东莞地区新生儿α-地中海贫血的PCR筛查

目的 了解东莞地区新生儿α-地中海贫血发病率。方法 利用PCR法对1378例新生儿脐血。进行α-地中海贫血的筛查。结果 1378例脐血筛查中，有36例为右侧缺失杂合子(-αα^3.7／αα)，9例为左侧缺失杂合子(-αα^4.2／αα)，发病率分别为2．61％和0．65％。结论 该法快速、准确，可作为常规方法用于临床样品的分子筛查。     

α—地中海贫血的基因检测与诊断

α－地中海贫血（α－地贫）是严重危害人类健康的遗传病,其基因背景正不断被揭示,具有遗传异质性。目前检测患及其携带的水平正确正不断提高。随着ＤＮＡ分析技术的不断发展,α－地贫的基因诊断日臻完善,本就α－地贫的基因检测检测的ｇａｐ－ＰＣＲ,Ｍ－ＰＣＲ,ＰＣＲ－ＡＳＯ,ＡＲＭＳ,ＡＣＲＳ,ＤＧＧＥ,ＲＤＢ,ＰＣＲ－ＳＳＣＰ等方法进展作一综述。     

脐血血红蛋白电泳在α-地中海贫血早期诊断中的应用

目的研究脐血血红蛋白电泳对α地中海贫血早期诊断的价值,以确定脐血血红蛋白电泳是否用于新生儿地中海贫血的筛查和诊断。方法用脐血标本进行血红蛋白电泳分析,对检出Hb Bart’s的新生儿进行地贫基因诊断。结果5120例脐血标本检出有Hb Bart’s带的标本144例,经基因诊断为α-地中海贫血的536例。结论脐血血红蛋白电泳可早期筛查和诊断新生儿仅地中海贫血,是一种简便、有效的方法。     

全自动毛细管血红蛋白电泳在地中海贫血筛查中的作用

目的探讨全自动毛细管血红蛋白电泳在地中海贫血筛查中的作用。方法对我院送检1605份患者标本应用法国Sebia毛细管电泳分析系统进行血红蛋白电泳检测地中海贫血,通过自动扫描系统分析,检测血红蛋白（Hb）各组分的含量。结果在送检的1605例标本中,应用全自动血红蛋白电泳检出α地中海贫血表型阳性181例,阳性率为11.21%;β地中海贫血表型阳性224例,阳性率为13.96%;α、β混合地中海贫血6例,阳性率0.37%;其他血红蛋白病17例,阳性率1.06%。结论全自动毛细管血红蛋白电泳电泳区带清晰,扫描定量准确,可以定量检测HbA,HbF,HbA2的含量。可以将地中海贫血初步分类为α地中海贫血或β地中海贫血,有效地筛查出高危患者,为地中海贫血的诊断提供重要依据。     

PCR技术快速检测常见缺失型α-地中海贫血-2基因

目的 建立一套设有内对照的稳定、可靠的检测缺失型α-地中海贫血-2的PCR技术,用于α-地中海贫血的分子诊断和人群筛查。方法 α-珠蛋白基因簇的高度同源性和高鸟嘌噙胞嘧啶核苷酸含量,使引物的选择和PCR扩增受到限制,对于左缺失型-α^4,2基因,在疾病基因序列测定的基础上,设计了一套全新的三引物PCR体系,用于区别正常和缺失等位基因,为检测右缺失型-α^3,7基因,则设计了四引物多套全新的三引物PCR体系,用于区别正常和缺失等位基因,为检测右缺失型-α^4.2基因和-α^3,7基因的分子诊断,正常人只有1条内对照扩增条带,而α-地中海贫血-2杂合子可见对应的2条扩增条带。结论 该体系可检测-α^3,7和-α^4,2缺失型α-地中海贫血-2基因,有望用于临床样本分子诊断稿发人群基因筛查。     

广西柳州地区新生儿α-地中海贫血筛查分析

目的调查柳州地区新生儿α-地中海贫血的携带率及探讨对新生儿α-地中海贫血筛查的必要性。方法采用美国Helena公司SPIFE快速自动电泳分析系统对2009年1月-2009年10月共7815份新生儿脐血标本进行血红蛋白电泳,并对Hb区带进行扫描定量分析。结果调查的7815例标本中,检出Hb Bart′s阳性率为10.9%,其中为静止型α-地中海贫血459例检出率为5.9%、标准型α-地中海贫血378例检出率为4.8%,中间型(Hb H病)20例检出率为0.25%。结论在地中海贫血高发地区宜将Hb电泳作为常规筛查方法,普遍开展新生儿脐血血红蛋白病筛查所具有早期诊断和科学价值。     

