再生障碍性贫血造血细胞Fas抗原表达与T淋巴细胞功能的研究

目的 研究造血细胞凋亡与T淋巴细胞免疫在再生障碍性贫血(再障，Aplastic anemia，AA)发病机制中的作用及两者相关性。方法 采用流式细胞仪测定40例AA患者和15例非血液、免疫系统疾病对照者骨髓单个核细胞(BMMNC)的总CD34^ 、CD34^ Fas^ 、CD34^ Fas^-、CD3^ 、CD8^ 、CD3^ 、CD3^ CD25^ 标记值。结果 (1)与对照组比较，AA组总CD34^ 细胞％明显减少而其Fas表达率(以占总CD34^ 细胞％为计)明显增高。(2)AA组CD34^ 细胞％数与其Fas抗原表达率无明显负相关。(3)AA组T细胞％明显增多，且以CD8^ 细胞和CD3^ CD25^ 细胞增多为主。(4)AA组CD34^ 细胞％数与其T细胞活化状态无显著负相关。(5)AA组CD34^ 细胞Fas表达率与其T细胞活化状态无显著正相关。结论 AA骨髓存在着造血细胞数量减少和T淋巴细胞亚群数量、功能的异常，造血细胞数量减少还可能与Fas以外途径诱导的凋亡过度有关。骨髓造血细胞凋亡过度可能有活化T淋巴细胞免疫以外的途径诱导Fas途径或活化T淋巴细胞可以通过Fas之外的途径诱导造血细胞凋亡。     

FasL基因修饰骨髓树突状细胞诱导小鼠心脏移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨FasL基因转染骨髓来源树突状细胞术前免疫受者在诱导同种小鼠心脏移植耐受中的作用.方法:采用腺病毒载体将FasL基因转染骨髓来源树突状细胞,将基因修饰的DC经尾静脉输入预处理BALB/c受者小鼠,观察移植心脏的存活时间,通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原特异性T淋巴细胞的低反应性.结果:AdFasL-DC组移植心脏存活期为21.5±2.5天,Day-7-DC和LacZ-DC处理组移植心脏存活时间为9.5±1.5天和10.0±2.0天,FasL-DC术前免疫受者可使同种移植物存活时间明显延长(P＜0.05);MLR结果显示FasL-DC处理组与对照组相比显著地抑制了T淋巴细胞的增埴(P＜0.05).结论:FasL基因转染DC能够诱导同种反应性T淋巴细胞凋亡,术前免疫受者能使同种移植物存活时间得到延长.     

体外扩增造血细胞重建小鼠造血功能的实验研究

目的 探讨体外扩增造血祖儿定向诱导功能血红细胞生成的条件及扩增细胞重建长期造血能力的维持。方法 应用免疫磁珠法（ＭＡＣＳ）分离纯化脐带血ＣＤ３４＾＋造血干或祖细胞,在体外液体培养体系中经不同细胞因子的组合进行扩增和定向诱导,并将扩增细胞移植经亚致死剂量照射的ＳＣＩＤ小鼠。结果 ＦＬ、干细胞因子血小板生成素（ＴＰＯ）等细胞因子的不同组合可分别扩增细胞总数、粒系及巨核系造血祖细胞、ＣＤ３４＾＋ＣＤ３８     

诱导小鼠同种异体反应性T细胞凋亡

通过FasL-Fas途径诱导小鼠同种异体反应性T细胞(alloreactive T cells,ARTC)凋亡,为减轻异基因骨髓移植(allo-BMT)后的移植物抗宿主病(GVHD)探索新的手段.采用磁性细胞分离系统(MACS)分离BALB/c小鼠(H-2d)干细胞抗原(Sca)-1+早期造血细胞(early hematopoietic cells,EHC),然后与经丝裂霉素C去增殖的能产生高滴度表达mFasL假病毒的逆转录病毒包装细胞(PA31 7)共培养,进行mFasL cDNA基因转移;用含干细胞因子(SCF)、白细胞介素-3(IL-3)和白细胞介素-6(IL-6)的完全培养基培养1周后,借助PCR、RT-PCR、FCM技术检测外源mFasLcDNA在扩增的造血细胞(HC)中的整合与表达效率;或与异基因BAC小鼠(H-2dxb)脾细胞进行单向混合淋巴细胞培养(OWMLC),6 d后用Annexin V/PI标记和FCM检测BAC脾细胞凋亡.结果显示用MACS法成功分离出BALE/c小鼠Sca-l+EHC(1×105个/只),纯度为(89.0±6.1)%;经逆转录病毒法对它进行外源mFasLcD-NA转染并扩增1周后,细胞总数达2×106个/只;基因组DNA PCR和RT-PCR证实HC整合有mFasL cDNA和Neor基因,并表达外源基因mRNA;FCM发现mFasL+HC占(43.9±5.6)%,而用表达NeOr的假病毒转染HC,其FasL阳性率仅为(2.7±1.3)%(P＜0.01);高表达mFasL的HC与异基因BAC小鼠脾细胞进行OWMLC 6 d后,(51.9±4.7)%细胞发生凋亡,而低表达mFasL HC与BAC脾细胞共培养,其凋亡率为(19.6±4.3)%(P＜0.01).提示体外反应中,转染外源mFasL cDNA并高表达mFasL的HC可诱导小鼠同种异体反应性T细胞凋亡.     

