应用细胞膜片复合硅胶管内支撑构建组织工程管状软骨

目的 研究利用羊耳软骨细胞形成细胞膜片,构建无细胞支架组织工程管状软骨的可行性.方法 体外培养扩增羊耳软骨细胞至第2代,以2.0×106 cells/mL的高密度,培养7d,形成直径为35 mm的圆形细胞膜片,将细胞膜片均匀包裹于硅胶管,植入裸鼠背部皮下,4周后取材检测.以大体观察、组织学、免疫组织化学等方法,对形成的软骨进行评价.结果 大体观察可见形成良好的管状软骨,HE染色见软骨陷窝形态规则,番红O染色及Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性表达.结论 细胞膜片复合硅胶管内支撑的方法能形成管状软骨,为气管软骨的再造提供了新的方法.     

软骨细胞膜片复合3D打印内支撑构建管状软骨的初步研究

目的 利用猪耳廓软骨细胞制备软骨细胞膜片,与3D打印聚酰胺带孔管状支架结合,构建管状软骨组织,用于气管软骨的缺损重建。方法 用酶消化法分离获得原代猪耳廓软骨细胞,以5×105cells/m L的密度将第2代软骨细胞接种于6 cm细胞培养皿上,在软骨细胞膜片培养环境中培养约14 d,获得完整软骨细胞膜片;4层软骨细胞膜片依次卷叠于3D打印的聚酰胺(PA12)带孔管状内支架上,以构建管状软骨组织复合物;体外静态培养12周或裸鼠皮下培养8周,对形成的管状软骨组织行大体观察及石蜡切片组织学染色鉴定。结果 体外静态培养12周后,半透明管状软骨组织形成,组织学染色可见少量分泌的软骨细胞外基质,质软,弹性差;体内培养8周后,白色管状软骨组织形成,其组织学染色可见大量软骨细胞外基质分泌,质较硬,有一定弹性。结论 利用软骨细胞膜片复合3D打印聚酰胺支架,可构建组织工程管状软骨,有望将其用于气管软骨缺损的修复。     

基于细胞膜片技术构建组织工程骨的实验研究

目的:由多层骨髓间充质干细胞和细胞外基质构成的细胞膜片,与管状天然珊瑚支架相复合,在动物体内构建管状骨组织。方法:将骨髓间充质干细胞高密度接种后,在成骨诱导条件下连续培养形成细胞膜片。随后,将细胞膜片均匀缠绕在直径5mm、壁厚1.5mm的管状珊瑚外表面,体外静态孵育3天。最后将构建物移植到裸鼠背部皮下,术后8周,12周分别进行大体观察、三维CT扫描和组织学检查。结果:8周和12周后,新生组织中骨组织所占面积分别为25.75%和40.01%。组织学检测证实新骨形成表现为软骨内成骨方式,由编制骨逐渐成为成熟的完全矿化的皮质骨。结论:成骨性骨髓间充质细胞膜片与管状天然珊瑚支架复合,可构建出与天然骨形态及结构相类似的管状组织工程骨。     

脂肪来源细胞体外构建组织工程软骨的初步探索

目的 探讨脂肪来源细胞(adipose-derived cells,ADCs)在体外构建特定形态软骨的可行性.方法 脂肪组织由整形外科吸脂术获得.酶消化法分离抽吸物中细胞,体外扩增.以第3代细胞接种PLGA生物支架,在成软骨培养基中体外诱导4周,大体观察、组织学检测构建组织的成软骨能力.结果 大体观察见诱导组能维持圆柱形态.非诱导组失去原有形态,单纯支架组完全塌陷.组织学上诱导组局部检测到软骨陷窝包埋于嗜碱性基质中,Massens's染色和Safranin'O染色示胶原、蛋白多糖呈阳性,免疫组织化学染色示Ⅱ型胶原轻度阳性;非诱导组呈典型的疏松结缔组织结构,组织学特殊染色均呈阴性.结论 脂肪来源细胞虽为多种细胞混合群体,但作为构建特定形态软骨的种子细胞,具有可行性.     

应用骨髓基质干细胞体外构建组织工程化管状软骨的实验研究

目的以骨髓基质干细胞(bone m arrow strom a cells,BMSCs)为种子细胞,接种于管状聚羟基乙酸(PGA)支架上,在体外构建组织工程化管状软骨。方法取长枫杂交仔猪髂骨骨髓,在低糖DMEM完全培养液培养2周,传代后以浓度为5×107/m l细胞悬液均匀接种于管状PGA支架上,以高糖DMEM低血清特定培养液诱导(含胰岛素2 mg/L、转铁蛋白3 mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10-7mol/L、TGF-β10ng/L、葡萄糖4.5 mg/m l、2%胎牛血清),连续诱导培养10周,从大体、组织学和Ⅱ型胶原免疫组化对再生组织进行评价。结果6周时染色见BMSCs-PGA复合物表层为2~4层成纤维样细胞组成的软骨膜,下层为较成熟的软骨组织,软骨细胞包埋在软骨陷窝内,有很多散在PGA纤维,而在中间部分,组织量较少,结构较构散。10周时BMSCs-PGA复合物外观呈乳白色软骨样,管壁较厚,有一定的弹性,但中间部管腔塌陷较明显,苏木素-伊红染色见实验组管状BMSCs-PGA和6周时相似,但结构更致密和规则,细胞数量较正常软骨组织少,还可见少量的未降解的PGA纤维。免疫组化证实形成的组织有Ⅱ型胶原分布。结论管状BMSCs-PGA复合物在特定培养液诱导下,在体外能形成管状软骨,这为将来临床应用BMSCs作为种子细胞,修复软骨缺损或构建复合组织气管提供了实验基础和技术参数。     

