RNA干扰沉默c-myc基因对胶质瘤血管内皮生长因子表达的影响

目的 观察c-myc癌基因在体外对胶质瘤细胞血管内皮生子因子(VEGF)表达的影响。方法 构建以c-myc基因为靶向的shRNA干扰质粒pCMYC,同时构建pHK质粒作为阴性对照,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组细胞中c-myc及VEGF mRNA水平的表达变化,采用免疫细胞化学法及Western blot法分别检测3组细胞中c-myc及VEGF蛋白的表达。结果 (1) IN500Δ-pCMYC细胞组c-myc与VEGF mRNA表达降低(0.273±0.028,0.443 ±0.048),与IN500Δ细胞组(1.185±0.145,1.116±0.072)及IN500Δ-pHK细胞组(1.098±0.128、1.208±0.133)比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。(2)免疫细胞化学染色结果显示,IN500Δ-pCMYC细胞组c-myc与VEGF阳性细胞表达率均显著降低,为(24.52 ±4.39)％及(23.52±3.44)％,与IN500Δ及IN500Δ-pHK细胞组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。(3)Western blot法检测结果显示IN500Δ-pCMYC细胞中c-myc与VEGF的蛋白表达降低(0.221±0.041、0.284±0.025),与IN500Δ细胞组(1.821±0.191、1.531±0.213)及1N500Δ-pHK细胞组(1.650±0.110、1.820±0.122)比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。结论 沉默c-myc基因能够抑制胶质瘤中VEGF的表达,从而降低肿瘤组织内的血管生成。     

RNA干扰Oct4的表达对肝癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨干细胞相关基因Oct4与Wnt/β-catenin在人肝癌组织及肝癌细胞系中的相互作用.方法 PCR法检测Oct4、Wnt/β-catenin及其他相关基因在肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织的表达差异.使用SiRNA-Oct4沉默人肝癌HepG2细胞Oct4的表达,实时荧光定量PCR法检测Wnt/β-catenin基因表达.检测RNAi后细胞迁移以及克隆形成能力.结果 肝癌患者的上述组织中,Oct4和β-catenin在癌内表达最高,癌旁次之,正常肝最低.使用SiRNA-Oct4沉默人肝癌HepG2细胞Oct4后,Oct4表达明显下调,β-catenin、Wnt10b表现为与Oct4表达呈正相关,TCF3表达与Oct4呈负相关.RNAi后HepG2细胞的迁移能力、克隆形成能力均下降.结论 Oct4在肝癌组织内高表达而在正常肝细胞中的表达极低.RNAi后HepG2细胞的迁移能力、克隆形成能力均下降可能与Wnt/β-catenin通路功能减弱有关.

Abstract：

Objective To investigate the expression of Oct4 in liver cancer, and the interrelation of the Oct4 and Wnt/β-catenin genes in hepatocellular carcinoma( HCC) cell line HepG2. Methods RTPCR technique was used to detect the expression of Oct4 and β-Catenin in HCC specimens; RNAi was used to knock-down the expression of Oct4 in HepG2, and the change of Wnt/β-catenin related genes were detected by Real time-PCR. Results In HCC specimens, the expression of Oct4 and β-Catenin in tumor and cirrhotic liver tissues were stronger than normal liver tissues. In SiRNA Oct4 HepG2 cells, the expression of Oct4 was downregulated, and β-catenin as well as Wnt10b were in a positive correlation with Oct4, TCF3 was in negative correlation with Oct4. Clone formation and move ability of the HepG2 were downregulated. Conclusions The expression of Oct4 was higher in tumor tissues than in normal liver tissues. Silencing Oct4 by SiRNA-0ct4 in HepG2 resulted in decreased ability of clone formation and cell movement.     