mFasL基因转移诱导异基因骨髓移植受者获得免疫赦免的实验研究

目的 :通过导入外源FasL cDNA ,诱导异基因骨髓移植物中针对受者MHC的淋巴细胞凋亡 ,从而防止移植物抗宿主病 (GVHD)的发生。方法 :pBillneo mFasL质粒经酶切鉴定后 ,采用脂质体转移法导入Balb c鼠骨髓单个核细胞 (BMNC) ,体外与BAC鼠骨髓移植物混合培养后 ,输注给经致死量照射的Balb c小鼠 ,通过观察受者存活率、GVHD的表现、肠、肝、皮肤病理组织学检查 ,以观察受者鼠GVHD的发生情况 ,同时观察受者鼠的脾结节以了解其造血功能重建。受者鼠骨髓细胞Y染色体分析 ,以查明供者来源的造血干细胞是否植入。结果 :pBillneo mFasL内mFasL cDNA酶切鉴定提示可以按顺序合成出功能蛋白质 ,采用脂质体法传导入BMNC后 ,Westen Blot显示出抗FasL抗体识别的条带。转基因BMNC与BAC鼠脾单个核细胞 (SMNC)混合培养后 ,经流式细胞仪检测 ,SMNC凋亡率明显高于对照组 [(14 .76 %± 0 .36 ) %vs(1.8± 0 .4 2 ) % ,t=3.0 1,P <0 .0 0 1]。骨髓移植 (BMT)后 ,受者GVHD的发生率实验组明显低于对照组 (4 0 %vs10 0 % ,χ2 =6 .0 0P <0 .0 5 )。Y染色体分析 ,提示有供者来源的造血干细胞植入并增殖活化。移植 10d后受者即有脾结节形成 ,2 0d达正常水平。结论 :采用脂质体转移法 ,能将mFasL cDNA转入鼠BMNC并能有效地表达 ,转基因     

外源性mFasL-cDNA基因干预后骨髓造血细胞功能的实验研究

目的:探讨FasL基因转移后造血细胞活性是否到影响,骨髓移植(BMT)后受者骨髓造血功能是否受改变。方法:FasL-cDNA经鉴定后,常规收集BalB/c小鼠和BAC小鼠股骨和胫骨骨髓单个核细胞(BMMNC),采用脂质体转移法将FasL基因转入BalB/c小鼠BMMNC,然后按1∶0.625体外与BAC鼠BMMNC混合培养,6d后实验组(第3组)尾静脉输注给经致死量照射的BalB/c小鼠,同时设立:第1组(空白对照组即未移植细胞);第2组(未转染基因BalB/c鼠BMMNC+BAC鼠BMMNC);第4组(同基因BMT组)。观察移植后受者鼠造血功能及细胞来源,移植物抗宿主病(GVHD)及生存率。结果:BMT后10,20d,第4组白细胞及血小板计数明显高于第2、3组(P<0.01);第2、3组间差异不显著(P>0.05);30d,各组间均无显著性差异(P>0.05);第1组小鼠相继于1周内死亡,死亡后取脾观察未见脾结节形成。第2组、第3组存活的11只雌性BalB/c小鼠BMMNC中,Y染色体出现率为(79.35±6.77)%。第2组、第3组、第4组2月生存率分别为30%、80%、100%。第3组生存率明显高于第2组(P<0.01),与第4组无显著差异(P>0.05)。第3组少数及第2组中大部分鼠移植30d出现GVHD表现,两组死亡鼠及第2组存活鼠组织因子改变符合Ⅱ-Ⅲ度GVHD病理变化,第3组存活7只鼠中有Ⅰ度GVHD病理变化。结论:转基因自体造血细胞与异基因供体BMMNC混合培养后移植,能使受者获给供体来源的造血重建,并明显降低GVHD发生。     

