点突变SEA(D227A)的基因构建、原核表达与鉴定

目的：进行点突变的SEA(D227A)基因原核表达载体的构建，并进行表达、分离纯化与鉴定。方法：采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使得到的SEA基因752位碱基突变由A突变为c，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由D(DAT)突变为A(GCF)，构建pRSET：SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行原核表达，再通过Western blot进行鉴定。结果：构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致。成功地构建pRSET-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过IPTG诱导得到分子量约为32kD的蛋白，Western blot显示其能够与抗SEA的单克隆抗体特异性结合，最后采用Ni^2 -NTA柱进行分离纯化。结论：成功地构建SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，为寻找有效低毒副作用的超抗原提供了线索。     

超抗原SEA(D227A)的构建及其免疫活性鉴定

目的 构建SEA(D227A)基因的原核表达载体，并进行表达、分离纯化与免疫活性鉴定。方法 采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使SEA基因第680位碱基由A突变为C，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由天冬氨酸(GAT)突变为丙氨酸(GCr)，构建pGEX-SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌DHSa中原核表达，再通过淋巴细胞增殖实验对其免疫活性进行测定。结果 构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致；成功地构建pGDX-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，通过IPTG诱导、GSTrap FF柱分离纯化及凝血酶切除CST后，得到Mr为27000的目的蛋白。淋巴细胞增殖实验显示，100ng/mL重组SEA(D227A)可明显刺激淋巴细胞增殖。结论 成功地构建了SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，所得重组SEA(D227A)能够刺激淋巴细胞增殖，但作用与野生型SEA相比较温和。该结果为寻找有效、毒副作用低的超抗原提供了线索。     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素基因B的原核表达

目的构建重组pET-30a-SEB原核表达载体,转化感受态大肠杆菌BL-21(DE3),诱导表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcalenterotoxinB,SEB)。方法利用PCR技术从产SEB的金黄色葡萄球菌标准菌株CMCC-26075基因组DNA中克隆SEB全长序列,将其克隆到pGEM-TEasy载体中并进行测序。构建pET-30a-SEB原核表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代β-D半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,经镍离子螯合亲和层析纯化后免疫鉴定。结果PCR获得超抗原SEB基因片段,与克隆载体连接后经测序与文献报道的基本一致;成功构建了pET-30a-SEB原核表达质粒且成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约31×103的蛋白。结论成功克隆了seb基因序列,并进行了原核表达和鉴定,获得了SEB蛋白,为后续对超抗原SEB的进一步研究奠定了基础。     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因转染至肝癌细胞．方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因，将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN—SEA重组质粒，再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞，用RT—PCR和ELISA法鉴定．结果从产SEA标准菌株ATCCl3565中提取并扩增出SEA基因全长片段；SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN，经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致；将pLXSN—SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402，经筛选获得稳定表达的抗性单克隆．RT—PCR扩增出约800bD的基因片段，经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平．结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体，将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL－7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白．     

超抗原SEA抗肿瘤研究进展

超抗原是指一些细菌或病毒编码的蛋白分子，只需极低浓度即可激活大量的淋巴细胞克隆．作为一种强大的T细胞激活剂，超抗原成为肿瘤免疫治疗研究的热点之一．本文对其特性及目前的研究进展作一综述．     

超抗原SEA抗肿瘤研究进展

超抗原是指一些细菌或病毒编码的蛋白分子, 只需极低浓度即可激活大量的淋巴细胞克隆.作为一种强大的T细胞激活剂,超抗原成为肿瘤免疫治疗研究的热点之一.本文对其特性及目前的研究进展作一综述.     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染至肝癌细胞.方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因,将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN-SEA重组质粒,再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞,用RT-PCR和ELISA法鉴定.结果从产SEA标准菌株ATCC13565中提取并扩增出SEA基因全长片段;SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN,经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致;将pLXSN-SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402,经筛选获得稳定表达的抗性单克隆.RT-PCR扩增出约800bp的基因片段,经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平.结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体,将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL-7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白.     

原核表达的葡萄球菌D型肠毒素超抗原的纯化及其促淋巴细胞增殖作用

目的　纯化原核表达的葡萄球菌D型肠毒素 (StaphylococcalenterotoxinD ,SED) ,检测其促淋巴细胞增殖活性 ,为SED免疫识别研究奠定基础。方法　用Ni2 + NTA金属螯合亲和层析法纯化 6×His SED融合蛋白 ,SDS PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度 ,BCA法进行定量 ,以3H TdR掺入法检测纯化的SED对人和小鼠淋巴细胞的促增殖活性。结果　获得可满足后续功能实验纯度较高的蛋白质 ;SED对人淋巴细胞的促增殖作用呈质量浓度依赖关系 ,0 .1μg mL时 ,细胞增殖最明显 ;淋巴细胞的增殖与IL 2分泌水平呈正相关。结论　原核表达的SED具有促人和小鼠淋巴细胞增殖活性     

超抗原SED在大肠杆菌中的表达

目的 构建稳定的SED原核表达系统。方法 采用PCR技术扩增葡萄球菌D型肠毒素（SED）超抗原的成熟蛋白编码区DNA序列，构建SED DNA与6个组氨酸基因融合的表达载体pTrcHis-SED，转入E.coli DH5α，IPTG诱导后，用SDS－PAGE和免疫印迹检测融合蛋白的表达情况。目的蛋白用Ni-NTA金属亲和层析法进行纯化，SDS－PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度。结果 成功构建了原核表达载体pTrcHis-SED。分子量约为28000u的6His-SED融合蛋白可在E.coli DH5α中稳定表达。Ni-NTA金属亲和层析后得到纯度较高（＞95％）的SED融合蛋白，且具有免疫学活性。结论 本研究为SED免疫识别研究奠定了实验基础。     