小干扰RNA靶向抑制Ezrin蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的 探讨膜-细胞骨架联接蛋白Ezrin对人乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响.方法 采用小干扰RNA方法下调人乳腺癌MCF-7细胞中Ezrin的表达,分别通过RT-PGR和Western blot检测siRNA下调Ezrin基因和蛋白表达的水平.并采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪榆测细胞周期,Transwell实验检测细胞侵袭能力. 结果 RT-PCR和Western blot结果显示,RNA干扰后Ezrin基因蛋白水平均明显下调(F=41.97,P＜0.01),RNA干扰后MCF-7细胞G2-M期细胞比例下降(t=-5.997,P＜0.01);细胞凋亡增加(t=4.479,P＜0.01);细胞的侵袭能力下降,穿过人工基底膜的细胞数量明显减少(t=5.268,P＜0.01).结论 Ezrin在乳腺癌生长和侵袭转移过程中发挥重要作用.     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

RNA干扰沉默STIL基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨STIL在胃癌中的表达以及沉默STIL基因对胃癌细胞株SGC-7901各生物学活性的影响.方法 采用实时定量PCR（qPCR）法和Western Blot法检测STIL在胃癌及癌旁组织中的表达.构建靶向STIL的SiRNA并转染SGC-7901细胞,以MTT法检测细胞增殖、平板克隆法检测细胞克隆形成,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡.结果 与癌旁组织相比,胃癌组织中STIL在mRNA和蛋白水平表达显著增高.与对照组相比,STIL特异性SiRNA（Si-STIL）转染后,SGC-7901细胞中STIL mRNA表达受到抑制,细胞增殖、克隆形成能力下降,凋亡增加,细胞周期被阻滞于S期.结论 STIL在胃癌组织中高表达,STIL基因沉默可抑制胃癌细胞生长和克隆增殖、抑制有丝分裂期（M期）转换,促进细胞凋亡.     

RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3表达对胶质瘤细胞周期和凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3(LRIG3)基因表达后对胶质瘤细胞生长的影响及其机制.方法 设计两对含LRIG3特异性短发夹RNA(shRNA)序列的质粒及含非特异性shRNA的对照质粒,转染胶质瘤细胞系GL15、G418筛选出稳定株,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测LRIG3表达的改变,流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双标记分析细胞凋亡.结果 实验组细胞LRIG3 mRNA和蛋白水平与对照组比较分别下降了52.4%、63.8%和50.9%、67.4%.流式细胞仪分析显示,实验组的G2/M期细胞细胞百分率比对照组明显增加,细胞增殖指数显著增加(P<0.01);LRIG3基因表达下调后还具有显著的抗凋亡作用(P<0.05).结论 LRIG3特异性siRNA可明显抑制LRIG3基因的转录和表达,从而促进GL15细胞的增殖和使细胞周期阻滞在G2/M期并能抑制其凋亡.     

RNA干扰E2F-1表达对胃癌MGC803细胞生物学行为的影响及其机制

目的 利用基因表达谱芯片技术探讨E2F-1小分子干扰RNA(E2F-1-siRNA)影响胃癌细胞MGC803生物学行为的分子机制.方法 分别抽取E2F-1-siRNA转染组和对照组(negative control-siRNA)的细胞总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记cDNA探针,与含有21522条人类22k基因表达潜芯片进行杂交.采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析.结果 在21522条基因中,两组胃癌细胞间差异性表达基因为18条,其中上调基因8条,下调基因10条,下调的基因中有1条功能信息不明.结论 体外干扰E2F-1基因表达后,胃癌MGC803细胞生物学行为的变化是多基因相互作用、多种信号通路相互调节的结果,其中的关键基因和信号传导通路值得进一步研究.     

小分子干扰RNA对胃癌MGC803细胞E2F-1表达及其生物学行为的影响

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对胃癌MGC803细胞E2F-1基因表达及其生物学行为的影响.方法 将实验组(E2F-1-siRNA)和阴性对照组(negative control-siRNA)转染进MGC803细胞,48 h后采用实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot技术分别检测E2F-1 mRNA及蛋白的表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测MGC803细胞增殖的变化,流式细胞仪检测MGC803细胞周期变化.结果 E2F-1-siRNA有效抑制胃癌细胞E2F-1 mRNA和蛋白的表达并且影响MGC803细胞的增殖,与阴性对照组及未转染组细胞比较mRNA降低了84.8%和85.3%(F=14.35,P＜0.05),蛋白降低T77.2%和79.6%,MGC803细胞增殖分别抑制了69.0%和81.6%,差异有统计学意义(F=170.18,P＜0.05);同时E2F-1-siRNA促使更多MGC803细胞DNA含量聚集于G2/M期附近,G2/M期DNA含量比例为(54.98±3.46)%,与阴性对照组(44.70±3.82)%和未转染组(31.47±2.12)%比较,差异有统计学意义(F=88.90,P＜0.05).结论 E2F-1-siRNA可以有效抑制人胃癌MGC803细胞E2F-1 mRNA及蛋白的表达,使G1 期细胞的DNA含量下调,细胞分裂停滞在G2/M期附近,抑制胃癌细胞的增殖.     

