弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a( ),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达,对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31．58％。经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原（rSAG1）能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒。     

重组弓形虫SAG1蛋白免疫小鼠抗弓形虫攻击保护作用

目的 评价重组弓形虫表面抗原1(rTgSAG1)蛋白皮下免疫小鼠诱导的免疫应答及抗弓形虫攻击的保护作用. 方法 6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为5组,分别以100 μl PBS、20 μg、40 μg、60 μg或80 μg rTgSAG1(溶于100 μl PBS)/只皮下注射免疫小鼠3次,间隔14 d.末次免疫后14 d,以RH株弓形虫速殖子1×104个/只灌胃攻击所有小鼠,每日观察小鼠健康状况.攻虫后第28天,处死小鼠.分离并计数肝和脑组织内速殖子,分离并计数脾淋巴细胞和小肠上皮内淋巴细胞(IEL),ELISA法检测血清IgG和小肠冲洗液IgA抗体水平. 结果攻虫后6-14 d,小鼠出现不同程度的被毛粗糙、采食饮水减少,PBS组存活率最低(33.3%),40 μg组最高(75%).40 μg组肝(79.60)和脑组织内荷虫数(16.88)低于PBS组(分别为94.43和19.48)(均P<0.05),脾淋巴细胞数(10.31)和IEL数(4.25)高于PBS组(6.24,1.64)(均P<0.01);40 μg组(P<0.01)、20 μg组和60 μg组(P<0.05)血清IgG抗体水平显著高于PBS组;各组肠液IgA抗体水平无明显变化. 结论 rTgSAG1蛋白皮下免疫小鼠能诱导产生抗弓形虫感染保护性免疫,40 μg为免疫的最适剂量.     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

弓形虫SAG1 ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究

1　前　言刚地弓形虫是一种机会性致病原虫 ,寄生于宿主的细胞内 ,在机体免疫力下降的情况下 ,弓形虫大量增殖 ,可导致组织器官的损伤 ,引起弓形虫病。该病呈世界性分布 ,是严重危害人畜健康的寄生虫病之一。孕妇感染弓形虫后可导致早产、流产、胎儿发育畸形。此外 ,弓形虫病也是免疫功能严重低下患者 (如ＡＩＤＳ病人等 )的主要死亡原因。弓形虫病疫苗的研制一直是国内外专家关注的热点。已有研究表明 :采用死的弓形虫疫苗可以诱导体液免疫及Ｔｈ细胞的免疫应答 ,免疫原性低 ;减毒的弓形虫活疫苗存在虫株毒力恢复的潜在危险 ;基因工程疫苗…     

小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体

 目的 制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,用于早期弓形虫感染的抗原检测。方法 用弓形虫RH株重组抗原SAG1进行常规免疫结合小鼠脾内免疫,杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性克隆,经亚克隆建株。诱生腹水法制备抗体,protein-G亲合层析法进行纯化,测定其亚类、效价;Western blot法分析其特异性;夹心-ELISA法检测抗体的敏感性及特异性;检测弓形虫感染小鼠血液循环抗原,同时用PCR法检测弓形虫B1基因并比较结果。结果 获得2株抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体3B6、10C4,抗体均为IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫天然的和重组的SAG1抗原。3B6、10C4敏感度分别为31.3 ng和62.5 ng,与血吸虫病、钩虫病及疟疾患者血清均无交叉反应。弓形虫早期感染检测PCR及ELISA法阳性检出率分别为63.2%、47.4%。结论 成功制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,初步用于早期弓形虫感染诊断。     

弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体构建方法探讨

目的 探讨构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的方法，为建立基因敲除弓形虫基因突变株打下基础。方法 用PCR方法扩增弓形虫SAG3基因同源序列，将所获得的1．53kb和2．81kb序列连接克隆插入TUB5／CAT质粒中，构建置换型打靶载体，采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果 将SAG3基因中1．53kb和2．81kb两个同源序列分别插入TUB5／CAT质粒中，构建了弓形虫RH株5’SAG3-TUB5／CAT-3’SAG3置换型载体，经鉴定所获得的打靶载体结构准确。结论 建立了弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体，并获得了弓形虫RH株SAG3基因置换型打靶载体，为分析弓形虫基因功能提供了可行的方法。     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

弓形虫SAG1-GRA1复合基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的:构建弓形虫SAG1-GRA1复合基因真核表达重组质粒,并观察其在小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3细胞中的表达.方法:采用聚合酶链反应(PCR)法分别扩增弓形虫SAG1和GRA1基因片段,导入质粒载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-SAG1和pcDNA3.1(+)-GRA1,继而...     