小鼠不同来源造血细胞移植的实验研究

本文在小鼠不同来源造血干细胞性能研究的基础上,比较了其不同来源造血细胞的移植特性。依据对受体小鼠经致死量照射后的30天存活率观察,表明小鼠同系胎肝移植和骨髓移植的疗效相似;而异系间移植,则胎肝移植疗效优于骨髓移植;在异系间外周血细胞移植,则移植后死亡率明显高于照射对照组。文章同时对小鼠不同来源造血细胞移植疗效差异的机理进行了分析探讨,并认为对今后临床开展造血细胞移植提供了有价值的实验依据。     

脐血造血细胞移植救治放射损伤小鼠的实验研究

用人脐血造血细胞体我扩增后对受骨髓致死量照射的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠进行移植，结果，移植组平均存活率为９０％，对照组仅为１０％，存活量骨髓和脾脏内可检测到ＣＤ４５阳性的人源性造血细胞，体外祖细胞集落培养有人源性髓系和红系集落形成，结论，脐血造血细胞可帮助恢复急性重症放射损伤骨髓的造血重建。     

γ射线照射后小鼠骨髓造血细胞凋亡及Fas表达的研究

目的：研究γ射线照射后小鼠骨髓造血细胞凋亡及其与Fas 表达的关系。方法：采用电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术观察小鼠经60Co γ射线照射后不同时间的骨髓造血细胞凋亡及Fas的表达情况。结果：在照射后4 h细胞即出现核固缩、染色质凝集;DNA琼脂糖凝胶电泳有大量的小分子片段,呈典型“梯状”图谱;流式细胞术分析表明,凋亡细胞百分率在照射后4 h明显增加,8 h达到高峰;照后4 h,Fas表达显著增强。结论：γ射线照射后可引起骨髓造血细胞凋亡,Fas可能参与了辐射诱导的造血细胞凋亡过程。     

基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外实验

目的 探讨体外基因转移Fas配体（Fas-ligand,FasL)对人恶性黑色素瘤细胞凋亡的影响。方法 用携带人FasL,cDNA的缺陷型重组腺病毒载体（Ad-FL)，在体外转导两株黑色素瘤细胞，并使其表达；通过流式细胞仪，RT－PCR法进行Fas/FasL表达检测，TUNEL法及荧显微镜相关凋亡检测，分析，结果 流式细胞仪和RT－PCR检测两株黑色素瘤细胞表面均表达Fas，不表达FasL，而Ad-FL转导的两株黑色素瘤细胞均能表达FasL，Ad-FL能显著诱导两株黑色素瘤细胞在体外凋亡或抑制其生长。结论 重组腺病毒FasL在体外诱导人黑色素瘤凋亡效果显著。     

用胚胎干细胞诱导的造血干/祖细胞重建小鼠造血功能研究

目的 胚胎干细胞体外诱导分化出现CD34^ 造血干/祖细胞，然后将其注射入致死量照射小鼠体内，以研究其重建造血功能。方法 胚胎干细胞自由分化形成胚胎体后，加入造血刺激因子混合液以诱导产生CD34^ 造血干／祖细胞，将这些造血干／祖细胞注射入经致死剂量照射的小鼠，观察小鼠存活率的改变，并取存活2个月的小鼠骨髓和脾脏，PCR检测嵌合体形成。结果 体外分化第13日CD34^ 造血干／祖细胞比例可高达17．36％，将这些细胞注射入致死量照射小鼠后，可提高存活率达86．67％，存活小鼠的骨髓和脾脏均检测到供体来源的细胞。结论 胚胎干细胞体外分化获得CD34^ 造血干/祖细胞，且后者具有其相应的正常生物学功能。     

