人SUMO-2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体.方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a( )原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性.结果:测序证实重组质粒pET41a( )-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52 000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性.结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具.     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

Autotaxin多克隆抗体的制备

目的:表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的Autotaxin(58-157位氨基酸)融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotax-in的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58-157)-His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET-21 c-Autotaxin(58-157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位

目的:构建钙整合素结合蛋白(calcium-and intesrin-binding protein,CIB)的原核表达载体,制备小鼠抗人CIB的多克隆抗体并探讨其亚细胞定位.方法:采用RT-PCR方法从人脑组织扩增CIB的cDNA片段,利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32a-CIB,转入BL21(DE3)中,以IPTG诱导BL21(DE3)表达CIB融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白CIB的表达.用含CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为抗原免疫小鼠制备抗血清,抗血清分别经Protein G、抗原亲和层析后用Western blot及免疫组化方法进行鉴定.结果:通过重组表达获得CIB抗原蛋白,免疫小鼠并纯化抗血清得到特异性的抗CIB抗体,该抗体能检测细胞内源性CIB蛋白的表达;同时免疫组化结果显示:CIB在SHG44、Hhu7细胞株中主要定位于细胞质.结论:成功克隆CIB基因并制备了特异性的小鼠抗人的CIB多克隆抗体,对进一步研究CIB的功能奠定了基础.     

果蝇jumeaux蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的原核表达及纯化重组果蝇jumeaux(jumu)蛋白,制备大鼠抗果蝇jumu多克隆抗体。方法用RT-PCR方法扩增jumu基因,并将其克隆到原核表达载体pRSETA中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导His-jumu融合蛋白的表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot方法鉴定基因片段的正确性及蛋白表达的特异性后,用Ni-NTA亲和层析柱纯化带有6×His标签的融合蛋白,用纯化后的蛋白免疫SD大鼠制备多克隆抗体。以Western blot、免疫荧光染色法鉴定抗体的特异性,并用制备的抗体检测jumu在果蝇不同器官中的表达情况。结果成功构建了pRSETA-jumu原核表达质粒,jumu融合蛋白在大肠杆菌内高表达并纯化,免疫SD大鼠得到抗jumu多克隆抗体。用Western blot和免疫荧光染色检测发现制备的抗体有较强的特异性,并能检测内源性蛋白。通过免疫荧光染色发现jumu的表达存在组织特异性,且在唾液腺中的表达量最高。结论成功获得了抗jumu蛋白的特异性抗体,为进一步研究jumu蛋白的功能和作用机制奠定了基础。     

基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，并表达与纯化融合蛋白，制备其多克隆抗体。方法：通过PCR扩增Myo5a末端一个基因小片段，Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到原核载体pGEX-4T-3，制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a。鉴定后，在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化，重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定。采用融合蛋白免疫家兔，制备其抗血清，测定抗血清效价和特异性。结果：经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功，表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD。免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000，免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性。结论：实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体，融合蛋白具备了较高的免疫反应性，并得到了其多克隆抗体，为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫。     

兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定.方法:构建pGEX-4T1 -g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶( GyST) -g-Hoxc 10蛋白.用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清.用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性.结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1 -g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清.Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性.结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂.     

兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定。方法:构建pGEX-4T1-g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-g-Hoxc10蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清。用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性。结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1-g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清。Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性。结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂。     

重组Rab8截短体蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

目的 获得Rab8纯化蛋白,制备多克隆抗体,为深入研究Rab8在病毒感染宿主细胞过程中的作用奠定基础.方法 首先从HepG2细胞中克隆Rab基因,然后从Rab8质粒中亚克隆Rab8 C端编码122个氨基酸的基因片段,构建Rab8与6His的融合蛋白原核表达质粒.原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备Rab8多克隆抗体.采用ELISA法检测其效价.Western检验抗体特异性,间接免疫荧光染色法验证其免疫组化特性.结果 克隆了人Rab8编码基因,构建了表达Rab8 C端编码122个氨基酸的原核表达质粒pQE31-Rab8-122,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子量约15 000的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠后收获抗血清.ELISA显示抗体效价达1/20 000.Western blot和免疫荧光染色结果显示此多克隆抗体能够与原核表达的Rab8蛋白发生特异性反应,并能够识别HepG2细胞中内源性Rab8蛋白.结论 本研究获得原核表达的Rab8纯化蛋白,成功的制备了Rab8多克隆抗体,为进一步研究Rab8参与病毒感染宿主细胞提供了重要的实验材料.     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