靶向垂体特异转录因子-1的小干扰RNA对大鼠生长激素垂体腺瘤GH3细胞生物学行为的影响

目的 观察小干扰RNA (siRNA)抑制大鼠垂体生长激素腺瘤细胞(GH3)中垂体特异转录因子-1(Pit-1)的基因表达对其生物学行为的影响.方法 设计合成针对Pit-1基因的siRNA,经脂质体包裹转染GH3细胞.采用Western blot、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定经siRNA转染24 h后;Pit-1蛋白和Pit-1 mRNA表达;用细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞增殖-毒性检测法检测细胞生长增殖的变化;用流式细胞仪检测细胞凋亡的改变;制备Transwell小室测定GH3细胞体外侵袭能力的变化.结果 siRNA显著地抑制Pit-1蛋白和Pit-1 mRNA的表达水平,分别降低58.18％和75.82％;CCK-8法结果显示siRNA组细胞增长率明显低于与阴性对照组;流式细胞仪分析显示,siRNA组细胞凋亡率[(9.250 00±0.996 95)％]较阴性对照组[(2.893 30±0.665 16)％]增加;,siRNA组穿过Matrigel胶及滤膜的细胞数[(92.91±53.25)个],与阴性对照组[(7.50±7.95)个]比较侵袭力明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Pit-1 siRNA能够有效地抑制GH3细胞的生长、促进其凋亡,降低侵袭力.     

RNA干扰畸胎瘤源性生长因子基因对食管鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰畸胎瘤源性生长因子（PCDGF）基因对食管鳞癌细胞Eca-109的影响.方法 脂质体介导PCDGF-shRNA的表达载体转染Eca-109细胞,应用RT-PCR、Westernblot检测转染后细胞PCDGF mRNA及蛋白的表达情况,分别采用Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒和Boyden小室法检测转染后Eca-109细胞的增殖能力和侵袭能力.结果 转染组PCDGF mRNA和蛋白表达水平均较其他组下调.转染24、48和72 h转染组细胞增殖均受到抑制,抑制率分别为20.4％、21.1％和20.9％,其细胞增殖活性较未转染组、阴性质粒组和脂质体组均明显降低（均 P＜0.05）.未转染组、阴性质粒组、脂质体组和转染组的细胞迁移数分别为118.8±12.0、100.8±9.0、114.3±4.7和 53.5±16.3,转染组与其余3组比较,差异均有统计学意义（P=0.001,P=0.002,P=0.002）.结论 RNA干扰PCDGF基因可抑制食管鳞癌细胞的体外增殖及侵袭能力,PCDGF基因可能成为基因治疗的新靶点.     

SLC22A18基因表达对胶质瘤细胞生物学特性的影响

目的 观察SLC22A18基因表达对人胶质瘤U251细胞生物学特性的影响.方法 U251细胞分别转染pcDNA3.SLC22A18和pcDNA3表达质粒后,筛选3个表达不同水平SLC22A18的U251克隆和2个不表达SLC22A18的U251克隆,研究SLC22A18蛋白表达水平对U251细胞黏附、迁移及聚集能力的影响.结果 与不表达SLC22A18的U251细胞比较,表达SLC22A18的U251细胞在附着后1 h和4 h时的细胞黏附能力均显著增强,分别平均增强65.7%和26.5%(P＜0.01),而其细胞过河实验显示过河时间平均延长67.8%(P＜0.05),并且细胞迁移能力平均下降71.5%(P＜0.01).同时,SLC22A18表达诱导显著的同源细胞聚集,聚集指数平均下降53.2%(P＜0.01).结论 SLC22A18蛋白表达显著抑制人胶质瘤U251细胞的恶性生物学特性.

