Der p2重组胞壁型E.coli-BCG穿梭表达载体的构建和鉴定

目的：构建能够携带外源蛋白-屋尘螨抗原(Der p2)基因并能在脑壁表达的E.coli-BCG穿梭载体。方法：用PCR技术，从结核分支菌毒株H37Rv基因中，扩增结核分支杆菌19kDa抗原的脑壁区及其上游调控元件(19—ss)基因，并克隆人含有Der p2基因的c穿梭载体POLYC中。用间接免疫荧光染色法，检测该载体能够携带并表达的Der p2基因在牡牛分支杆菌宿主中表达。结果：经测序证实，所克隆的19-ss基因序列正确。所构建的含有19-ss基因的E.coli-BCG穿梭载体(pCW)能完成在大肠杆菌和牡牛分支杆菌细胞之间的穿梭，并介导抗生素抗性基因表达。经免疫荧光检查，外源基因Der p2以脂蛋白的形式表达于分支杆菌宿主的表面。结论：成功地构建了以脑壁嵌合形式表达外源蛋白的E.coli-BCG穿核载体。     

结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建与鉴定

结核分枝杆菌感染人体后主要寄生在宿主巨噬细胞内,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白( small heat shock proteins,sHSPs) Hsp16.3是其在宿主巨噬细胞内生存繁殖所必需的蛋白质,已有研究表明Hsp16.3与结核分枝杆菌的潜伏感染关系密切,本研究利用基因敲除技术构建了结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因打靶载体,为进一步敲除结核分枝杆菌Hsp16.3基因( hspX,Rv2031C),并为研究Hsp16.3基因的功能及探讨结核病的防治提供可行的研究方法.     

分枝杆菌膜锚定表达载体的构建与亚细胞定位分析

目的 构建分枝杆菌膜锚定表达载体,并分析外源目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位.方法 在分枝杆菌胞内表达载体pMFA42的基础上进行改造,人工合成结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)相对分子质量(Mr)为19×103的脂蛋白膜分泌信号序列,将其插入高效的突变型 furA基因启动子(...     

真核表达载体pCMV-(Kozak)TFPI的构建及其在内皮细胞中的表达

目的构建真核表达载体pCMV-(Kozak)TFPI并检测其在内皮细胞中的表达,为冠状动脉旁路移植和经皮冠状动脉内成形术中转染血管内皮细胞抗凝治疗作了实验和理论的探索。方法用RT-PCR的方法提取人组织因子途径抑制因子(TFPI)基因,并引入Kozak序列,将(Kozak)TFPI亚克隆入pCMV质粒中。在阳离子脂质体介导下,转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。RT-PCR、免疫荧光和Western blot检测HUVEC中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达。结果(Kozak)TFPI成功克隆入pC-MV中。RT-PCR、免疫荧光和Western blot检测到外源TFPI基因mRNA和蛋白的表达。结论成功构建了pCMV-(Kozak)TFPI真核表达载体,并表达出相应的蛋白。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3蛋白的原核表达及功能检测

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16．3蛋白的原核表达及功能检测北大核心CSCD

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

pFlag-dlx3载体的构建及在iMDP3中的表达

目的构建真核表达载体p Flag-dlx3,并将其转染成牙本质样细胞株i MDP3,检测外源dlx3基因在i MDP3细胞内的表达。方法提取新生小鼠牙髓总RNA,RT-PCR扩增Dlx3目的基因片段,并将该片段克隆至PCR-TopoⅡ载体中;经鉴定正确后目的基因与表达载体p Flag-CMV连接;Lipofectamin 2000介导重组质粒p Flag-dlx3转染i MDP3;Western-blot鉴定外源性dlx3在细胞内的表达。结果重组p Flag-dlx3质粒经酶切、测序鉴定正确;i MDP3细胞内检测到外源dlx3蛋白的表达;转染p Flag-dlx3组dlx3蛋白的表达量显著高于正常组。结论成功构建真核表达载体p Flag-dlx3,且外源dlx3基因可在i MDP3细胞内过表达。     

结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究

目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用.方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数.提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化.结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P＜0.05).结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成.     

