人CDK7基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建带Myc标签的细胞周期蛋白依赖性激酶7（cyclin－dependent kinase 7, CDK7）的真核表达载体,获得其表达产物,并验证该激酶与已知相互作用蛋白P53之间的相互作用。方法应用PCR技术从人乳腺文库中扩增出CDK7全长编码区基因,将其克隆到pXJ－40载体中;继而重组质粒转染人胚肾293 T细胞,以SDS－PAGE和Western印迹鉴定表达情况;免疫共沉淀检测Myc－CDK7与FLAG－p53的相互作用。结果双酶切和基因测序鉴定显示,Myc－CDK7真核表达质粒克隆构建成功;SDS－PAGE和Western印迹结果表明,Myc－CDK7转染人胚肾293T细胞后成功表达;免疫共沉淀显示,重组Myc－CDK7与已知相互作用蛋白P53在蛋白质水平上具有相互作用,证实其具有生物学活性。结论成功构建Myc－CDK7的真核表达载体,为进一步探讨Myc－CDK7对细胞周期的调控奠定了实验基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究

目的 在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因.方法 以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列.酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD.结论 成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达.     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。     

丙型肝炎病毒NS5B基因的克隆及在大肠杆菌的分泌表达

由于全长丙型肝炎病毒NS5B的疏水性，其表达和纯化非常困难。为了分泌表达NS5B，作者对NS5B进行截短，缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCV NS5B基因，并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）的方法，设计截去NS5B疏水部分，PCR引物以HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板，克隆到pGEM-Teasy载体中，双酶切后回收连接到pET-21b中表达。大肠杆菌培养上清过柱纯化，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹显示NS5B蛋白在大肠杆菌细胞中表达。表达产物在大肠杆菌培养上清中存在，分子量68kD左右，而且[^3H]总掺入率达6900cpm。NS5B蛋白在大肠杆菌上清中表达成功，经过活性测定，所表达的NS5B具有活性功能。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建表达人凝血因子Ⅶ（FⅦ）的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ（rhFⅦ）。方法利用BamHⅠ和EcoR Ⅴ双酶切pcDNA 3．1－FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白（ GFP）表达盒的pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体,构建pAdTrack－CMV－FⅦ,继而进行酶切和测序鉴定;经PmeⅠ单酶切线性化后,pAdTrack－CMV－FⅦ在BJ5183感受态菌内与pAdEasy－1腺病毒骨架发生同源重组,构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒pAd－FⅦ;经PacⅠ酶切后的pAd－FⅦ,使用PEI试剂转染293 A细胞,包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad－FⅦ;利用Western 印迹检测重组腺病毒Ad－FⅦ介导293 A细胞表达FⅦ的蛋白水平;通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定,FⅦ克隆到pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体中,获得重组质粒pAdTrack－CMV－FⅦ;将其与pAdEasy－1在细菌内发生同源重组,成功获得FⅦ重组腺病毒质粒pAd－FⅦ;在293A细胞内包装重组腺病毒,Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad－FⅦ,并实现了rhFⅦ在哺乳动物细胞中的表达,为利用哺乳动物细胞表达rhFⅦ的研究奠定了基础。     

PRDX3真核表达载体构建及亚细胞定位

目的：构建带FLAG标签的过氧化物还原酶3（peroxiredoxin3,PRDX3, PRX3）的真核表达载体,并对其在人舌癌SCC15细胞中的定位进行检测。方法以乳腺文库为模板,PCR扩增带有FLAG标签的PRDX3基因片段,并将扩增产物插入到PCDH空载体中,构建成PCDH－FLAG－PRDX3,质粒测序正确后瞬时转染入人胚肾293T细胞, Western免疫印迹检测克隆载体的表达情况,细胞免疫荧光实验检测PRDX3的亚细胞定位。结果双酶切和测序结果表明,PCDH－FLAG－PRDX3真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达了FLAG－PRDX3融合蛋白;细胞免疫荧光显示FLAG－PRDX3蛋白定位于舌癌SCC15细胞的细胞质中,不存在于细胞核内。结论成功构建了带FLAG标签的PRDX3真核表达载体,并检测其定位于舌癌SCC15细胞质中,为进一步明确PRDX3在舌癌发生发展中的功能及分子机制奠定基础。     