利用原代培养神经元研究Netrin-4的受体定位

 目的 利用体外原代培养神经元，研究神经突起诱向因子Netrin-4的受体，分析Netrin-1已知受体DCC和UNC5H1作为Netrin-4受体的可能性。方法 改良Koh法培养出生12h内Wistar乳鼠神经元，免疫细胞化学鉴定纯度；以碱性磷酸酶(AP)标记的Netrin-4为配体，以神经元及转染DCC和UNC5H1的COS7细胞为对象，亲和细胞化学法检测Netrin-4的受体；RT-PCR法分析神经元中Netrin-4、DCC和UNC5H1的表达。结果 成熟神经元胞核大、突起长，交织成网；以抗神经丝蛋白（NF）抗体行免疫细胞化学鉴定，纯度较高；转染DCC和UNC5H1的COS7能与AP4-Netrin-4结合，定位在细胞膜上。 结论 建立起稳定的原代神经元培养法，并研究神经突起诱向因子受体的定位。DCC和UNC5H1可能是Netrin-1与Netrin-4的共受体。     

人CPNE5多克隆抗体的制备

制备人CPNE5的多克隆抗体.将CPNE5基因中423bp(626-1048bp)的片段构建到原核表达载体pGEX-5X-1,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达蛋白,经SDS-PAGE分离纯化得到抗原肽段,质谱法鉴定后常规免疫家兔.用CL-4B柱纯化抗体.结果显示,成功表达并纯化了人CPNE5抗原肽段...     

人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建新基因CTRP4的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化rhCTRP4-his蛋白,制备和鉴定小鼠抗人CTRP4多克隆抗体,为进一步研究人类新基因CTRP4的生物学功能奠定基础。方法:从pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组载体中通过PCR的方法扩增CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段,将得到的片段双酶切定向插入pET-32a中,构建原核表达载体pET-32a-hCTRP4。构建好的质粒在E.coli BL21(DE3)中进行诱导、表达,通过镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。将pcDNA3.1-myc/his(-)B-hCTRP4重组质粒和纯化好的融合蛋白依次免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。并对抗体进行纯化、效价测定以及特异性鉴定。结果:DNA测序证实构建的pET-32a-hCTRP4重组表达载体含有hCTRP4编码序列,其序列比对分析与GenBank中公布序列一致,质粒在E.coli中表达相对分子质量(Mr)为35 000的目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯度为95%以上。ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,Westernblot、免疫荧光细胞化学和免疫组化分析显示抗体能特异性识别重组hCTRP4以及天然状态hCTRP4蛋白。结论:成功构建了hCTRP4蛋白的原核表达载体,并获得较高纯度的融合蛋白,制备了高效价、高特异性的多克隆抗体。     

CMTM1-v17/CKLFSF1-v17多克隆抗体的制备、亲合纯化与鉴定

目的：CMTM1-v17是我室克隆的人类新基因，为进一步研究CMTM1-v17的功能，需制备高纯度的CMTM1-v17的抗体。方法：根据生物信息学分析的结果，用PCR法扩增人CMTM1-v17分子C端的cDNA片段（编码118～149位氨基酸），亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-2上。将重组质粒pGST-CMTM1-v17导入大肠杆菌BL21，诱导表达GST-CMTM1-v17 C端融合蛋白，经GST亲合层析、凝血酶切割后获得CMTM1-v17 C蛋白作为抗原免疫家兔制备抗血清。抗血清经抗原亲合层析后用Western blot和免疫组化方法进行鉴定。结果：通过重组表达获得抗原蛋白，免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗CMTM1-v17抗体，该抗体能检测到CMTM1-v17超表达和细胞内源性的蛋白。结论：成功制备了抗CMTM1-v17的多克隆抗体，对进一步研究CMTM1-v17的功能提供了一个有用的工具。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