Abstract：

Objective To study the effect of SLC22A18 gene expression on the biological behaviors of human glioma U251 cells. Methods Three U251 clones with different expression levels of SLC22A18 and two U251 clones without SLC22A18 expression after transfecting U251 cells with pcDNA3. SLC22A18 and pcDNA3 using lipofectin were chosen to study the effects of SLC22A18 gene expression on cell adhesion,motility and aggregation. Results Compared to the non-SLC22A18-expressing U251 cells, SLC22A18-expresing U251 cells indicated enhanced cell adhesion, and average 65. 7% and 26. 5% increases in cell adhesion at 1st and 4th h of the culture were observed (P ＜0. 01) , but the crossing-river time of SLC22A18-expresing U251 cells was averagely prolonged by 67. 8% (P ＜0. 05) , and their motility was decreased by 71.5% ( P ＜ 0. 01 ). At the same time, SLC22A18-expressing U251 cells demonstrated significantly homophilic aggregation, and aggregation index was decreased by 53. 2% compared to the non-SLC22A18-expressing U251 cells (P＜0. 01). Conclusion SLC22A18 gene expression significantly suppresses the malignant biological behaviors of U251 glioma cells.     

RNAi沉默pyk2基因对鼠脑胶质瘤细胞增殖、侵袭能力的影响

目的 探讨pyk2小干扰RNA表达载体对小鼠脑胶质瘤G422细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 用以pGenesil-1质粒为载体,以pyk2为靶基因,构建短发夹状小干扰RNA表达载体.用pyk2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的人脑胶质瘤G422细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测pyk2基因和蛋白表达的改变,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染后细胞的增殖情况,Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力.结果 构建了pGenesil-1-pyk2重组质粒,并成功转染G422细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示pyk2 siRNA转染G422细胞后显著降低pyk2mRNA的表达,以48 h为著,下降近70%;Western blot证实转染后pyk2蛋白的表达下降近65%;G422细胞的活力降低为(67.1±5.2)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降.结论 pGenesil-1-pyk2 siRNA重组质粒明显下调pyk2在胶质瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖,抑制其侵袭能力.     

小干扰RNA特异性沉默c-myc基因对人胰腺癌SW1990细胞生物学影响

目的 观察小干扰RNA(siRNA)沉默c-myc基因的表达对人胰腺癌细胞株SW1990细胞生物学影响.方法 用siRNA沉默胰腺癌SW1990细胞中c-myc基因,用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot技术检测c-myc mRNA及蛋白的表达量;噻唑蓝(MTT)法检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞增殖的影响;膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)双染流式细胞术检测沉默c-myc基因细胞凋亡水平;Transwell细胞迁移实验检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞迁移能力的影响.结果 靶向c-myc的特异性siRNA可以高效抑制人胰腺癌SW1990细胞c-myc基因表达,在mRNA水平(0.263±0.048)较转染对照质粒组(0.970±0.012)明显降低,c-myc蛋白质表达量及细胞增值率均较转染对照质粒组明显降低;转染后48 h c-myc siRNA组细胞凋亡率为(19.90±2.09)％,明显高于siRNA阴性对照组(4.93±0.25)％和空白对照组(4.40±0.34)％;Transwell实验结果示细胞穿膜数c-myc siRNA组[(34.3±1.2)个]较siRNA-NC组[(68.3±5.8)个]和空白组[(72.3±1.2)个]均明显降低.结论 c-myc siRNA能够显著抑制c-myc基因在人胰腺癌SW1990细胞中的表达,降低细胞的增殖和迁移能力,促进细胞的凋亡.     

黏着斑激酶对胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的探讨反义黏着斑激酶（FAK）对U251人胶质瘤细胞株生物学行为影响。方法以LipofecTAMINE^TM介导的反义FAK寡核苷酸转染U251人胶质瘤细胞株，用Western blot检测胶质瘤细胞株FAK含量的改变，研究其多种细胞生物学行为的变化。结果脂质体介导FAKODN转染率为85．9％。转染反义FAK后，U251人胶质瘤细胞株FAK表达明显减少。U251细胞生长抑制率为64．52％，侵袭细胞下降至21．7个，细胞周期分析显示s期细胞降至25．16％。细胞凋亡率升至34．5％。透射电镜观察到凋亡细胞。结论反义FAK寡核苷酸可显著降低FAK在U251中的表达，降低FAK表达能够显著抑制U251人胶质瘤细胞株侵袭能力，抑制细胞增殖和诱导凋亡。     

