马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速、敏感、特异的双重实时荧光定量PCR方法,可同时检测马尔堡病毒和埃博拉病毒.方法 通过序列比对挑选出两种病毒基因组中高度保守的序列,分别设计引物及Taqman探针,两条探针分别标记FAM和Texas Red荧光报告基因,建立双重实时荧光定量PCR反应体系.结果 双重荧光定量PCR方法检测两种病毒阳性标准品的灵敏度分别为30.5拷贝/μl和28.6拷贝/μl,通过检测日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应,有较好的灵敏度和特异性.结论 建立了马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法,实现了两种病毒同时实时定量检测,在传染病防控领域有较好的应用前景.     

登革热病毒RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定登革热病毒（DV）及DV病毒的RNA拷贝数。方法利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对登革热病毒RNA定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果该方法检测灵敏度可达1×103copies/mL,特异性及重复性良好,对同一样品进行5次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为0.792。结论TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定登革热病毒及DVRNA载量。     

LNA探针同时检测人副流感病毒1,2,3型多重荧光定量RT-PCR方法的建立

目的 人副流感病毒1,2,3型是呼吸道感染的主要病原.本研究建立了特异、快速、灵敏的多重荧光定量RT-PCR方法用于人副流感1,2,3型病毒临床标本检测.方法 针对人副流感1,2,3型病毒设计特异性引物探针,优化荧光RT-PCR反应条件.应用体外转录方法分别制备人副流感1,2,3型病毒的标准品.验证荧光定量RT-PCR方法的特异性,敏感性和稳定性.结果 该方法对人副流感1,2,3型病毒核酸检测有高度特异性,检测的灵敏度HPIV1为10个拷贝,HPIV2为100个拷贝,HPIV3为100个拷贝.可从临床患者鼻咽吸出物标本中直接检出.结论 本研究建立的LNA探针同时检测人副流感病毒1,2,3型多重荧光定量RT-PCR方法具有较高的特异性和敏感性.适用于临床早期诊断和实验室病原谱筛查.     

阿瓦朗病毒和休斯病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的建立可以检测阿瓦朗病毒(Avalon virus,AVAV)和休斯病毒(Hughes virus,HUGV)两种内罗病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并进行初步的评价。方法收集、整理、比对、分析在公共数据库发布的两种病毒基因组核苷酸序列,确定检测靶标,设计特异性引物、探针,优化检测程序,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。利用体外转录技术制备的模拟样本、其他病毒感染标本、病毒株和正常人血标本比较评价所建方法的检测限、特异性、重复性特征。结果所建实时荧光定量RT-PCR检测方法可有效扩增检测AVAV和HUGA靶标RNA,检测限分别约为20拷贝/μl和70拷贝/μl,检测科萨努尔森林病毒、乙型流感病毒BV和BY型、甲型流感病毒H3N2、黄热病毒、乙型脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、发热伴血小板减少综合征、内罗毕羊病毒和塔西那病毒样本无非特异性扩增,两种内罗病毒相互间无交叉反应,重复性比较分析显示变异系数小于2%。结论本研究建立的检测AVAV和HUGV的实时荧光定量RT-PCR方法,可用于临床样本检测和媒介生物、宿主动物标本筛查,便于病原的快速识别和疾病诊断。     

TRIzol（或TriPure）试剂结合QIAamp Viral RNA Mini试剂盒用于血标本中病毒RNA提取的研究

目的 建立一种安全、简便、可靠的适用于血标本中有包膜RNA病毒核酸提取的方法,保证埃博拉病毒核酸筛查的实验室安全,提高标本的核酸检测效率.方法 根据已发表可完全灭活埃博拉病毒的方法,通过实时荧光逆转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）方法,比较分析QIAamp Viral RNA Mini试剂盒、TRIzol（或TriPure）试剂裂解样本并用或不用氯仿萃取后结合QIAamp Viral RNA Mini试剂盒等3种方法提取核酸的效率,优化反应步骤,建立一种安全、简便的血标本中病毒RNA提取方法.结果 血标本经TRIzol（或TriPure）试剂处理后,不经氯仿萃取,与QIAamp Viral RNA Mini试剂盒结合,提取病毒RNA,RNA提取效率优于QIAamp Viral RNA Mini试剂盒和美国CDC推荐的方法.结论 采用TRIzol（或TriPure）试剂裂解病毒,结合QIAamp Viral RNAMini试剂盒提取病毒RNA的方法简便、可靠,可用于埃博拉出血热相关标本的核酸检测.     

