人呼吸道合胞病毒减毒活疫苗培养的初步探索

目的对比人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）经人二倍体KMB17细胞低温传代前后对动物的病理损伤，分析毒力变化情况。方法将HRSVA2株病毒接种到人二倍体KMB17细胞进行低温培养传代，接种原代病毒（5．37LgCCID50／ml）至乳鼠脑内，14d处死解剖，取脑、心、肺作病理切片检查；选择原代、第6代、第11代低温传代病毒接种豚鼠鼻腔，于第7d、第14d分2批分别处死，取心、肝、脾、肺、肾组织作病理切片检查，并取肺组织分离病毒、进行感染性滴度测定、用间接免疫荧光法对其进行鉴定。结果经脑内接种的乳鼠均未死亡，且乳鼠的脑、肺HE染色切片与对照组相比均无明显著差异。豚鼠经鼻腔接种，接种原代病毒组第14d处死时体重明显较对照组轻，6代组和11代组与对照组接近；3组病毒均引发豚鼠间质性肺炎；3组豚鼠肺组织分离的病毒滴度差异不大，平均为4．0Lg。结论乳鼠脑内接种HRSV不能导致死亡，脑组织不是HRSV的病变靶器官；HRSV经鼻腔接种豚鼠能引起强烈的肺部感染，豚鼠可作为HRSV毒力评价的动物模型；HRSV在KMB17细胞上经低温传11代，接种豚鼠仍能引起间质性肺炎，未出现明显的减毒株特征，还需要进一步减毒。     

细胞内快速连续传代培养甲肝病毒的研究

目的:研究甲肝病毒在细胞内快速连续传代培养病毒增殖情况,探索疫苗生产工艺改进的可能性。方法:将甲肝病毒吕8株感染KMB17细胞后形成带毒细胞,每7 d传代1次,检测每次收获物的甲肝病毒抗原(HAAg)滴度及感染性滴度,比较滴度的变化,同时检测一步生长曲线,分析病毒增殖特性有无变化。结果:甲肝病毒吕8株感染KMB17细胞后每7 d传代1次,其第1~8代抗原滴度为1 024~2 048 Eu/0.1 ml,感染性滴度为7.33~7.67 lg CCID50/ml,第9代开始下降,抗原滴度仅为256 Eu/0.1 ml,感染性滴度为6.83~7.00 lg CCID50/ml;在连续传10代内,细胞均未出现CPE现象;第10代与第1代相比,其一步生长曲线病毒增殖高峰均为20~25 d,没有明显变化。结论:甲肝病毒吕8株在KMB17细胞上每7 d传代1次,在第8代以内,其抗原滴度及感染性滴度均能达到较高的程度。经细胞内连续快速传代后,HAV吕8株生长的增殖高峰约为第20~25 d,与传代前样品没有明显差别。     

HAV吕8株生长特性及残余活毒检测方法的研究

[目的]对甲型肝炎病毒吕8株(HAV吕8)培养生长特性进行研究,确定其灭活后残余活毒检测方法的可靠性。[方法]通过一步生长曲线确定HAV吕8株的生长增殖高峰;将活病毒样品作2倍系列稀释后接种于细胞,研究不同接种量的最早检出时间;以统计学方法计算细胞培养方法检测HAV的灵敏性及可靠性;以病毒在细胞上的感染性为指标,经3次传代检测其有无感染性,以确证灭活疫苗残余活毒检测方法的可靠性。[结果]HAV吕8株细胞培养增殖高峰约为d20￣24;细胞培养方法检测甲肝病毒的灵敏性可达1.79CCID50、可靠检出甲肝病毒的最低量为10.23CCID50;凡达到ELISA的检出灵敏度的HAV接种样品,当培养增殖到d12时,均能被检出;当HAV含量达到512Eu/0.1ml时,不论是活病毒还是已灭活病毒,其吸附在细胞上的残余病毒量均能达到ELISA的检测灵敏度。[结论]将甲肝灭活疫苗样品接种细胞进行残余活毒检测,经3次传代,每次培养20d以上,该检测方法有较高的灵敏度,其检测结果是可靠的。     

柯萨奇病毒YY157株在不同细胞系中的增殖特性

目的 了解柯萨奇病毒A16型(Cox A16)YY157株在多种细胞系中培养的增殖特性,为疫苗研制提供参考.方法 把YY157株接种于非洲猴肾细胞(Vero)、人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5或KMB17进行适应性传代培养,观察细胞病变情况,检测病毒感染性滴度,绘制增殖曲线.结果 Cox A16 YY157株在3种细胞中培养均产生细胞病变,在Vero细胞中病变早,增殖快,滴度达8.5 lgCCID50/mL;在MRC-5细胞中,此毒株增殖速度比在Vero细胞中慢,滴度达7.5 lgCCID50/mL;在KMB17细胞中,此毒株增殖最慢,滴度只有7.0 1gCCID50/mL.结论 Cox A16型YY157株均可感染Vero、MRC-5和KMB17细胞并增殖,但敏感性和增殖速度有差异.     

