幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析

目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。     

幽门螺杆菌Mr 26 000外膜蛋白编码基因的克隆及表达

目的　构建含幽门螺杆菌 (Hp)Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的重组载体 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法　用PCR从Hp染色体中 ,扩增Mr 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经BamHI、HindⅢ双酶切、纯化、连接后 ,构建含有目的基因的重组载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL2 1(DE30 )并表达。表达产物经纯化后 ,用ELISA法检测其抗原性。结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为HpMr 2 6 0 0 0的外膜蛋白编码基因 ,与Tomb等的报道相比较 ,有 1.1%的bp发生变异 ,1.5 1%的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr为 4 6× 10 3 ,可溶性表达产物占细菌总蛋白的 38.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。ELISA法检测显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别 ,具有良好的抗原性。结论成功地克隆并表达Mr为 2 6 0 0 0的Hp外膜蛋白编码基因 ,为Hp蛋白疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究打下了基础     

HP1188-IgY对感染幽门螺杆菌BALB/c小鼠的治疗作用

目的:评价抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)HP1188蛋黄抗体(HP1188-immunoglobulin yolk,HP1188-Ig Y)对BALB/c小鼠胃内H.pylori感染的治疗效果。方法:建立H.pylori感染BALB/c小鼠的动物模型,将建模成功的80只小鼠随机分为8组,每组10只。第1组(抗生素治疗组)、第2组(1 mg HP1188-Ig Y)、第3组(1 mg HP1188-Ig Y+30%硫糖铝)、第4组(5 mg HP1188-Ig Y)、第5组(5 mg HP1188-Ig Y+30%硫糖铝)、第6组(PBS对照组)和第7组(30%硫糖铝对照组)分别连续治疗10 d,每天1次;第8组间隔48 h皮下注射2.5 mg HP1188-Ig Y,共2次;另10只正常小鼠为第9组(健康对照组)。处理完成2周后取各组小鼠胃组织作H.pylori培养、快速尿素酶试验、PCR检测H.pylori特异性vac A和cag A及病理组织学检查,观察H.pylori清除情况并进行评分。结果:在小鼠体内,灌胃(1 mg HP1188-Ig Y+30%硫糖铝)即可有效治疗H.pylori感染引起的胃黏膜损害,其治疗效果与抗生素相似。结论:成功构建了H.pylori感染的BALB/c小鼠模型,选择30%硫糖铝为抗体保护剂,经口服HP1188-Ig Y可抑制小鼠胃内H.pylori感染。     

幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段原核表达载体的构建和表达

目的 构建幽门螺杆菌（Hp)vac A基因片段原核表达载体并进行表达。方法 采用PCR技术,扩增Hp vac A基因的1个片段B,并克隆入pGEM－3Zf(-)质粒。测序正确后,再克隆入质粒pRSETA中,构建重组表达载体pRSETA-B。结果 经过转化E.coli BL21 DE3(plysS)后,诱导表达出相对分子质量（Mr)为33000的蛋白。SDS－PAGE分析显示,表达量占全菌总蛋白质的47．8％。清中目的蛋白占全菌总蛋白的10．9％。ELISA和Western blot分析表明,表达蛋白能与免抗Vac A多抗结合。结论 成功地构建原核表达载体pRSETA-B,为进一步探讨该片段的生物学活性,以及临床上通过检测患者血清预测Hp的感染提供了实验依据。     

幽门螺杆菌oipA基因片段的克隆表达及抗原性分析

目的:分片段克隆表达幽门螺杆菌oipA基因,确定抗原性最强的重组蛋白肽段.方法:从Hp国际标准株NCTC11637中获取oipA全长基因,克隆至pGEM-T载体并鉴定正确,以重组pGEM-T/oipA为模板PCR扩增6个不同大小的oipA基因片段,与表达载体pET-42a连接,转化大肠杆菌BL-21,重组子经PCR、酶切、测序鉴定.IPTG诱导重组蛋白肽段的表达,经Western Breeze 化学发光法鉴定融合蛋白;优化诱导时间和IPTG浓度,诱导重组蛋白大量表达;Ni-NTA His*Bind树脂亲和纯化表达产物;羊抗Hp多克隆抗体,Western blot法检测纯化蛋白的抗原性,间接ELISA法筛选抗原性最强的重组肽段.结果:6条oipA基因片段在大肠杆菌中都得到了表达,表达的蛋白肽段均可被抗Hp多克隆抗体识别,具有抗原性,其中反应性最强的是最小的蛋白肽段.结论:oipA基因片段可在原核系统中表达,所获取的最小的肽段抗原性最强,可望制备检测血清相应抗体的试剂盒.     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究