黏附分子T-cadherin表达对C6细胞恶性特性的影响

目的 探讨T-cadherin分子表达对胶质母细胞瘤C6细胞的恶性生物学特征的影响。方法 C6细胞分别转染pcDNA3．T-cadherin和pcDNA3表达质粒后。筛选3个表达不同水平T．cadherin的C6克隆和2个不表达T．cadherin的C6克隆，研究T-cadherin分子表达水平对C6细胞的细胞黏附、迁移及聚集能力的影响。结果 与不表达T-cadherin的C6细胞相比．表达T-cadherin的C6细胞在附着后1h和4h时的细胞黏附能力均显著增强，分别增强61．2％和25．1％（P〈0．01），而其细胞迁移能力平均下降72．6％（P〈0．010）。同时，T-cadherin表达诱导显著的同源细胞聚集，聚集指数平均下降52．4％（P〈0．01）。结论 T-cadherin分子表达显著抑制胶质母细胞瘤C6细胞的恶性生物学特性。     

抑制骨桥蛋白表达降低肺癌侵袭和增殖的机制

目的 探讨抑制骨桥蛋白(OPN)表达降低肺癌细胞株A549侵袭、增殖的机制.方法 构建针对人OPN mRNA干扰质粒pENTRTM/U6-INF(pINF-1)及对照质粒pENTRTM/U6-CTR(pCTR),将其转染A549细胞,Western blot测定OPN、基质金属蛋白酶(MMP)和促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白的表达;明胶酶谱检测MMP的表达.结果 与空白对照组(1.20±0.15)比较,转染72 h后pINF-1组OPN蛋白表达(0.15±0.04)下降87%,与对照组比差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot的结果显示,pINF-1组细胞磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)、磷酸化丝裂原细胞外激酶(pMEK)和MMP-2的表达明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);而MMP-9表达差异无统计学意义(P＞0.05).明胶酶谱结果同样表明pINF-1组MMP-2的表达明显下降(P＜0.01).结论 抑制OPN的表达降低肺癌细胞株A549侵袭力和增殖的机制可能与抑制MAPK信号通路和MMP-2的表达有关.

Abstract：

Objective To explore the mechanism of invasion and proliferation of lung cancer cell line A549 mediated by osteopontin. Methods One double-stranded DNA vectors pENTRTM/U6-INF ( pINF-1 ) targeting the mRNA of human osteopontin ( OPN), and the control vector pENTRTM/U6-CTR (pCTR) mismatching with mRNA of OPN were constructed, and then they were transfected into human A549 cells with high metastatic potentials. Western blotting was used to quantify the protein level of OPN,matrix metalloproteinases (MMPs) and mitogen-activated protein kinases (MAPK). The activity of MMPs was detected by gelatin zymography. Parallel experiments were performed in sextuplicate. Results As compared with control group only transfected with LipofectamineTM 2000, OPN protein level in pINF-1 group was decreased by 87% 72 h after transfection (P ＜0. 05), and no significant difference was found in the group transfected with pCTR. Moreover, the expression levels of phosphorylated extracellular signal-regulated kinases 1/2 (pERK1/2), phosphorylated MAPK/ERK1/2 kinase (pMEK) and MMP-2 protein were also decreased in pINF-1 group (P ＜ 0. 01 ). The activity of MMP-2 but not MMP-9 was decreased significantly in pINF-1 group (P ＜ 0. 01 ). Conclusion OPN plays an important role in metastasis as well as tumor growth of lung cancer cells probably through activation of the MAPK pathways and MMP-2.     

靶向Survivin基因的短发卡RNA对U251细胞生长和凋亡的影响

目的观察Survivin基因特异性短发卡RNA（shRNA）对人脑胶质母细胞瘤U251细胞体外生长和细胞凋亡的影响。方法对U251细胞，稳定转染Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251-SR细胞，以及稳定转染空载体pWH1的U251-P细胞。分别采用细胞计数法绘制生长曲线和平板克隆形成实验观察各组细胞的体外生长情况；采用流式细胞术（FCM）定量测定各组细胞的细胞周期和凋亡细胞数量；采用HE染色、Hoechst染色和原位末端标记（TUNEL）方法观察各组细胞形态学特征。结果与U251和U251-P细胞相比，U251-SR细胞生长明显减缓（P〈0．01），细胞克隆形成明显减少（P〈0．01）；U251-SR细胞G1期细胞增多，S期细胞减少，凋亡细胞增加至20．9％，并呈现典型的细胞凋亡形态学改变。结论靶向Survivin基因的特异性shRNA能够在体外明显抑制U251细胞的生长并诱导其发生大量凋亡。