双重荧光定量RT—PCR在快速检测A、B型流感病毒上的应用

目的 建立双重荧光定量RT-PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒,并应用于临床样本的检测.方法 在A型流感病毒M基因和B型流感病毒HA基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化双重荧光RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于疑似流感含漱液标本检测.结果 该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性,检出限分别为0.1TCID50和0.01TCID50,具有较好的稳定性.可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测流感病毒的新方法.     

基于荧光微球的病毒性出血热IgM抗体检测方法的建立

目的 建立并初步评价多元检测引起病毒性出血热病原体特异性IgM抗体的方法.方法 在原核细胞中重组表达纯化马尔堡病毒、拉沙热病毒、裂谷热病毒、肺综合征出血热汉坦病毒、汉滩病毒、Seoul病毒及普马拉病毒核蛋白(NP),共价偶联到7种不同的xMAP荧光微球上.优化评价偶联效果,通过参比血清中相应病毒NP特异性抗体检测,评估检测方法,并与常规使用的MacELISA方法进行比较.结果 在Luminex平台的基础上建立了多元检测引起病毒性出血热的病毒核蛋白特异性抗体的方法,特异性与敏感性与常规应用的特异性抗体检测MacELISA试剂盒相当,但可以同时排查多个病毒感染情况.结论 利用Luminex xMAP技术建立基于病毒核蛋白多元检测方法快速敏感,操作简单,可以用于病毒性出血热的检测和血清流行病学调查.     

实时RT-PCR检测西尼罗病毒

目的建立西尼罗病毒快速、敏感和特异的实时RT-PCR法,用于西尼罗病毒疾病的早期诊断。方法对Vero细胞增殖的西尼罗病毒分别进行常规RT-PCR和实时RT-PCR法扩增,以PFU／ml为参考标准,比较二者的敏感性和特异性。并用实时RT-PCR法检测西尼罗病毒感染的小鼠组织标本。结果采用所建立的实时RT-PCR法和常规RT-PCR法可分别检测到0．02PFU／ml和2PFU／ml的西尼罗病毒RNA,前者的敏感性比后者高100倍。而对其他黄病毒科成员的检测均为阴性,表明该方法是特异的。采用这种实时RT-PCR法可从西尼罗病毒感染小鼠的血液、脾脏、肾脏和脑组织标本中检测出病毒核酸,且在感染后第2天最先自血液和脾脏中检测到病毒,在感染后1周的脑组织中的病毒滴度最高。结论本研究建立的实时RT-PCR法具有很高的敏感性和特异性,因此该方法可用于西尼罗病毒疾病的早期监测和流行病学研究。     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型。方法选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针。评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测。结果20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性。梯度检测的变异系数均小于5％。对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达10^3 eopies／ml。结论本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定。     

Determination of Specific Antibody Responses to the Six Species of Ebola and Marburg Viruses by Multiplexed Protein Microarrays