应用不同方法在婚检中开展地中海贫血筛查及诊断的研究

目的　探讨平均红细胞体积测定法 (MCV法 )、红细胞脆性一管定量法 (一管法 )及血红蛋白电泳法对地中海贫血诊断的准确性。方法　对 2 2 88例接受婚前医学检查的欲婚男女用MCV法、一管法进行地中海贫血筛查 ,对筛查阳性者应用血红蛋白电泳法进行地中海贫血测定 ,并对 173例血红蛋白电泳测定HbA2 <2 .5 %→a -地贫基因分析 ,HbA2 >3.5 %→β-地贫基因分析进行确诊对照。结果　 1、MCV法及一管法同时阳性 (串联试验 ) ,地中海贫血检出率为 10 .75 % ,经PCR检测结果表明 ,串联试验阳性检出符合率达 86 .0 7%。 2、173例血红蛋白电泳测定与应用聚合酶链反应及向点杂交技术检测对照 ,有 117例确诊为地中海贫血 ,灵敏度为 99.15 % ,假阴性率为 0 .86 % ,阳性符合率为 84 .97%。     

重庆地区地中海贫血的产前筛查结果报告

目的探讨地中海贫血在产前检查中的发病率,并指导优生优育。方法应用法国Sebia公司HYDRASYS全自动电泳分析系统及自动扫描系统检测地中海贫血。结果 2000例标本筛查出α和β地贫表型阳性122例,其它血红蛋白病2例。α地贫表型阳性76例,阳性率3.8%;β地贫表型阳性46例,阳性率2.3%。结论地中海贫血的发病率高,在产前检查中进行地中海贫血的筛查,为进一步进行基因诊断和遗传咨询提供基础,以防止重度新生儿地贫的出生,对优生优育和提高人口素质具有重要意义。     

应用脐带血电泳筛查新生儿α-地中海贫血

目的应用脐带血血红蛋白(Hb)电泳筛查新生儿α-地中海贫血(简称α-地贫),为玉林市α-地贫的防治提供依据。方法采用全自动电泳仪对2684名新生儿脐带血进行血红蛋白(Hb)电泳,电泳后对Hb区带进行扫描定量分析,根据巴特血红蛋白(HbBart's)含量判定α-地贫类型,并将筛查阳性的病例进行基因诊断。结果 2684份脐带血中,HbBart's含量≥1%者265例,筛查阳性率为9.87%,其中HbBart's含量在1%～3%者为61例,在3～20%者197例,在20%～40%者5例,80%者2例。根据巴特血红蛋白(HbBart's)含量推算出静止型α-地贫,标准型α-地贫,HbH病,巴氏胎儿水肿综合征的携带率分别为2.27%、7.34%、0.19%、和0.07%。除2例巴氏胎儿水肿综合征外,经基因分析诊断为α地贫的有249例。结论应用脐带血血红蛋白电泳筛查新生儿α-地中海贫血方便、快捷、有效,对指导优生优育,提高出生人口质素质有重要意义,可作为新生儿α-地贫的常规筛查方法 。     

用SYBR-Green Ⅰ实时荧光PCR结合融解曲线分析法诊断α-地中海贫血

目的建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α-地中海贫血基因型的技术。方法应用SYBR-Green1进行两个实时荧光聚合酶链反应(real-time fluorescence polymerase chain reaction with SYBR-Green1,SYBR-PCR),检测左缺(-α4.2)、右缺(-α3.7)等位基因,同时进行融解曲线(dissociation curve,DC)和Tm(melting temperature)值分析。PCR产物重组到pCR2.1,重组子梯度稀释作为模板检测灵敏度,确定两种等位基因型(-α4.2,-α3.7)的检测下限,并对110份DNA样品进行检测。结果检测-α4.2和-α3.7的PCR产物长度分别为1.65kb、1.9kb,Tm分别为(81.5±0.5)℃、(82.5±0.5)℃,检测下限分别为9×102个拷贝、4.3×102个拷贝。该检测技术的灵敏度较常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高10倍。结论SYBR-Green1实时荧光PCR结合融解曲线分析及Tm分析可以灵敏、准确地检测-α4.2、-α3.7、αα(包括αTα)及--SEA4种等位基因,从而为各种缺失型α-地中海贫血做出基因诊断。该技术具有自动化程度高,不需荧光标记探针,成本低,易质控,防污染,高通量等优点,适于临床推广应用。     