GST-GP302融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备

目的 :在大肠杆菌中表达血小板糖蛋白GPIbα之vWF结合区(GP30 2 )与谷胱甘肽S 转移酶GST的融合蛋白并制备其抗血清。方法 :将GP30 2片断插入GST融合表达载体 pGEX 4T 1,重组载体酶切鉴定后 ,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST GP30 2融合蛋白 ,SDS PAGE分析表达产物。包涵体经变性复性后免疫新西兰白兔 ,制备抗血清 ,ELISA、Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果 :重组质粒酶切鉴定表明 ,GP30 2基因已正确插入到 pGEX 4T 1中 ,经IPTG诱导后 ,表达出相对分子质量 (Mr)约为 5 90 0 0的融合蛋白 ,获得了ELISA效价为 1× 10 -5的多克隆抗体。Westernblot证明所制备的多抗可以与血小板糖蛋白特异性结合。结论 :GP30 2片断在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体 ,为检测血小板糖蛋白GPIbα及其在其他体系中的表达提供了一种检测途径     

小鼠白细胞介素5融合蛋白在大肠杆菌的表达

将质粒ｐＢＶ－ｍＩＬ－５的小鼠白细胞介素５（ｍＩＬ－５）的ｃＤＮＡ插入表达载体ｐＥＸ３１ｂ，转化大肠杆菌ＲＲＩ，经热诱导获得高效表达，表达的重组蛋白占菌体总蛋白的４０％。该融合蛋白由大肠杆菌ＭＳ２聚合酶的９９个氨基酸和ｍＩＬ－５的１１３个氨基酸组成，在菌体中以包涵体的形式存在，用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、尿素洗涤包涵体，初步纯化的重组蛋白纯度达９０％，已用于制备抗ｍＩＬ－５的单克隆抗体。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ证实ｍＩＬ－５重组蛋白能与抗ｍＩＬ－５多克隆ＩｇＧ特异结合。     

FILIP-1L 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的： 表达、纯化GST-FILIP-1L融合蛋白,制备FILIP-1L多克隆抗体。方法：pGEX-4T3-FILIP-1L重组质粒转化E-coliBL21大肠杆菌,IPTG诱导GST-FILIP-1L融合蛋白表达,Glutathion Sepharse 4B纯化GST-FILIP-1L融合蛋白。将纯化的GST-FILIP-1L融合蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备FILIP-1L多克隆抗体,用ELISA方法检测多克隆抗体效价,Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白、细胞转染FILIP-1L蛋白及细胞FILIP-1L蛋白的结合能力。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的FILIP-1L融合蛋白,经Glutathion Sepharse 4B纯化后免疫新西兰大耳白兔,获得了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,亲和层析获得纯度较高的多克隆抗体,WB检测显示多克隆抗体能够与FILIP-1L蛋白、293细胞转染FILIP-1L蛋白及肝癌细胞FILIP-1L蛋白结合。结论：成功表达、纯化了GST-FILIP-1L融合蛋白,制备了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,为研究FILIP-1L蛋白生物学功能提供了有用的实验工具。     

Preparation and characterization of the polyclonal antibody against pig integrin beta6 subunit LBD as FMDV receptor

AIM: To induce the expression of FMDV receptor integrin beta6 subunit ligand-binding domain in E.coli and prepare the rabbit polyclonal antibody against it. METHODS: The fragment coding beta6 ligand-binding domain was amplified by PCR and doubly digested with BamH Iand Xho I. Then it was cloned into expression vector pGEX-4T-1 to obtain recombinant plasmid pGEX-4T-1-beta6LBD. After pGEX-4T-1-beta6LBD was transformed into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG, the expression of fusion proteins was identified by SDS-PAGE, with inclusion body prepared and fusion protein purified. Then new Zealand rabbits were immunized to prepare polyclonal antibody against beta6LBD. GST-beta6LBD antiserum was obtained and the specificity of polyclonal antibody was detected by Western blot. RESULTS: SDS-PAGE demonstrated that the fusion protein GST-beta6LBD was expressed with the expected molecular weight at 42 000. A single clear band of GST-beta6LBD fusion protein appeared in SDS-PAGE gel after purification. The titer of the polyclonal antibody was above 1:12 800 and it is of high specificity. CONCLUSION: The successful preparation of rabbit anti pig beta6LBD polyclonal antibody with high affinity and specificity will lay a foundation for further research into the function of integrin beta6 in FMDV infection.