HLA配型不合造血干细胞移植治疗血液病

目的 评价亲缘人类白细胞抗原(HLA)配型不合造血干细胞移植(HSCT)治疗血液病的疗效和并发症.方法 对12例血液病患者进行了亲缘HLA至少1个位点不合的HSCT.预处理分别采用改良Bu/Cy ATG、Flu Cy ATG、Flu Bu ATG、Ara-C Bu Flu ATG方案.采用环孢素A(CsA)、短疗程甲氨蝶呤(MTX)、霉酚酸酯(MMF)的三联方案预防急性移植物抗宿主病(aGVHD),对2例患者加用了CD25单抗.结果 患者移植后造血均顺利恢复,除1例骨髓增生异常综合征伴骨髓纤维化患者植入失败自身恢复外,均达完全供者型植入.10例发生aGVHD(10/12),其中Ⅰ度4例,Ⅱ度3例,Ⅲ度1例,Ⅳ度2例.在可供评价的9例患者中,5例发生慢性GVHD(cGVHD),其中局限型3例,广泛型2例.巨细胞病毒(CMV)感染5例,其中1例为CMV间质性肺炎.死亡4例,其中2例死于肺部感染,1例死于肠道Ⅳ度aGVHD,1例死于多器官功能衰竭.中位随访时间239(72～570) d,7例无病生存,1年预计总生存率(66.7±2.3)%,1年预计无病生存率(58.3±2.2)%,仍在继续随访中.结论 亲缘HLA配型不合HSCT是治疗血液病的有效方法之一,须警惕移植后GVHD及机会性感染的发生.     

ABO血型不合异基因造血干细胞移植与红系造血重建

目的:探讨ABO血型不合对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)患者造血重建,特别是红系造血重建的影响.方法:回顾分析了4例ABO主要不合和8例ABO次要不合的HLA相合的allo-HSCT患者造血恢复情况,着重观察了这两组病人移植后溶血现象、血型转变时间、输注红细胞量以及血红蛋白恢复情况来比较分析其红系造血重建.结果:12例ABO血型不合的allo-HSCT受者在输入造血干细胞悬液时无1例发生急性溶血和输血相关性溶血,主要不合和次要不合对allo-HSCT骨髓植活和血小板恢复均无影响,但主要不合组红系恢复有延迟的趋势,有1例发生迟发性溶血.结论:供受者ABO血型主要不合可能影响红系的造血重建.     

经胎鼠腹腔途径进行人脐血造血干 细胞宫内移植的实验

【目的】探讨经胎鼠的腹腔途径用人脐血造血干细胞进行宫内移植后出现的并发症及移植情况,建立人脐血造血干细胞鼠宫内移植的动物模型,为临床某些遗传性疾病的宫内治疗及脐血的应用研究提供理论基础。【方法】将人脐血单个核细胞注入胎龄15～17d胎鼠的腹腔内,并设阴性及空白对照组,观察手术并发症及妊娠结局,待出生后1个月及2个月,分别用流式细胞仪和免疫组化检测移植情况。【结果】小鼠外周血中检测到逐渐增加的人CD     

干细胞因子与白介素-3联合对小鼠骨髓细胞体外扩增作用及其造血重建的影响

采用集落培养的方法研究了干细胞因子（ Ｓ Ｃ Ｆ） 联合白介素 ３（ Ｉ Ｌ ３） 对小鼠５ 氟尿嘧啶（５ Ｆ Ｕ ） 处理３ ｄ 的骨髓细胞（ｄ３ ５ Ｆ Ｕ Ｂ Ｍ Ｃ） 的体外扩增作用及其对致死量照射小鼠造血重建功能的影响。 Ｓ Ｃ Ｆ 单独应用使体系中粒 巨噬细胞集落形成单位（ Ｇ Ｍ Ｃ Ｆ Ｕ） 和高增殖潜能集落形成单位（ Ｈ Ｐ Ｐ Ｃ Ｆ Ｕ） 分别增加了（２４ ．２ ±６ ．１） 和（１ ．５ ±０ ．３） 倍（ Ｐ＜ ０ ．０５） 。 Ｓ Ｃ Ｆ 与 Ｉ Ｌ ３ 联合应用时 Ｇ Ｍ Ｃ Ｆ Ｕ 和 Ｈ Ｐ Ｐ Ｃ Ｆ Ｕ 分别是新鲜ｄ３ ５ Ｆ Ｕ Ｂ Ｍ Ｃ 的（３０ ．５ ±９ ．５） 和（１３ ．６ ±４ ．５）倍（ 与单用 Ｓ Ｃ Ｆ 组比较 Ｐ 分别大于和小于０ ．０５） 。小鼠骨髓移植实验结果表明： Ｓ Ｃ Ｆ、 Ｓ Ｃ Ｆ＋ Ｉ Ｌ ３ 体外扩增的ｄ３ ５ Ｆ Ｕ Ｂ Ｍ Ｃ 移植给经致死量照射的受体小鼠后,外周血细胞计数恢复时间比输新鲜ｄ３ ５ Ｆ Ｕ Ｂ Ｍ Ｃ 组缩短１ ～５ ｄ , Ｓ Ｃ Ｆ＋ Ｉ Ｌ ３组不仅血细胞计数恢复最快,并使移植所需的骨髓细胞数减少９０ ％ 以上。结果提示： Ｓ Ｃ Ｆ 单用对骨髓细胞有扩增作用,并且与 Ｉ Ｌ ３ 有协同作用;体外扩增的骨髓?     