超抗原-SE抗肿瘤作用的研究进展

葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal entero-toxin，SE)是一种外源性超抗原，仅需微量即能高效地刺激T细胞增殖，促使其产生大量的细胞因子及细胞毒作用，提高机体总体细胞免疫水平，达到抗肿瘤的能力。体外细胞水平和动物体内的研究结果表明：SE能够产生强大的杀伤和抑制肿瘤细胞效应，是一种很有前途的新型肿瘤免疫治疗剂。目前已开始应用于肿瘤病人的治疗及对肿瘤病人在进行放化疗时保护机体白细胞降低以及防止其他毒副反应的发生。     

恶性疟原虫信号肽肽酶原核表达载体的构建及融合表达蛋白的鉴定

目的构建恶性疟原虫PfSPP基因pMAL-p2x的原核表达载体,并鉴定表达,为其功能研究奠定基础。方法体外培养恶性疟原虫（3D7株和FCR3株）,提取虫体总RNA,进行反转录后,采用RT-PCR扩增PfSPP的全编码区基因,将其克隆入原核表达载体pMAL-p2x,PCR、双酶切鉴定重组质粒,并进行序列测定,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌进行表达获得MBP-PfSPP融合蛋白,采用Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pMAL-PfSPP,转化菌经诱导表达出分子量约为77 000Mr的MBP-PfSPP融合蛋白,抗MBP多克隆抗体可特异性地识别表达的融合蛋白。结论成功表达具有多个跨膜结构的膜蛋白PfSPP,从而为深入研究PfSPP的酶活性及生物学功能奠定基础。     

葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定

 目的：构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法：采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段，T-A克隆后测序，构建SEA基因原核表达系统pET32a-SEA-E.coliBL21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量，Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID₅₀法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC₅₀值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用。结果: 与公布的相关序列比较，所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC₅₀为3.14 μg。1.0-20.0 mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P<0.05）。5.0-20.0 mg/L rSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P<0.05）。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的 克隆葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b（＋）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrap^TM chelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。     

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的：克隆结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)基因，并在大肠杆菌中表达。方法：利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因，并将其克隆到pUC19中，进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX—TBhsp70，在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实，与GenBank公布的序列一致。含pGEX-TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，能够表达相对分子质量(MR)约为96000的融合蛋白。结论：获得了TBhsp70基因，成功地构建了原核表达质粒pGEX-TBhsp70，并在大肠杆菌得到表达，为其相关研究奠定了一定的基础。     

超抗原葡萄球菌肠毒素与抗人大肠癌单链抗体ND-1 scFv融合基因的构建、表达及活性分析

目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化。间接免疫荧光法检测融合蛋白的靶向结合活性,MTT法检测靶向杀伤效率。结果:成功构建了融合基因ND-1scFv/SEA,实现功能性表达,纯化的ND-1scFv/SEA融合蛋白与表达有ND-1相应抗原的大肠癌细胞CCL-187有高度亲和活性,通过激活外周血单核细胞,可特异性杀伤靶细胞,在4μg/mL浓度下对CCL-187的杀伤率达到91%,明显优于SEA的杀伤活性。结论:融合蛋白ND-1 scFv/SEA对大肠癌细胞CCL-187具有靶向结合和杀伤活性,为SEA用于靶向性的大肠癌治疗奠定了基础。     

CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:获得原核表达的新的肿瘤抗原CML66蛋白,并制备兔多克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术从睾丸中获得cML66的cDNA,亚克隆至pGEMT载体中,经测序确证后,将该基因插入原核表达载体pET32b( )中,通过电穿孔技术转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2 亲和柱层析纯化。通过SDS-PAGE、Westernblot鉴定后,应用纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:获得的CML cDNA序列与GenBank登录的cDNA序列 一致。用纯化的目的蛋白免疫家兔后,获得高滴度的特异性兔抗血清。结论:成功地克隆CML66基因,建立了原核表达、纯化体系。制备纯化的CML66蛋白和高滴度、特异的兔抗血清。     

幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段原核表达载体的构建和表达

目的 构建幽门螺杆菌（Hp)vac A基因片段原核表达载体并进行表达。方法 采用PCR技术,扩增Hp vac A基因的1个片段B,并克隆入pGEM－3Zf(-)质粒。测序正确后,再克隆入质粒pRSETA中,构建重组表达载体pRSETA-B。结果 经过转化E.coli BL21 DE3(plysS)后,诱导表达出相对分子质量（Mr)为33000的蛋白。SDS－PAGE分析显示,表达量占全菌总蛋白质的47．8％。清中目的蛋白占全菌总蛋白的10．9％。ELISA和Western blot分析表明,表达蛋白能与免抗Vac A多抗结合。结论 成功地构建原核表达载体pRSETA-B,为进一步探讨该片段的生物学活性,以及临床上通过检测患者血清预测Hp的感染提供了实验依据。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达

目的 克隆肿瘤抗原MAGE-3基因3’端657bp片段，对其编码的蛋白羧基端97-314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE-3基因全长cDNA的pUC19／MAGE-3质粒中经聚合酶链式反应(PCR)扩增3’端657bp片段，并克隆入pGEX-4T-1载体，构建重组原核表达质粒pGEX／MAGE-3，对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19／MAGE-3重组质粒中扩增获得一条约660bp的条带，测序结果表明与GenBank公布的MAGE-3序列一致，成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基-β-半乳糖苷(Isopropyl—beta—D—thiogalactopyranoside，IPTG)诱导后表达Mr为54000的谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferse，GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的28％。结论 成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，获得了MAGE-3蛋白羧基端97～314aa融合蛋白，为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。