分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin真核表达载体的构建及杀菌试验

目的构建分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin融合蛋白真核表达载体, 通过细胞感染模型研究其在胞内对结核分枝杆菌的杀伤效果。方法构建原核重组质粒pET32a-LysinB并诱导表达, 纯化蛋白后制备多克隆抗体;构建真核重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin并转染进单核巨噬细胞RAW264.7, 经制备的LysinB多克隆抗体进行表达鉴定后, 建立细胞感染模型并通过抗酸染色和菌落计数检测LysinB/Holin融合蛋白的杀菌效果。结果成功制备LysinB的多克隆抗体。重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin在真核细胞中有效表达LysinB/Holin融合蛋白且对细胞无明显毒性。LysinB/Holin融合蛋白可有效杀伤胞内的结核分枝杆菌。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin对胞内结核分枝杆菌有较好的杀伤效果, 且对细胞无明显毒性, 具有治疗结核病的潜能。     

结核分枝杆菌融合蛋白和分泌蛋白对人肝癌细胞HepG-2影响和作用

目的探讨结核分枝杆菌融合蛋白对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用。方法构建含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hsp16.3,分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种蛋白,纯化后复性。分别作用于肝癌细胞HepG-2,MTT法检测细胞生长情况。结果成功纯化并复性三种蛋白。MTT实验结果显示,三种蛋白均对HepG-2细胞的生长具有抑制作用,抑制强度与蛋白终浓度和作用时间相关,但各蛋白的抑制作用无明显差异。结论结核分枝杆菌的部分分泌蛋白对肝癌细胞HepG-2具有抑制作用。     

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的：克隆结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)基因，并在大肠杆菌中表达。方法：利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因，并将其克隆到pUC19中，进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX—TBhsp70，在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实，与GenBank公布的序列一致。含pGEX-TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，能够表达相对分子质量(MR)约为96000的融合蛋白。结论：获得了TBhsp70基因，成功地构建了原核表达质粒pGEX-TBhsp70，并在大肠杆菌得到表达，为其相关研究奠定了一定的基础。     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

抗CEA嵌合小分子抗体的构建与表达

目的 构建表达抗CEA小分子抗体,以利于放射免疫诊断及导向治疗。方法 构建CEA单链抗体基因,克隆入载体pKpL-3a,在大肠杆蓖中包涵体表达,ELISA检测活性,将轻重链基因克隆入分泌型表达载体pSCMH,在大肠杆菌中表达。ELISA检测活性,钭CEA嵌合抗体的轻链和Fd基因克隆入杆状病毒表达载体pAcUW51中,在sf9细胞中分泌表达,ELISA检测活性及测定产量,竞争抑制ELISA测定其识别的抗原表位。结果 多种方法复性的包涵体及原核分泌表达的单链相同的表位。结论 该CEA抗体基因在大肠杆菌中不能表达出有功能的分子。而在昆虫细胞中表达了具自学成才性抗体分子,某些抗体基因只有在真核细胞中才能表达出有功能的抗体分子。     

粉尘螨第五组主要变应原（Der f5）的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第五组变应原（Dermatophagoides farinae,Derf5）基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法提取活粉尘螨总RNA,扩增Derf5片段,PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a（＋）连接,转化入大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果,Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性。结果构建了重组质粒pMD18-Derf5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符,纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性。结论获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白,初步鉴定了该蛋白的免疫原性。     

