表达人膜辅助因子蛋白基因的猪内皮细胞可抑制人血清补体的细胞毒作用

目的研究转染人膜辅助因子蛋白基因的猪内皮细胞抗补体的细胞毒作用。方法从人胎盘组织提取总ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增得到人膜辅助因子蛋白（ｈＭＣＰ）基因全长ｃＤＮＡ,将其克隆到带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）ＩＥ启动子的ｐＣＩ－ｎｅｏ哺乳动物表达载体和以ｐＣＩ－ｎｅｏ为基础构建成的带有人ＥＦ－１α启动子的ｐＥＦ－ｎｅｏ哺乳动物表达载体上,得到质粒ｐＣＩＭ和ｐＥＦＭ。利用电穿孔基因转移方法分别转染猪内皮细胞（ＰＥＣ）,以Ｇ４１８筛选稳定表达克隆。用正常人血清处理此转基因细胞来检测其抗补体作用。结果Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明,在ＥＦ－１α启动子引导下的ｈＭＣＰ基因得到了高效表达。死细胞计数和ＬＤＨ释放实验结果表明,表达ｈＭＣＰ基因的ＰＥＣ可有效抑制人血清补体对其的裂解作用（Ｐ＜０．０１）。结论克隆的ｈＭＣＰ基因在ＥＦ－１α启动子引导下于ＰＥＣ可高效表达,且使ＰＥＣ能够抗人补体的细胞毒作用。     

人热休克蛋白70基因的原核表达

目的 表达人热休克蛋白70（HSP70）并进行鉴定。方法 用PCR方法扩增人HSP70基因片段，经T-A克隆法克隆到载体pUCm-T中，并进行DNA测序，将人HSP70基因片段从载体pUCm-T中酶切后，构建重组表达载体pGEX-4T-1-HSP70，并转化大肠杆菌JM109，用IPTG诱导，收集细菌，菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 人HSP70基因的PCR产物约为1.9kb。序列测定结果证实，所获目的序列与文献[3]报道的相一致，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定证实。人HSP70基因已成功地克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建的表达载体pGEX-4T-1-HSP70，能很好地在大肠杆菌中表达相对分子质量（Mr)为96000并具有抗原特性的融合蛋白，结论 成功地克隆并表达了HSP70基因，为研究HSP70的结构。功能与临床应用提供了必要条件。     

A20基因在血管内皮细胞的表达研究

目的：探讨外源性A20基因在内皮细胞获得稳定表达的可行性。方法：将N－末端标记E－tag的HA20 cDNA重组于pCAGGS真核表达载体，构建了pCAGGSEHA20真核表达重组体，构建了pCAGGSEHA20真核表达重组体。DOTAP脂质体介导的pCAGGSEHA20和pMAMneo基因转染，经G418筛选阳性克隆，再用免疫荧光及分子原位杂交检测A20基因的表达。结果：成功构建了pCAGGSEHA20真核表达重组体，A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到有效表达。结论：在DOTAP脂质体介导下，A20基因能够导入内皮细胞并在其内获得表达。     

人VEGF165基因真核表达质粒的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响

目的 :构建人VEGF16 5基因的真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5 ,观察其在血管内皮细胞 (VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响。方法 :用RT PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF16 5基因 ,并将其克隆至真核表达质粒pBud CE4 .1中 ,对重组真核表达质粒pBudCE4 .1/VEGF16 5进行酶切鉴定和测序。以脂质体转染法将pBudCE4 .1/VEGF16 5导入VEC中 ,用Northernblot和免疫细胞化学染色法 ,分别从mR NA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达 ,并检测表达产物对VEC增殖的影响。结果 :人VEGF16 5基因的RT PCR产物为 5 76bp。测序结果显示 ,扩增的VEGF16 5基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致。经HindⅢ和BamHI酶切鉴定证实 ,VEGF16 5基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4 .1中。以其转染血管内皮细胞 (VEC)后 ,经Northernblot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF16 5基因表达。表达产物对VEC增殖有明显的促进作用。结论 :所构建的pBudCE4 .1/VEGF16 5真核表达质粒可在VEC中表达 ,表达产物可明显促进VEC增殖 ,为通过VEGF16 5基因转染防治移植器官内血管的狭窄奠定了基础     