Infectious hemorrhagic fevers caused by the Marburg and Ebola filoviruses result in human mortality rates of up to 90%, and there are no effective vaccines or therapeutics available for clinical use. The highly infectious and lethal nature of these viruses highlights the need for reliable and sensitive diagnostic methods. We assembled a protein microarray displaying nucleoprotein (NP), virion protein 40 (VP40), and glycoprotein (GP) antigens from isolates representing the six species of filoviruses for use as a surveillance and diagnostic platform. Using the microarrays, we examined serum antibody responses of rhesus macaques vaccinated with trivalent (GP, NP, and VP40) virus-like particles (VLP) prior to infection with the Marburg virus (MARV) (i.e., Marburg marburgvirus) or the Zaire virus (ZEBOV) (i.e., Zaire ebolavirus). The microarray-based assay detected a significant increase in antigen-specific IgG resulting from immunization, while a greater level of antibody responses resulted from challenge of the vaccinated animals with ZEBOV or MARV. Further, while antibody cross-reactivities were observed among NPs and VP40s of Ebola viruses, antibody recognition of GPs was very specific. The performance of mucin-like domain fragments of GP (GP mucin) expressed in Escherichia coli was compared to that of GP ectodomains produced in eukaryotic cells. Based on results with ZEBOV and MARV proteins, antibody recognition of GP mucins that were deficient in posttranslational modifications was comparable to that of the eukaryotic cell-expressed GP ectodomains in assay performance. We conclude that the described protein microarray may translate into a sensitive assay for diagnosis and serological surveillance of infections caused by multiple species of filoviruses.     

2008-2010年广州市自然界白纹伊蚊携带登革病毒监测

目的通过对广州地区登革热媒介蚊虫白纹伊蚊携带登革病毒情况的监测,探讨传播媒介对该地区登革热流行特征的影响。方法采集广州市各区新旧疫点附近的白纹伊蚊幼虫及成蚊,提取蚊虫总RNA,用登革病毒特异引物经实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行病毒核酸检测。结果 2008年以来共检测白纹伊蚊标本658批,合计12348只,平均每批检测18.8只蚊虫,未检测出登革病毒核酸。结论广州地区白纹伊蚊自然种群携带登革病毒水平较低。     

Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses

In October and November 2010, hospitals in northern Uganda reported patients with suspected hemorrhagic fevers. Initial tests for Ebola viruses, Marburg virus, Rift Valley fever virus, and Crimean Congo hemorrhagic fever virus were negative. Unbiased PCR amplification of total RNA extracted directly from patient sera and next generation sequencing resulted in detection of yellow fever virus and generation of 98% of the virus genome sequence. This finding demonstrated the utility of next generation sequencing and a metagenomic approach to identify an etiological agent and direct the response to a disease outbreak.     

用逆转录-聚合酶链反应检测海南岛登革热流行区某些动物体内登革病毒RNA

目的寻找中国海南岛一带登革热疫区，登革病毒潜伏的动物宿主及鉴定其毒株型别。方法采用１－４型登革病毒通用引物，用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测海南岛登革热流行区蝙蝠脑细胞，血清和埃及伊蚊的登革病毒ＲＮＡ。结果检测３５例疫区蝙蝠脑细胞，２０例阳性；检测１８例蝙蝠血清，３例阳性；检测三组埃及伊蚊，１组阳性，３组非流行区者都阴性。用４个登革病毒原型株的单克隆荧光抗体技术检测２０例登革病毒ＲＮＡ阳性的蝙蝠脑细胞压印片，１６例为２型株阳性，与ＲＴ－ＰＣＲ检测登革热流行区登革病毒ＲＮＡ阳性蝙蝠脑细胞的阳性符合率为８０００％。用ＲＴ－ＰＣＲ检测非流行区蝙蝠脑细胞登革病毒ＲＮＡ，均为阴性。结论本研究证实蝙蝠是登革病毒的贮存宿主，为登革热流行的有效控制提供了一定重要的线索。     

用逆转录—聚合酶链反应检测海南岛登革热流行区？…

目的 寻找中国海南岛一带登革热疫区，登革病毒潜伏的动物宿主及鉴定其毒株型别。方法 采用１￣４型登革病毒通用引物，用塑转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测海南岛登革热流行区蝙蝠脑细胞，血清和埃及伊蚊的登革病毒ＲＮＡ。结果 检测３５例疫区蝙蝠脑细胞，２０例阳性；检测１８例蝙蝠血清，３例阳性；检测三组埃及伊蚊，１组阳性，３组非流行区者都阴性。用４个登革病毒原型株的单克隆荧光抗体技术检测２０例登革病毒Ｒ