大鼠脂肪源性干细胞分离培养的实验研究

目的研究分离、培养、鉴定大鼠脂肪源性干细胞的实验方法。方法提取大鼠双侧腹股沟处脂肪组织,进行原代培养及流式细胞检测仪的鉴定。用MTT法检测不同原代细胞接种密度的细胞分裂增殖率的变化,并观察第1^第13代细胞分裂增殖的特点。结果大鼠脂肪源性干细胞的生长呈大量细胞集落,表面标记物CD44、CD105、CD49d表达阳性,CD106表达阴性。不同的原代细胞接种密度会影响细胞分裂增殖,以1×106/ml细胞密度接种时细胞的增殖速率高于其它对照组。该细胞株经多次传代后仍能保持较强的分裂增殖能力。结论大鼠脂肪源性干细胞分离培养方法简便,不同的原代细胞接种密度会影响细胞分裂增殖,细胞经多次传代后仍能保持较强的分裂增殖能力。     

不同代次MDCK细胞对流感病毒的敏感性比较

目的 比较不同代次的狗肾传代(MDCK)细胞对流感病毒的敏感性差异.方法 选择生长状态及形态良好的、不同代次的MDCK细胞,在相同培养条件下同时接种流感样病例咽拭子标本,观察细胞病变,细胞收获后采用血凝试验测定病毒血凝效价和分离率;以参考流感病毒株测定TCID50值,比较不同代次MDCK细胞对流感病毒的敏感性.结果 3个不同代次的MDCK细胞对流感样病例标本的分离阳性率、血凝效价相比差异无统计学意义,且3者TCID50值相比,相差不超出1个Lg.结论 在相同实验条件以及细胞生长状态和形态良好的情况下,不同代次的MDCK细胞对流感病毒的敏感性无差异.     

肾综合征出血热病毒感染沙鼠肾细胞病毒滴度的动态观察

肾综合征出血热(HFRS)病毒已知能在VeroE-6、A-549、人胚肺二倍体传代细胞和地鼠肾、大白鼠肺等原代细胞稳定传代.我们经筛选,发现长爪沙鼠肾细胞方较敏感,并用于生产HFRS疫苗,为了解HFRS病毒在此细胞中的增殖规律,我们将生产疫苗的Z10(Ⅰ型)和Z37(Ⅱ型)二株病毒感染沙鼠肾细胞,以观察病毒的增殖情况.     

20例人早孕绒毛滋养细胞的体外培养

目的建立快速、有效的绒毛滋养细胞体外培养的方法。方法采用0．25％胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法消化绒毛组织,用胰蛋白酶消化传代体外培养,通过光镜对培养出的细胞进行形态评价;用细胞角蛋白和波形蛋白单克隆抗体检测细胞纯度。结果联合消化法的细胞生长迅速,接种6～8d可以传代,原代细胞生长时间明显缩短,所得细胞纯度达95％。结论联合消化法是一种较有效的人早孕绒毛滋养细胞培养方法。     

不同牛血清对人胚肺二倍体细胞增殖的影响

目的 探讨不同级别的牛血清对人胚肺二倍体细胞KMB17增殖的影响.方法 用不同级别的牛血清培养KMB17细胞,每天作细胞计数,绘制生长曲线,计算细胞倍增时间,MTT比色法测定细胞增殖能力.结果 用胎牛血清培养,细胞增殖能力最强,倍增时间最短;其次为类胎牛血清、特级新生牛血清、优级新生牛血清.结论 不同级别的牛血清对KMB17细胞增殖效果不同,进行细胞培养时宜选择级别较高的牛血清.     

急性呼吸道疫情病原学的快速鉴别

[目的]对2007年4月起在陕西高陵县某小学和幼儿园暴发的群体性不明原因发热、咳嗽的急性呼吸道疫情进行病原学快速鉴别研究.[方法]采集流行区新发患儿13例的咽拭子标本,新鲜抽提核酸,对常见12种呼吸道RNA病毒进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和巢式PCR,阳性分离标本接种敏感细胞培养,病变细胞进行免疫荧光鉴定.[结果]13例标本中RT-PCR和巢武PCR检出流感病毒B型阳性7例,其他病毒的特异性条带未检出;全部标本接种MDCK狗肾细胞3d后仅7例阳性检出,流感病毒B型者均出现细胞病变效应,其余未见明显细胞病变;病变细胞对B型流感单抗的直接免疫荧光试验均为阳性反应.[结论]本次急性呼吸道疫情的病原体为B型流感病毒.     

Intranasal immunization with HRSV prefusion F protein and CpG adjuvant elicits robust protective effects in mice

Human respiratory syncytial virus (HRSV) is a leading cause of lower respiratory tract infections in elderly individuals and young children/infants and can cause bronchiolitis and even death. There is no licensed HRSV vaccine. An ideal vaccine should induce high titers of neutralizing antibodies and a Th1-biased immune response. In this study, we used EXPI293 cells to express the fusion (F) protein with a prefusion conformation (PrF) and compared the safety and efficacy of intranasal immunization with PrF in combination with two mucosal adjuvants (CpG ODN and liposomes) in mice. After two intranasal administrations, mice in the PrF + CpG group produced high titers of neutralizing antibodies (4961) and a Th1-biased immune response compared with the PrF + Lipo group. The lung viral load of mice in the PrF + CpG group was significantly reduced (3.5 log) compared with that in the adjuvant control group, and the survival rate was 100 %, while the survival rate of mice in the PrF + Lipo group was only 67 %. At the same time, this immunization strategy reduced the pathological damage to the lungs in mice. In conclusion, the combination of PrF and CpG adjuvant is immunogenic, elicits a Th1 type immune response, and completely protects mice from a lethal HRSV challenge. It is worthy of further evaluation as an HRSV vaccine in clinical trials.Clinical trial registration.This study was not related to human participation or experimentation.