乙型肝炎病毒多表位嵌合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的：构建含乙肝病毒表达抗原前S1，S2（HBV preS1,preS2)优势B细胞表位与乙肝病毒核心抗原（HBcAg)的嵌合蛋白，探索其作为兼具预防和治疗HBV感染作用的新型疫苗的可能性。方法：利用分子克隆技术先后将HBV preS1(21-47AA.),preS2(133-145AA.)表位基因插入HBcAg基因中，得到HBV C144，CS1，CS1S2融合基因，分别克隆到原核表达载体pQE-30中，大肠杆菌（E.coli)M15中进行表达，用Ni^2 固相化的螯合Sepharose Fast Flow亲和层析纯化重组蛋白，最后进行抗原性的鉴定。结果：构建了HBV嵌合型颗粒蛋白表达载体，并在E.coli中高效表达出可溶性病毒样颗粒蛋白C144,CS1,CS1S2，经Ni-NTA亲和层析 化后，蛋白纯度达80％,Western印迹及ELISA证明蛋白各表位都具有抗原性。结论：本研究为进一步深入研究新型HBV治疗性疫苗的功能和应用奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒 X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的重组表达质粒pcDNA3.1(－）-NS3和表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(－）-X，分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，用免疫印记（Western blotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT 3-promoter共转染HepG2细胞，检测报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达水平，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子功能的影响。结果显示，两个重组表达载体pcDNA3.1(－）-NS3及pcDNA3.1（－）-X在HepG2细胞均以瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3.1(－）-X组的CAT的表达分别是对照的3．6倍和4．4倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的8．5倍；表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明，HepG2细胞中表达的HCV NS3蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

目的：获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）cDNA基因，构建酵母双杂交诱饵载体，并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段，克隆入诱饵载体pGBKT7，再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2。将重组质粒导入酵母菌AHl09，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果：成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）酵母双杂交诱饵载体，该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性，对报告基因也没有激活作用。结论：我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白，以利于对DOC-2基因功能进行研究。     

人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70（HSP70）的基因，以质粒为模板，采用PCR方法进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1.96kb的片段；回收片段经T－A克隆法克隆到pUCm-T载体上，并进行DNA测序；将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后，亚克隆到表达载体pET-21a( )上，将重组质粒pET-21a( )/HSP转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，收集细菌，菌体裂解后进行SDS－PAGE及Western blot检测。结果表明，应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段，序列测定结果证实，扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致；经EcoR I Xho I酶切及PCR鉴定证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a( )上，转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，进行SDS－PAGE，发现在分子量为72000处有表达量明显增多的蛋白条带，Western blot证实其为目的的条带。表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因。     

白细胞介素-18逆转录病毒载体的构建及抗乙型肝炎病毒的研究

研究鼠白细胞介素－18（IL－18）基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。以逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术从受植物凝血素（PHA）和脂多糖（LPS）刺激BALB/c小鼠脾脏细胞中扩增出IL－18的cDNA，并构建表达IL－8基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-IL-18，转染PA317细胞，以逆转录巢式RT－PCR方法，验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中IL－18的表达，将假病毒颗粒感染2．2．15细胞，酶联免疫吸附法（ELISA）检测其上清HBsAg和HBeAg，定量检测HBV DNA。成功克隆出580bp的小鼠IL－18全基因并构建逆转录病毒载体，在转染PA317细胞的上清中检测出含IL－18假病毒颗粒，上清感染2．2．15细胞后第3、5、7、14天，HBsAg、HBeAg逐渐下降，到14天时HBsAg已变为阴性，对HBV DNA有明显抑制作用。IL－18能成功地在逆转录病毒载体中表达，并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用。     

神经特异性转录因子DAT1酵母双杂交诱饵载体的构建

目的：用神经特异性转录因子DAT1构建酵母双杂交系统中的诱饵载体。方法：根据GenBank中提供的DATl序列设计引物，以小鼠脑组织cDNA文库为模板，PCR扩增DAT1，并与pLexA载体连接，测序鉴定。用醋酸锂法转化酵母菌EGY48，在选择性培养基上观察pLexA-DATl在EGY48中的表达。结果：PCR扩增出的DNA片段约490bp，大小正确，构建的融合表达载体pLexA-DAT1，测序结果表明序列完全正确，融合区域的读码框正确。转化了pLexA-DAT1的酵母菌EGY48在加有X-Gal的SD／Gal／Raf／-His／-Ura营养缺陷型诱导平板上菌落不变蓝，证明LexA-DAT1融合蛋白本身不具有激活p80p-LaeZ报告基因的能力，可以用作进一步的实验。结论：获得了在酵母细胞中正确表达且未自主激活报告基因的融合表达载体pLexA-DAT1，可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”。     

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义

目的 构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法 利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因,将其插入原核表达载体pET28(a)载体中,构建pET28(a)-HCVE2,从pET28(a)-HCVE2上获得His-HCVE2融合基因,插入pcDNA3．1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3．1-His-E2。用脂质体介导法将pcDNA3．1-His-E2转染CHO细胞,通过间接免疫荧光、Western blot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果 转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内声融合蛋白的表达。结论 与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。     

我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达

目的：通过对登革病毒ＮＳ１基因的表达,研究表达的ＮＳ１蛋白的抗原性,为研制新型登革疫苗提供依据。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术将扩增的ＮＳ１基因插入到ｐＢＶ２２０载体中,通过温控诱导进行外源蛋白的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果：获得正向插入的ＮＳ１－ｐＢＶ２２０重组质普,表达产物的相对分子质量约为５１０００,与预期大小一致,并且可与登革２型