人脐静脉内皮细胞清除补体攻膜复合物的机制

目的：探讨内皮细胞清除补体攻膜复合物（MAC）的途径及其清除动力学，方法：原代培养的人脐静脉内皮细胞以RH414荧光标记质膜双层，0℃组装亚溶剂量的MAC，37℃复苏后，LSCM实时监MAC沉积诱导的质膜囊泡化形成和胞吞，胞吐情况,流式细胞仪定量检测内皮细胞表面MAC抗原的清除情况，结果：MAC沉积后，内皮细胞有的质膜囊泡化形成，囊泡以胞吞和胞吐2种方式离开细胞，并以前者占优，37度条件下，内皮细胞清除表面MAC的半衰期约为5min。结论：内皮细胞可通过胞吞和胞吐2种机制清除细胞表面沉积的MAC，并以胞吞方式为主。     

新型人肿瘤坏死因子基因在血管内皮细胞中的靶向表达

目的 探索一条肿瘤特异性基因治疗的新途径。方法 将新型人ＴＮＦ－αＤ１１ａ基因和ＫＤＲ特异性启动子插入到３’ＬＴＲ缺失２９９ｂｐ的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中,构建成ｐＬＸＳＮ－Ｄ２９９－ＫＤＲｐ－ＴＮＦ－α－Ｄ１１ａ重组逆转录病毒载体,使目的基因转录受ＫＤＲ启动子驱动。通过脂质体介导将该重组载体转染ＰＡ３１７包装细胞,并用病毒上清感染血管内皮细胞和ＮＩＨ３Ｔ３细胞。分别经ＥＬＩＳＡ和ＭＴＴ法测定ＴＮＦ－αＤ１１ａ在血管内皮细胞中的表达及其生物学活性。结果 成功构建了携带ＴＮＦ－αＤ１１ａ和ＫＤＲ启动子的逆转录病毒载体,ＴＮＦ－αＤ１１ａ在血管内皮细胞中的表达水平及细胞增殖抑制作用均高于ＮＩＨ３Ｔ３细胞。结论 ＫＤＲ启动子可使外源ＴＮＦ－αＤ１１ａ在血管内皮细胞中特异性表达。     

血管内皮细胞黏附分子胞外区基因真核表达载体构建及表达

目的构建并表达血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1)胞外区基因真核表达载体。方法从小鼠NIH/3T3细胞提取总RNA,以其为模板通过RT-PCR扩增VCAM-1胞外区(D1-D4结构域)cDNA。利用PCR获得VCAM-1胞外区基因,连接pMD19-T载体,进行基因序列测序。将VCAM-1 D1-D4目的片段插入到真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc中,构建重组真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1。经双酶切鉴定VCAM-1胞外区基因真核表达载体构建的成功与否。利用脂质体把pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1导入至人B淋巴性白血病细胞株(Raji)内。结果基因测序结果表明成功扩增出VCAM-1胞外区基因,双酶切鉴定表明重组的真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1构建成功。Western blot结果显示导入pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒的Raji细胞中VCAM-1高表达。细胞结合实验表明,表达的VCAM-1与前B细胞(70Z/3)表面的VLA-4特异性结合。结论 VCAM-1真核表达载体构建及表达成功,为前B细胞克隆形成机理以及为B细胞分化发育研究提供实验依据。     