实时荧光定量PCR检测儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒

目的 建立并应用检测儿童下呼吸道感染WU多瘤病毒(WU polyomavirus)的实时荧光定量PCR( real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)方法.方法 选择WU多瘤病毒的VP2基因作为检测的目标基因,设计FQ-PCR引物和检测探针,以重组质粒为标准品建立标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价;应用该方法对温州医学院附属温岭医院收集的临床下呼吸道感染患儿的痰液、咽拭子846份及血清标本846份进行定量检测.结果 本研究建立FQ-PCR检测方法,质粒标准曲线的方差系数为0.998,灵敏度可达到50拷贝;应用该方法检测700份痰液标本,检测到7例阳性标本,146份咽试子标本中未检测到阳性标本,总阳性率为1.00％ (7/700),846份血清标本未检测到阳性标本.结论 本研究建立的FQ-PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒进行定量检测;痰液标本较咽拭子或血清标本更适用于WU多瘤病毒感染的核酸检测.     

双重实时荧光定量PCR法鉴定克柔念珠菌和光滑念珠菌

目的 建立一种快速、灵敏、特异的鉴定克柔念珠菌和光滑念珠菌的双重实时荧光定量PCR方法.方法 以核糖体基因内转录间隔区Ⅱ(ITSⅡ)为靶目标,设计并合成分别针对克柔念珠菌、光滑念珠菌的种特异引物和探针.建立双重实时荧光定量PCR反应体系,并用该体系对呼吸道相关致病菌进行检测.鉴定结果与临床常规鉴定方法对照,评价其敏感度、特异度及重复性.结果 通过对100例样品的检测,结果显示该双重实时荧光定量PCR法检测标本的鉴定结果与常规鉴定方法的结果对照,特异度为100%,敏感度为100%;最小能检测到10个拷贝数的重组质粒;批内重复实验和批间重复实验结果均与常规鉴定方法结果相符.结论 双重荧光定量PCR法鉴定克柔念珠菌和光滑念珠菌,特异度和敏感度高,重复性好,且快速、简便,该方法将有助于念珠菌病的早期诊断和针对性治疗.     

实时定量PCR检测HBV核酸载量测量不确定度的构成分析

 目的 研究实时荧光定量PCR用于乙型肝炎病毒（HBV）核酸载量检测时的测量不确定度构成。 方法 采用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清标本中HBV核酸载量，收集检测过程中的各类数据，计算以下6种来源的测量不确定度，对该方法的测量不确定度构成进行评估。⑴标本浓缩的不确定度（uenrich）；⑵核酸提取的不确定度（uex）；⑶扩增反应体系的不确定度（upcr）；⑷热循环仪的不确定度（uins）；⑸数据处理的不确定度（uana）；⑹加样枪的不确定度（upip）。其中热循环仪的不确定度检测样本数为7份，其他各种不确定度检测的样本数为10份。 结果 核酸浓度为5.610E+07拷贝/ml的标本，其浓缩过程来源的相对不确定度达0.437；核酸提取来源的浓度真值无偏估计在6.585E+03、9.067E+04、7.223E+06拷贝/ml样本的相对不确定度分别为0.249、0.173、0.140；热循环仪和数据分析来源的相对不确定度分别为0.020和不大于0.050。 结论 标本制备过程中的浓缩和DNA提取步骤所带来的不确定度是实时荧光定量PCR检测HBV核酸载量测量不确定度的主要分量，因此标本制备处理的方法与标准操作程序能否有效地提取核酸并去除PCR反应的抑制物对于该项检测十分关键；起始模板浓度与测量不确定度相关，低浓度的样本显示出更大的相对不确定度。     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶（1×10-1～1×10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。     

狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立和阳性对照的制备

目的 建立狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法,制备狂犬病病毒(rabies virus,RV)的假病毒颗粒阳性对照.方法 在RV的N基因保守区设计引物和探针,建立反转录实时荧光定量PCR检测方法,克隆得到噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因(MS2),将其重组到质粒pET-28b(+)中,再将RV的N基因片段重组到MS2下游,经原核表达得到RV假病毒颗粒.结果 实时荧光定量PCR检测RV重组质粒最低检测限为15拷贝/μl,重组表达质粒经原核表达可形成耐RNase的RV病毒样颗粒.结论 建立了反转录实时荧光定量PCR检测RV核酸的方法,成功构建了可耐受RNase且无传染性的RV阳性对照.     