目的　构建和表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位 (UreB)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)的重组融合蛋白 ,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌染色体DNA中扩增出 1713bp的ureB基因 ,并克隆至pFS2 .2载体中与ltB基因融合 ,将ltB ureB融合基因插入改造后的原核表达载体PinPointTMXa Ⅱ ,并在工程菌E .coliJM10 9中诱导表达。结果　经序列分析 ,ltB ureB融合基因由 2 10 3个碱基组成 ,为编码 70 1个氨基酸残基的多肽。SDS PAGE和Westernblot检测发现 ,融合蛋白的相对分子质量 (Mr)约为 75× 10 3 ,并与幽门螺杆菌感染的阳性血清发生抗原抗体反应 ,ELISA检测显示 ,融合蛋白中存在LTB组分。同时发现所表达的融合蛋白无尿素酶活性 ,但保持与LT受体 神经节苷脂GM1结合的活性。结论　LTB UreB融合蛋白有可能用于幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究     

幽门螺杆菌alpA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析

目的:在乳酸菌中表达幽门螺杆菌(Hp)黏附素al-pA基因,口服免疫小鼠后检测其免疫原性。方法:PCR方法从基因组中扩增alpA基因,将其克隆至表达载体pNICE:sec,将重组质粒转化乳酸菌NZ9000株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的alpA蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。将雌性ICR(CV级)小鼠随机分为4组,分别用PBS、携带空质粒的乳酸菌、携带pNICE:sec-alpA的乳酸菌、灭活的Hp灌胃。免疫7次后检测其特异性IgG和IgA的产生。结果:扩增alpA基因并构建了重组原核表达质粒pNICE:sec-alpA,转化乳酸菌NZ9000后经nisin诱导可表达Mr约56 000的重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的9.6%,Western blot分析其能与幽门螺杆菌抗血清特异性反应,具有良好的免疫原性。携带pNICE:sec-alpA质粒的乳酸菌刺激产生的IgG水平明显高于携带空质粒组,与灭活Hp组没有明显的差异,但其刺激产生的IgA水平明显高于其他组(P0.05)。结论:表达al-pA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后,能够刺激小鼠产生特异的IgG和IgA,可作为幽门螺杆菌口服疫苗候选抗原。为乳酸菌作为抗原递送载体的研究和Hp口服疫苗的开发提供一定的实验基础。     

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0527基因的缺失株构建和鉴定

目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori)Cag致病岛编码hp0527基因的突变株.为Cag致病岛致病机制及H.priori功能研究奠定基础.方法:利用基因同源重组方法将卡那霉素抗性基因(KanR)连接到PCR扩增hp0527两端区域产生的2个目的基因片段之间,构建hp0527基因缺失的自杀质粒pBlueKM40-△hp0527;将带有卡那霉素抗性标志的缺失突变载体,通过抗生素卡那霉素筛选出缺失hp0527基因的突变株,并经PCR方法鉴定后,采用野生株和突变株的幽门螺杆菌分别与胃癌上皮细胞BGC-823共培养后,分析它们对细胞毒素相关蛋白CagA转运能力的影响.结果:成功构建出幽门螺杆菌hp0527基因突变的自杀质粒,突变载体经内切酶酶切分析显示:产生的条带与设计结果完全一致;抗生素筛选并经PCR鉴定后,获得了hp0527基因缺失株;CagA蛋白转运分析表明基因hp0527缺失前后,可以导致细菌转运CagA蛋白能力的丧失.结论:成功构建出1株缺失hp0527基因的H.pylori突变株,对于阐明该基因的功能及其在H.pylori致病中的地位及作用具有重要的研究价值.     