肝癌相关抗原HAb18G真核表达载体的构建及表达

目的 在真核细胞中高效表达肝癌相关抗原ＨＡｂ１８Ｇ。方法 构建含有肝癌相关抗原Ｈｂ１８Ｇ基因的真核表达载体,并经限制性酶切及部分序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染ＣＯＳ－７细胞和ＣＨＯ细胞,并分别进行瞬时及稳定表达;通过间接免疫荧光染色和流式细胞仪检测蛋白的表达情况。结果 成功地构建了真核表达载体ｐｃＤＮＡ－３／ＨＡｂ１８Ｇ,并经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。间接免疫荧光     

HBV靶向核糖核酸酶真核表达载体的构建及其在2.2.15细胞内的表达

目的 构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素（hEDN)与乙肝病毒核心蛋白（HBVc)的融合真核表达载体（该融合蛋白即为构建的靶向核糖核酸酶），抑制乙肝病毒在细胞内的复制。方法 分别从HL－60GGG细胞和2．2．15细胞中提取总RNA，用RT－PCR特异性扩增hEDN及HBVc编码基因，将hEDN和HBVc克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),hEND克隆入原核表达载体pGEX4T-1，并以纯化的原核表达产物免疫Balb/c小鼠，制备特异性抗体。用免疫荧光法检测pcDNA3.1(-)/HBVc-hEDN在转染2．2．15细胞内地表达。结果 成功地构建了hDNA和HBVc的真核融合表达载体。，并在2．2．15细胞中较高效地表达。结论 pcDNA3.1(-)/HBVc-hEDN的构建和在2．2．15细胞内的表达，为探索乙型肝炎的治疗开辟了新思路。     

梅毒螺旋体TpN15抗原基因的扩增、克隆及表达

目的用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原,为进一步研制梅毒预防性疫苗和诊断试剂盒打下基础.方法采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因,然后克隆到原核表达载体pET28b中表达TpN15重组抗原蛋白.结果成功的构建了pET28b-TpN15重组表达载体,重组的TpN15蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达.结论梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为建立梅毒血清学诊断的新方法奠定了基础.     

人CD20跨膜区与g3pN端融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建g3pN1 hCD2 0跨膜及胞外区基因表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效融合表达。方法 :利用反转录PCR和PCR方法 ,分别从Daudi细胞和M13K0 7噬菌体中扩增hCD2 0基因和编码g3pN1蛋白N1端的基因 ,并重组到pTIG Trx表达载体中 ,在大肠杆菌中融合表达。结果 :表达产物可被抗CD2 0分子的单克隆抗体 (mAb)识别。结论 :成功地表达并鉴定了目的蛋白。     

结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究

目的在重组分枝杆菌中表达编码人结核杆菌（ＴＢ）热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）的ＤｎａＫ基因，并观察其对小鼠的免疫效应。方法采用基因工程和免疫学技术将ＤｎａＫ基因及其两侧的表达调控区一起从质粒ｐＭＴ－７０中切出，经末端修饰后装入大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，构建成新的重组质粒ｐＢＣＧ－ＴＢ７０，并用以转化耻垢分枝杆菌及大肠杆菌，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的ＨＳＰ７０；以重组耻垢分枝杆菌分别经皮下及腹腔免疫小鼠，用淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力，以ＮＯ法检测巨噬细胞吞噬活性，并检测血清中特异性抗ＴＢＨＳＰ７０的抗体。结果ＴＢＨＳＰ７０能在分枝杆菌中表达，表达量占菌体总蛋白量的１０％，不能在大肠杆菌中表达；重组耻垢分枝杆菌以１０６ＣＦＵ的剂量经皮下免疫小鼠后，可使小鼠脾淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）和腹腔巨噬细胞吞噬活性增高（Ｐ＜０．０５），并能刺激机体产生特异性抗ＴＢＨＳＰ７０的抗体，腹腔免疫激发的抗体滴度较皮下免疫为低，而ＳＩ无明显改变。结论构建的表达质粒ｐＢＣＧ－ＴＢ７０能在耻垢分枝杆菌中表达ＨＳＰ７０，该重组菌具有较强的免疫原性。