聚合酶链反应检测致瘤性人类疱疹病毒6型方法的建立及应用

目的　建立致瘤性人类疱疹病毒 6型 (HHV 6 )荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测方法 ,为快速、准确地定量检测HHV 6奠定基础。方法　根据HHV 6型基因序列 ,设计并合成引物、荧光标记探针。先用特异性引物筛选HHV 6 ,其PCR片段克隆入载体 ,再对重组质粒进行筛选、测序及鉴定。确证后的HHV 6DNA片段制成标准品并作为阳性模板 ,开发HHV 6FQ PCR检测系统。用该系统测定研究样品。结果　重组质粒获得的HHV 6DNA产物经 1∶10梯度稀释后 ,制作定量曲线的循环阈值 (Ct)与模板浓度具有良好的线性关系 ,相关系数为 0 99。经本反应系统检测的临床标本共135份 ,检测到 16份HHV 6DNA阳性。结论　建立了检测致瘤性HHV 6的FQ-PCR方法 ;此方法较定性PCR技术更为简便、快速、准确 ,且具有很好的应用前景和推广价值     

即时荧光定量PCR微卫星分析技术检测少突胶质细胞肿瘤染色体1p/19q杂合性缺失

目的研究少突胶质细胞肿瘤染色体1p／19q杂合性缺失（LOH）情况。方法采用即时荧光定量PCR微卫星分析技术对28例少突胶质细胞肿瘤进行染色体1p／19qLOH检测。结果28例少突胶质细胞肿瘤染色体中有24例（85．7％）发生1pLOH;有18例（64．3％）发生19qLOH;有17例（60．7％）发生1p／19q联合性LOH;25例有1P或19qLOH。结论即时荧光定量PCR微卫星分析技术特异性高、方便快捷,可以用于石蜡包埋组织标本染色体杂合性缺失的检测。大多数少突胶质细胞肿瘤发生了1p／19qLOH。     

荧光定量PCR检测沙眼衣原体及临床应用

目的：用荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）检测沙眼衣原体的含量,探讨FQ－PCR在衣原体性尿道炎诊断中的价值。方法：应用荧光探针标记引物的荧光定量聚合酶链反应对172例疑为沙眼衣原体感染患者标本进行检测,并与常规PCR（电泳－EB染色）进行比较。结果：FQ－PCR阳性率为19．8％,常规PCR法为20．9％,两法符合率为63．9％。女性宫颈分泌物标本FQ－PCR阳性为29．2％,常规PCR法为16．7％;男性分泌物FQ－PCR阳性率为16．9％,常规PCR法为13．8％。FQ－PCR特异性较常规PCR法高。结论;FQ－PCR在扩增中实时在线检测,并选择理想的标准曲线做出较精确的临值分析,具有较高的特异性和敏感性,对病原体的诊断有一定的临床意义。     

双重荧光定量RT—PCR在快速检测A、B型流感病毒上的应用

目的 建立双重荧光定量RT-PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒,并应用于临床样本的检测.方法 在A型流感病毒M基因和B型流感病毒HA基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化双重荧光RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于疑似流感含漱液标本检测.结果 该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性,检出限分别为0.1TCID50和0.01TCID50,具有较好的稳定性.可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测流感病毒的新方法.     

荧光定量聚合酶链反应检测HBV-DNA的意义

目的　研究HBV DNA与HBV M、乙型肝炎临床类型的相关性 (意义 )。方法　用荧光定量聚合酶联反应 (FQ PCR)检测 10 5例乙型肝炎患者HBV DNA含量 ,分析其在乙型肝炎 5项指标(HBV M)中的检出率 ,在乙型肝炎不同类型中的分布。结果　HBV DNA与HBV M对比 ,HBsAg( )、HBeAg( )、HBcAb( )患者的检出率为 97% ,HBsAg( )、HBeAb( )、HBcAb( )患者的检出率为75 % ,HBsAg( )、HBcAb( )患者的检出率为 6 0 % ,HBsAg( )患者的检出率为 4 0 % ,HBsAb( )、HBeAb( )、HBcAb( )的 (或HBsAb阳性、HBcAb阳性 )病例未检测到HBV DNA。表明HBV DNA与HBV M的抗原呈正相关 ,组间差异有非常显著意义 (P <0 0 5 )。急性乙型肝炎血清HBV DNA检出率为 72 2 % ,慢性乙型肝炎检出率为 75 % ,肝硬化检出率为 70 %。血清HBV DNA与乙型肝炎不同临床类型差异无显著意义 (P >0 0 5 )。结论　HBV DNA的复制状态与不同乙型肝炎临床类型无明显相关性。与乙型肝炎抗原呈正相关。