利用GST融合蛋白表达系统表达人PrP蛋白

目的研究与人类海绵状脑病发病有关的膜蛋白ＰｒＰｃ的生物学功用，同时以其为抗原建立有效的免疫学诊断方法。方法采用ＰＣＲ扩增并克隆２例中国人ｐｒｐ基因，经ＤＮＡ序列分析后，亚克隆至ＧＳＴ融合蛋白表达质粒。结果１例正常人ｐｒｐ基因带有点突变，导致形成终止密码，另１例ｐｒｐ基因序列与已发表的标准ｐｒｐ基因序列相同。在ＧＳＴ融合蛋白表达系统中，标准及突变ｐｒｐ基因可有效地表达完整及缺损的ＰｒＰ蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ蛋白转印试验证实，所表达的ＧＳＴＰｒＰ融合蛋白具有良好的免疫反应性。结论人ｐｒｐ基因能在大肠杆菌ＧＳＴ融合蛋白表达系统中得到高效地表达。     

补体膜辅蛋白的研究进展

补体膜辅蛋白是分子质量为45 000～70 000 u的单链穿膜糖蛋白,为补体活化调节基因家族的成员之一.补体膜辅蛋白的细胞分布广泛,但不同类型的细胞表达的数量有所不同.现已用探针从cDNA文库中获得其cDNA克隆片断并测序,基因组结构已确定.补体膜辅蛋白的主要功能是辅助工因子降解C3b和C4b,它和其它补体成员一起有效控制补体活化,保护宿主细胞免受补体介导的杀伤.此外,补体膜辅蛋白还可作为麻疹病毒受体,在生殖免疫、异种器官移植超急性排斥反应等方面具有重要意义.     

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的大鼠骨髓基质细胞（BMCS）的表达能力及表达活性。方法取6周龄SD大鼠BMCS传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine）：1μg pc DNA3．1-VEGF165的比例转染，通过RT—PCR技术、免疫组织化学S—P法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及瞬时表达和稳定表达，用血管内皮细胞（VEC）增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果VEGF基因转染的大鼠骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌培养上清液中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论采用基因转染技术可将VEGF转染至BMCS中，并可有效表达具有生物活性的VEGF。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

人补体受体2-Fc融合蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人补体受体2(CR2)-Fc融合蛋白基因表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人CR2-Fc蛋白。方法将人CR2片段和IgG1 Fc片段进行连接,克隆入PCI-neo表达载体。脂质体法将测序正确的重组真核表达载体转染CHO K1细胞进行蛋白表达,采用SDS-PAGE、Western blot法对蛋白表达进行检测和鉴定。结果利用双酶切及基因测序结果证实CR2-Fc基因序列正确,重组真核表达载体构建成功;SDS-PAGE检测纯化产物的相对分子质量(M r)与预期结果一致,Western blot法在同样位置检出条带。结论成功构建了CR2-Fc重组真核表达载体,获得了有活性的融合蛋白。     

缺氧对肺动脉内皮细胞PDGF基因及PDGF—B链蛋白表面的影响

应用核酸杂交和定量免疫细胞化学分析技术研究了缺氧对猪肺动脉内皮细胞血小板源性生长因子ＰＤＧＦ基因及ＰＤＧＦ－Ｂ链蛋白表达的影响。结果，缺氧能明显增强肺动脉内皮ＰＤＧＦ－Ｂ细胞边ｍＲＮＡ的表达，而ＰＤＧＦ－Ａ链ｍＲＮＡ表达水平无明显改变。免疫细胞化学定量分析与证实ＰＤＧＦ－Ｂ链蛋白染色比正常对照明显增强，与ＰＤＧＦ－Ｂ链基因表达的改变基本一致。提示缺氧可以刺激肺动脉内皮细胞ＰＤＧＦ的表达。ＰＤＦＧ在     