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段，并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法 利用，VcoI、HindⅢ双酶切，从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段，并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中，构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E．coli BL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni—NTA agarose纯化后，Western—blotting分析其免疫反应性。结果 成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1，通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白，相对分子质量40000，Western—blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性，ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段，表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别，有望成为一种有价值的诊断抗原。     

弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达

目的：克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段，为下一步表达蛋白纯化奠定基础方法：将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α，转化大肠杆菌B121(DE3)，37℃、IPTG诱导表达，SDS—PAGE分析表达产物结果：成功构建重组质粒pET32α—SAG1，经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白，SDS—PAGE分析表达产物分子质量约44kDa，结论：弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32α/BL21(DE3)中获得成功表达，为下一步表达蛋白纯化提供试验依据。     

弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达

目的：分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法：在5′端和3′端引物分别引入EcoRI和SpeI酶切位点，PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因，定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中，构建不带6个组氨酸尾序列的重组质粒。重组质粒被PacI酶切下表达盒，氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16，通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子，并利用MM／MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式。筛选甲醇利用野生型的重组酵母，用甲醇诱导表达，并分析SAG1的表达水平，从中筛选高表达转化子。结果：获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株。在甲醇诱导后第3天，细胞裂解液SDS－PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带，但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少，而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少。上清中有40kDa和27kDa的两种蛋白，后的量大于前，并与SAG1成熟肽的大小一致，PMD16株的表达量大于PMD11株，总蛋白量约35μg/ml。结论：弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达，但PMD11宿主菌会降解外源蛋白，而缺失了蛋白酶的PMD16宿主菌能比较高效地表达、分泌SAG1成熟蛋白。     

三种表达形式的SAG1基因对小鼠的免疫效果观察

目的 构建了三种表达形式的弓形虫主要表面抗原（SAG1）基因-表膜型,分泌型和细胞内型,并分别用于免疫BALB/C小鼠。结果 SAG1基因免疫小鼠后,表膜型和分泌型较细胞内型体液免疫出现早且反应强;细胞因子水平测试显示免疫后小鼠免疫后应趋向Th1型。攻击感染结果证实;表膜型和分泌型免疫小鼠较细胞内型免疫小鼠所获保护力强。结论 三种表达形式的SAG1基因的小鼠模型中免疫效果不同。     

弓形虫SAG1的高密度发酵表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程.方法 利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、Sephadex G-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Western blotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓形虫抗体的敏感性与特异性.结果 高密度发酵诱导4 h后工程菌液的OD600达到20.21:平均每升发酵液可收获工程菌26.10 g;目标蛋白的表达量占菌体蛋白的25.82%;经Ni-NTA、Ni-NTA联合Sephadex G-75及Ni-NTA联合切胶纯化的rSAG1蛋白纯度分别为72.36%、98.54%和97.39%;Western blotting结果显示联合纯化的rSAG1与弓形虫免疫兔血清晕单一反应条带,与正常兔血清未出现反应带;Ni-NTA联合Sephadex-G75纯化的rSAG1对25例感染小鼠血清和38例抗体阳性患者血清的检出率分别为96%和94.7%.结论 利用高密度发酵技术高效表达、Ni-NTA联合Sephadex G-75纯化的rSAG1具有较高纯度和良好的免疫反应性,该工艺可以用于rsAG1抗原的批量生产.     

弓形虫核酸（DNA）免疫系列研究

 本系列研究筛选了弓形虫（Toxoplasma）速殖子表膜主要抗原（SAG1或P30）及分泌排泄抗原棒状体蛋白基因（ROPl），并将二者拼接构建复合基因（sAG1／ROP1），对其进行扩增、克隆、表达，制备真核表达质粒，接种小鼠，研究其免疫保护效应，为弓形虫核酸疫苗的研制提供有积极意义的科学根据。     

弓形虫表面抗原SAG2重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希氏菌（E．coli）中表达弓形虫表面抗原2（SAG2）,纯化制备重组蛋白rSAG2。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫基因组中扩增出SAG2编码基因片段,以pMD-18T质粒作TA克隆,序列测定后亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,并转化E．coliJMl09感受态菌,IPTG诱导表达rSAG2蛋白,重组rSAG2蛋白采用B—PER谷胱甘肽巯基转移酶（GsT）融合蛋白纯化试剂盒纯化并进行SDS—PAGE与免疫印迹（Western—blot）鉴定。结果SAG2编码基因扩增片段大小为469bp;测序结果显示,克隆的SAG2基因序列与GenBank中弓形虫RH株的同源序列（序列号GI：161925）完全一致;所诱导表达的含GST的融合rSAG2蛋白大小约43kDa,纯化后的rSAG2经SDS—PAGE电泳显示一条纯化条带;蛋白免疫印迹结果显示rSAG2能够被兔弓形虫感染血清所识别。结论在大肠埃希氏菌中融合表达了弓形虫SAG2重组蛋白,纯化的rSAG2蛋白具有一定的免疫活性。