幽门螺杆菌尿毒酶B基因的克隆与高效表达

目的 克隆并表达幽门螺杆菌尿素酶B基因。方法 提取幽门螺杆菌染色体DNA,用PCR方法扩增尿素酶B基因。将其克隆至表达载体pQE30,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。结果 分离得到了1．7kb的 ureB基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达。在37℃诱导表达4h后,表达产物约占细菌总蛋白的34．0％,表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要是包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的55．8％。结论 幽门螺杆菌ureB基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

幽门螺杆菌Catalase基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

目的：构建含人幽门螺杆菌（Hpylori，Hp）过氧化氢酶（catalase，KatA）编码基因的重组质粒，测定、分析其核酸序列，并在E.coli中表达，研究其抗原性。方法：应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增KatA编码基因片段，将其T-A克隆和测序，并与GenBank公布的其他Hp菌株的基因序列比较，再将目的基因插入至融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达，用GST亲和层析对其进行纯化。纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体（mAb）的鉴定及与Hp啊感染患者血清进行Western blot。结果：KatA基因全长为1 515 bp，并在GenBank上登录（No．DQ333889），与GenBank公布的其他Hp菌株的核酸的同源性为96％～97％，表达的KatA融合蛋白的相对分子质量（Mr）为85 000，29株小鼠抗Hp全菌mAb中有4株mAb是针对KatA的，表达产物可被Hp感染患者的血清特异性识别。结论：重组KatA具有较好的抗原性，为坳检测试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的 设计幽门螺杆菌（Hp）的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法 将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸（KK）间隔,合成全基因,克隆到pET-22b载体上,在大肠杆菌B121（DE3）中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balb／c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果 克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95％,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽（U546-561、U229-244、U237-251）、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖（SI〉2）,并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论 本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。     

HPV16 L1基因的原核表达及免疫反应性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)主要衣壳蛋白L1，并鉴定其免疫反应性。方法：将HPV-16L1基因克隆人原核表达载体pThioHisC中，构建重组表达载体。以重组载体分别转化大肠杆菌Top10和DH5α，在IPTG诱导下表达外源基因，用SDS—PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析。结果：构建了HPV—16L1基因的原核表达质粒pThioHisC／HPV—16L1，并在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)约为70800的蛋白。表达的蛋白能与抗HPV—16L1抗体发生特异性反应。结论：在原核细胞中成功地表达HPV—16L1基因，为HPV—16L1疫苗的研制提供了必要的基础。     

抗菌肽Cecropin A基因原核表达及表达产物的鉴定

背景：Cecropins是一种具有抗菌活性的小分子蛋白质。采用真核细胞表达或人工合成Cecropins,效率低、成本高。 目的：克隆表达家蝇抗菌肽基因Cecropin A,并对其重组表达产物进行鉴定。 方法：依据GenBank中家蝇Cecropin A基因序列设计特异性引物,用RT-PCR从家蝇幼虫组织中扩增Cecropin A成熟肽基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,与表达载体中的Thioredoxin基因构成融合基因,并转化E.coli BL21。经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导表达。采用家蝇幼虫血淋巴免疫家兔获得抗血清;Western blot和三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定诱导的重组蛋白质。 结果与结论：经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导,E.coli BL21可表达Cecropin A成熟肽,兔抗家蝇幼虫血清、三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot结果证实表达产物为Cecropin A成熟肽。说明使用原核表达系统可以获得天然Cecropin A成熟肽。     

幽门螺杆菌napA基因的克隆、表达及免疫反应性分析

目的构建高效表达幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)的原核表达系统,为Hp候选疫苗研制打下基础。方法从Hp标准株NCTC11639染色体DNA中扩增napA基因片段,T-A克隆后测序,与GenBank公布的其他Hp菌株的napA基因序列进行比较。目的基因片段酶切后,与表达载体连接,转化至宿主菌,构建napA基因原核表达系统pGEX-4T-1-napA-E.coliTop10。优化诱导表达条件,采用SDS-PAGE鉴定表达产物,GST亲和层析纯化收集重组NAP蛋白,Western blot法鉴定重组NAP的免疫性;采用ELASA法检测胃癌患者Hp阳性血清中抗NAP抗体效价,通过间接ELASA法从29株小鼠抗Hp全菌单克隆抗体(mAb)中筛选抗Hp-NAPmAb。结果所克隆的napA基因全长为435bp,在GenBank上登录(No.DQ341279),与GenBank公布的其他Hp菌株的核苷酸同源性为94%~98%,与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97%,表达的NAP融合蛋白的相对分子质量(Mr)为44000,1mmol/L浓度IPTG诱导4h表达产物量较高,表达产物可被Hp感染患者的血清及兔抗Hp全菌抗体特异性结合,胃癌患者血清中抗NAP抗体效价高于正常人群血清,29株小鼠抗Hp全菌mAb中有3株mAb能与NAP发生强免疫反应。结论成功构建napA基因高效可溶性原核表达系统,重组NAP具有良好的免疫反应性,NAP在胃癌患者血清中高表达可能与胃癌的发病有关,NAP是具有良好前景的抗原。