保护性基因A20在血管内皮细胞中的诱导表达

目的：研究人Th2细胞因子对牛主动脉内皮细胞（BAEC）诱导表达保护性基因A20的影响，探讨人Th2细胞因子对异种VEC具有保护效应的机制。方法：建立BAEC的体外培养体系，用浓度为20μg/L的各Th2细胞因子（hIL-4、hIL-10、hIL-13）分别孵育BAEC2h后，再与肿瘤坏死因子α（TNF-α、4μg／L）共孵育24h后收集细胞；应用RT-PCR方法检测各组BAEC中A20mRNA的表达。结果：用Th2细胞因子在一定浓度内预处理BAEC后，能明显诱导BAEC表达保护性基因A20。结论：Th2细胞因子对BAEC的保护作用与Th2细胞因子诱导保护性基因A20在BAEC中的表达有关。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及其真核表达的研究

目的　克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ ＭＣＰ） 的ｃＤＮＡ,并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法　应用ＲＴＰＣＲ 方法,从Ｕ９３７ 细胞总ＲＮＡ 中扩增编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ片段, 快速克隆于ｐＧＥＭＴＥａｓｙ 载体,测定其序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ 载体,电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞,经ＦＡＣＳ 检测筛选表达ＭＣＰ 的阳性细胞克隆,用补体溶破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果　ＲＴＰＣＲ 扩增得到１ １４４ｂｐ 的编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ 片段,序列分析表明该ｃＤＮＡ编码的蛋白为ＳＴＣ＋ ＣＹＴ２ 亚型。细胞转染筛选获得多个表达ＭＣＰ 的ＮＩＨ３Ｔ３ 阳性细胞克隆,补体溶破试验证实其具有抑制人补体经典途径和旁路途径溶破的功能。结论　本研究为进一步探讨不同亚型结构的ＭＣＰ 分子与功能的关系及其应用奠定了基础。     

肝细胞生长因子基因转染对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响

目的:观察HGF基因对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响。方法:从已有质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-HGF,酶切及测序鉴定正确后,用脂质体将重组质粒pEGFP-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达细胞克隆,采用荧光显微镜观察、RT-PCR、免疫细胞化学方法检测鉴定重组质粒的表达情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测稳定表达细胞中HGF的含量;再以MTT法检测转染重组质粒后细胞增殖的改变,Transwell Migration实验检测细胞迁移能力的改变。结果:所构建重组质粒经酶切图谱分析和序列测定证实构建成功;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR证实HGFmRNA在转染阳性细胞高表达;免疫细胞化学证实转染pEGFP-HGF质粒的细胞有HGF蛋白的表达;ELISA检测细胞培养基中HGF含量可达112.3 ng/ml,MTT法、TranswellMigration测定转染pEGFP-HGF阳性细胞的增殖、迁移能力明显高于对照组(P<0.01)。结论:重组质粒pEGFP-HGF能够在内皮细胞株ECV304转录、表达;表达的活性蛋白HGF刺激ECV304的增殖、迁移,为进一步应用于基因治疗奠定实验基础。     

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin的原核表达与分离纯化

目的：原核表达并分离纯化人细胞骨架调节蛋白基因Nelin。方法：利用DNAstar软件预测Nelin的B细胞表位，选择Nelin基因B细胞表位较多、特异性最强的片段。用DNA重组技术，将此片段插入原核表达载体pE128a（＋），构建C末端带有His6标签的原核表达载体pE128a-Nelin，转化大肠杆菌B121（DE3），IPTG诱导，产物用Ni^2＋金属螯合吸附层析柱纯化。结果：成功构建了pE128a-Nelin表达载体，IFTG诱导后表达分子量约为17000的可溶性蛋白，Nelin-His6蛋白的表达量占菌体总蛋白的18％，经Ni^2＋金属螫合层析柱纯化，得到了电泳纯的Nelin—His6蛋白。结论：建立了稳定的Nelin基因的表达体系，为其功能研究奠定了基础。     

人RNF6基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的表达

目的 构建人hRNF6基因的原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达.方法 提取前列腺癌细胞CWR22Rvl的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至GST融合表达载体pGEX5X-1,在E.coli BL21中诱导GST-hRNF6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果.结果 hRNF6编...