在大肠杆菌中高效表达。方法 :从人外周血中分离白细胞并提取其总RNA。用RT PCR获得hIL 1RacDNA ,克隆入pBV2 2 0表达载体进行诱导表达。对表达产物进行复性和纯化。结果 :成功地构建了pBV2 2 0 IL 1Ra表达载体 ,并在大肠杆菌中获得高效表达 ,表达量占全菌的 4 0 %。对表达产物进行分离纯化及活性分析表明 ,获得纯度大于98%的样品。该样品具有明显抑制IL 1刺激EL 4细胞分泌IL 2的作用。结论 :在大肠杆菌中成功地表达有活性的hIL 1Ra基因 ,为进一步的开发利用奠定了实验基础。     

人可溶性TRAIL基因的克隆及表达

为了利用大肠杆菌表达人可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体 (TRAIL )蛋白 ,应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增人可溶性TRAIL蛋白cDNA ,克隆入PCR2 1 载体 ,测序验证后用基因重组法分别构建了人可溶性TRAIL蛋白的真核与原核表达质粒载体。将重组质粒分别转入COS 7和大肠杆菌M1 5中表达。用流式细胞仪检测人可溶性TRAIL蛋白在COS 7细胞中的瞬时表达 ,用SDS PAGE电泳和Westernblot鉴定大肠杆菌中的表达产物。所表达融合蛋白为人可溶性TRAIL蛋白分子 ,相对分子质量为 2 1 0 0 0 ,表达量约为 2mg/ml。所表达的人可溶性TRAIL蛋白具有诱导HL 60细胞凋亡的作用。上述结果提示大肠杆菌可良好表达具有生物活性的人可溶性TRAIL蛋白 ,为深入研究TRAIL分子在肿瘤与自身免疫性疾病中的可能应用提供了材料。     

Identification of a novel human cytokine gene in the interleukin gene cluster on chromosome 2q12-14.

Genes in the interleukin-1 (IL-1) gene cluster on human chromosome 2 play an important role in mediating inflammatory responses and are associated with numerous diseases. We have identified a novel IL-1-like gene, IL-1F10, on human chromosome 2q13-14.1 near the IL-1 receptor antagonist gene (IL-1RN). The IL1F10 gene is encoded by 5 exons spanning over 7.8 kb of genomic DNA. The 1008-bp IL-1F10 cDNA encodes a 152-amino acid protein that shares between 41% and 43% amino acid identity with human IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) and FIL-1delta, respectively. IL-1F10 shares characteristics of the IL-1Ra family, including key amino acid consensus sequences and a similar genomic structure. By multitissue first-strand cDNA PCR analysis, IL-1F10 mRNA is expressed in heart, placenta, fetal liver, spleen, thymus, and tonsil. The expression in a variety of immune tissues and similarity to IL-1Ra suggest a role of IL-1F10 in the inflammatory response.     

HAPO蛋白的可溶性表达、纯化及生物学活性测定

目的:为了得到可溶性表达的人促血液血管细胞生成素(HAPO)蛋白, 构建含HAPO基因片段的pET22b(+)表达载体, 获得纯化的HAPO蛋白并检测其生物学活性.方法:利用RT-PCR技术从人胎肝中获得HAPO cDNA片段, 并克隆至表达载体pET22b(+)中, 利用基因工程菌BL21(DE3)进行表达, 产物利用Ni2+-螯合亲和层析及SP Sepharose FF柱层析分离纯化. 采用黏附实验检测HAPO对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)黏附性的影响.结果:从人胎肝中克隆出长为897 bp HAPO目的片段, 成功构建重组质粒pET22b(+)-HAPO, 其表达的融合蛋白以可溶状态存在, 表达量占菌体总蛋白的10%, 经分离纯化融合蛋白的纯度可达80%.活性测定结果表明HAPO以剂量依赖性方式增加HUVEC的总黏附性.结论:可溶性表达了HAPO蛋白, 并用体外实验证实HAPO对造血干/祖细胞归巢有一定促进作用.     

High expression of interleukine-1 receptor antagonist in rheumatoid arthritis: Association with IL1RN*2/2 genotype

Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by inflammation and pro-inflammatory cytokines production. IL-1Ra is an anti-inflammatory cytokine codified by IL1RN gene that blocks IL-1 signalling. A VNTR polymorphism of 86?bp in IL1RN gene has been associated with RA risk and regulation of IL-1Ra expression. In this study, we determined mRNA and protein expression of IL-1Ra in RA patients and control subjects (CS). This study included 85 RA patients classified according to the ACR/EULAR 2010 criteria and 67 CS. Polymerase chain reaction was used to identify IL1RN VNTR polymorphism, the expression of sIL-1Ra (secreted isoform) mRNA was determined by SYBR Green-based real time quantitave-PCR assay, and IL-1Ra soluble levels quantification was evaluated by ELISA test. RA patients had higher soluble levels of IL-1Ra than CS (p?sIL-1Ra mRNA expression was higher in RA patients compared to CS (p?IL1RN*2/2 homozygous genotype show increased IL-1Ra soluble levels compared to IL1RN*long/long and IL1RN*2/long genotypes (p?IL1RN*2/2 genotype was 1.2 times higher compared to IL1RN*long/long genotypes in the same group. Regarding RA patients, high expression of sIL-1Ra mRNA on carriers of IL1RN*long/long genotype was observed. Nevertheless, in RA patients IL-1Ra soluble levels among genotypes did not show significant differences. High expression of IL-1Ra in RA patients under treatment or not with antirheumatic drugs was detected. Additionally, carriers of IL1RN*2/2 genotype had higher IL-1Ra expression than carriers of other genotypes.     

重组人Era蛋白的可溶性表达、纯化及生物学活性测定

目的:为了得到可溶性表达的人Era(hEra)蛋白,并检测其生物学活性.方法:把人era的cDNA基因从pUC19质粒亚克隆人表达质粒pMAL-p2x中.pMAL-hEra转化大肠杆菌TB1,用异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:pMAL-hEra载体表达的融合蛋白是以可溶状态存在,表达量占菌体总蛋白的23.9%.再利用直链淀粉亲和色谱柱对表达的融合蛋白进行纯化,接着用因子X将融合部分切除,但切除后的hEra蛋白不稳定,随着时间的延长而被降解.活性测定结果表明人Era蛋白能与GTP结合,并具有GTP酶的活性.结论:可溶性表达了人Era蛋白,并用体外实验证实人Era蛋白是一种G蛋白,这对人era基因的功能研究具有重要意义.     

hIL—16cDNA的克隆,测序及在E.coli中的表达与纯化研究

在国内首次从人的外周血单个核细胞（PBMC）中克隆了人白细胞介素—16（hIL－16）cDNA,并应用一种新型的大肠杆菌表达系统一硫氧还蛋白表达系统,成功地表达了重组hIL-16。hIL-16cDNA的扩增：从人PBMC中提取总RNA,poly（T）8-12反转录cDNA,以半巢式PCR扩增出特异的DNA片段。hIL-16cDNA的克隆、测序与表达：利用E．coli表达载体pTrxFus,构建hIL－16。DNA的重组质粒,转化E．coli后,经色氨酸诱导,表达出相对分子质量（Mr）为30000的可溶性融合蛋白,表达量占菌体蛋白的30％。序列测定证实,此片段长393bp,确为hIL-16cDNA。经一步渗透压休克,即获得了高纯度的表达蛋白。     

人活化血小板单抗SZ-51单链抗体的基因构建及高效表达

目的　为降低鼠源性抗体对人体的免疫原性并降低其分子量 ,进行了人活化血小板单克隆抗体SZ 5 1单链抗体 (ScFv)的基因构建及表达 ,希望摸索出一套稳定、高效表达SZ 5 1ScFv的方法。方法　同时构建了两种不同的SZ 5 1ScFv表达载体pHEN1 5 1ScFv及pET2 0b 5 1ScFv ,并分别导入大肠杆菌HB2 15 1及BL2 1(DE3)plys中进行表达 ,同时对它们的表达特性进行了比较。结果　pHEN1 5 1ScFv在HB2 15 1中经IPTG诱导后 ,SZ 5 1ScFv以可溶性形式分泌至细菌培养上清中。pET2 0b 5 1ScFv在BL2 1(DE3)plys中经IPTG诱导后 ,SZ 5 1ScFv以可溶性与不溶性的包涵体两种形式存在 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。经Westernblot证明两种体系表达产物均维持了亲本抗体与活化血小板特异性结合的能力。结论　pET2 0b表达体系对于SZ 5 1ScFv而言是一种稳定、高效的表达体系。但其包涵体部分的变复性条件仍需进一步探讨。     

重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定

目的构建人CD40胞外结构域（exCD40）的原核表达载体，获得可溶性产物。方法以RT-PCR方法从人白细胞总RNA中扩增编码CD40胞外区的cDNA，构建羧基端融合His6标签的exCD40的原核表达载体，在大肠杆菌中表达，并对表达产物进行复性、纯化和鉴定。结果构建了exCD40的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高表达，Mr为23000，与理论大小相符，表达产物主要存在于包涵体中，经Ni^2＋-NTA柱上复性和纯化获得纯度达95％的可溶性exCD40蛋白，该蛋白能与细胞上的CD40L结合。结论从大肠杆菌中成功获得具有配基结合活性的可溶性exCD40蛋白。