5种造血生长因子对造血祖细胞集落形成的影响

目的探讨IL-3、IL-6、GM-CSF、G2、PIXY321对骨髓造血祖细胞集落形成的影响.方法 5种造血生长因子分别采用100、250、500、750、10 00 u/ml浓度,进行骨髓造血祖细胞集落培养,从中找出峰值浓度,然后在峰值浓度下进行集落培养,计数不同造血生长因子条件下所形成的集落.结果 IL-3、IL-6、GM-CSF、G2、PIXY321对造血祖细胞集落形成的峰值浓度分别为100、100、250、750、25 0 u/ml.峰值浓度下,对CFU-E、BFU-Em、BFU-Eim、CFU-GM形成的作用强度不同,PIXY321 条件下所形成的集落数最多.结论这五种造血生长因子对骨髓造血祖细胞的集落形成均有促进作用,PIXY321效果显著.     

Gene Transfer into Hematopoietic Cells of Mouse and Its in vivo Expression after Transplantation

Genetransferintohematopoieticcellshasfoundmanyapplicationinexperimentalresearchesaswellasclinicalpractice['1.Atpresent,thestrategyofgenetransferusedmostcommonlyistheretrovirusvectorsystem[2].However,theuseofretrovirusvectorssuffersfromseveraldrawbacks:(1)thegenerationandmanufacturingofretrovirusvectorsarecomplexandnotinexpensive;(2)generalsafetyconcernsareassociatedwiththeuseofanyviral--basevectorsystem,includingreplicationdefectivemurineretrovirusvectorsj(3)retrovirusvectorscurrentlyusedareab…     

增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸调节脐血CD34+造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应

目的:探讨低浓度增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸(PCNA-ASODN)调节脐血造血前体细胞体外扩增和分化的时间效应。方法:用免疫磁珠分离技术从新鲜脐带血中分离出CD34 细胞,先后加入低浓度PCNA-ASODN作用于体外培养的CD34 细胞,用流式细胞仪检测培养后各种细胞的数量及细胞周期的变化。结果:实验组脐血CD34 造血前体细胞明显被扩增,但以第72 h组的扩增效应最为显著,其CD34 细胞比例增高[(35.6±1.8)%],而CD34 CD38-细胞数量扩增达(55.1±4.2)倍,且G0/G1期细胞占(49.8±2.5)%。结论:低浓度PCNA-ASODN对脐血CD34 造血前体细胞体外扩增的调节具有时间效应,同时能延缓扩增过程中伴随的细胞分化。     

不同冻存方法对脐血造血细胞的影响

目的 探讨不同冻存方法对脐血造血细胞的影响。方法 冻存前后脐血单个核细胞通过台盼蓝拒染率、对K562杀伤活性及总集落形成数来进行检测。结果 控制冻存保护剂浓度和程序性降温可减小对脐血造血细胞的损害。结论 该研究可为脐血建库提供一种较好的冻存方法。     

细胞表面黏附分子在造血干细胞动员中的作用机制

目的　研究粒系集落刺激因子 (G CSF)进行干细胞动员时干细胞表面黏附分子的变化 ,从黏附分子角度说明G CSF的动员机制。方法　将重组人G CSF(惠尔血 )或生理盐水注射于小鼠皮下 ,每日两次 ,连续 7d ,收集G CSF使用前后骨髓和外周血单个核细胞 ,计数外周血Sca 1 干细胞数目和骨髓有核细胞数 ,同时分别检测细胞表面CD49d、CD44的表达和干细胞与骨髓基质蛋白黏附能力的变化。结果　重组人G CSF对小鼠有和人类相似的动员作用 ,使用G CSF 7d后外周血Sca 1 细胞数增高近 2倍 ,骨髓有核细胞数明显下降 ,同时骨髓和外周血单个核细胞表面CD49d表达以及细胞黏附能力都有所下降 ,而对照组无类似现象。结论　G CSF可能通过降低某些黏附分子的表达 ,削弱造血细胞与骨髓基质的黏附而产生动员效果