激光打孔脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞构建组织工程气管软骨

目的探索激光打孔脱细胞基质诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)于动物体内构建组织工程气管软骨的可行性。方法应用激光打孔联合脱细胞技术制备激光打孔脱细胞基质(LDTM)作为支架材料。抽取兔骨髓,分离培养BMSCs,接种于LDTM支架后植入兔皮下。体内培养12周后,行大体观察、组织学检测、生物力学及生物化学定量检测。结果细胞均匀分布在激光微孔和支架表面,并且该复合物能够较好地维持原始的管状结构,形成了富有弹性的瓷白色软骨样组织。HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织形成。Safranin-O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学和生物化学检测显示新生气管组织均接近正常气管组织。结论 LDTM可以促进软骨再生并在动物体内诱导BMSCs构建组织工程气管软骨。     

骨髓基质干细胞片层复合聚乳酸羟基乙酸支架构建组织工程骨

目的 制备骨髓基质干细胞片层,探讨其对组织工程骨成骨的作用.方法 培养骨髓基质干细胞(BMSCs)并向成骨方向诱导,利用温度反应性培养皿制备骨髓基质干细胞片层,光学及电子显微镜下观察其形态.将经过预处理的三维多孔聚乳酸羟基乙酸(PLGA)支架注射BMSCs悬液并复合干细胞片层后植入犬左侧下颌骨缺损,为实验侧;将未复合细胞片层的支架植入右侧,为对照侧.16周后,对新生骨行影像学及组织学观察分析.结果 片层中细胞排列紧密,生长活跃.实验侧吸光度值高于对照侧(P＜0.05),并可见较多哈弗系统及板层骨样结构.结论 经温度反应性培养皿制备的干细胞片层结合PLGA支架可形成具有板层状结构的组织工程骨.     

质粒修饰BMSC联合纳米支架促进软骨缺损修复的相关研究

目的探究慢病毒介导聚蛋白多糖(Aggrecan)过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架向软骨细胞转化及软骨缺损修复的作用效果。方法构建慢病毒聚蛋白多糖过表达载体,培养骨髓间充质干细胞,构建兔模型软骨缺损模型,实验组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+转染聚蛋白多糖过表达载体骨髓间充质干细胞复合物;阴性对照组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物;模型组造模后加入生理盐水处理。体外实验利用HE染色和免疫组织化学染色检测骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架的联合培养体系向软骨细胞转化中聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。构建兔膝关节软骨缺损模型,HE染色和免疫组织化学分析复合支架材料对软骨缺损的修复效果。结果 a)实验组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)中支架表面黏附的细胞与对照组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+未转染骨髓间充质干细胞)相比,细胞数明显增多;b)动物模型大体观察结果显示,实验组的修复效果要明显优于阴性对照组;c)动物模型HE染色结果显示,阴性对照组多为纤维性修复,而实验组多为细胞性修复;d)免疫组织化学染色结果显示,实验组修复软骨组织中Aggrecan和Ⅱ型胶原含量要明显优于阴性对照组。结论 Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以促进BMSC向软骨细胞的分化,并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型胶原成分的细胞外基质,从而发挥其促进软骨缺损修复的作用。     

可降解高分子丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)三维支架的细胞相容性和鼻软骨组织工程

目的 探讨可生物降解丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)(80∶20)三维多孔支架生物相容性及用于构建组织工程鼻软骨可行性,为临床鼻软骨缺损的修复提供新来源.方法 体外分离培养新生兔关节软骨细胞,采用计算机形态分析和MTT法检测兔软骨细胞在PLGA膜和支架表面粘附、扩展和增殖情况.将培养扩增的兔软骨细胞,按6×106 cels/ml浓度接种于预加工的人鼻软骨外形PLGA多孔支架内,抗坏血酸体外诱导培养4周,形成软骨样组织,倒置显微镜、组织切片、扫描电镜观察人工软骨的组织形态结构.结果 培养开始阶段,软骨细胞在PLGA膜表面粘附较差,以后逐渐增高,24小时接近于对照组;MTT法结果显示,软骨细胞在PLGA支架内培养7天时细胞绝对数量明显增加,而相对增殖率逐渐下降.肉眼观察,培养物为人鼻软骨外形的透明软骨样组织,具有一定弹性和硬度,表面有大量软骨基质形成;倒置显微镜下可见人工软骨周围有大量软骨细胞聚集和细胞外基质形成.组织切片及扫描电镜分析,多孔支架材料的网孔不完整,孔内有大量软骨细胞和细胞外基质,可见典型软骨陷窝样结构.结论 可生物降解PLGA制备的三维多孔支架具有较好生物相容性和可塑性,可用于组织工程鼻软骨体外构建,具有潜在的临床应用价值.     

骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板

目的探索以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为种子细胞,在体外构建具有完整内侧半月板形态的软骨样组织的方法。方法运用模具制备内侧半月板形的PGA/PLA支架。抽取犬骨髓,分离培养BMSCs,将其接种于支架材料上,5 d后使用软骨诱导液培养。体外培养6周后,行大体观察、组织学检测及生物力学检测。结果细胞材料复合物能够较好地维持半月板三维立体结构,形成了表面光滑、触之有弹性的瓷白色软骨样组织。 HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织的形成。Safranine O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学检测显示,新生组织弹性模量达正常半月板组织的12.7%。结论 BMSCs通过体外诱导,可在体外分化为较成熟的软骨组织,并构建出组织工程化半月板。     

Tissue engineering of trachea-like cartilage grafts by using chondrocyte macroaggregate: experimental study in rabbits

Abstract:  Treatment and management of tracheal defects remain challenges in head and neck surgery. The purposes of this study were to explore a novel strategy to fabricate tissue-engineered trachea by using chondrocyte macroaggregate, and evaluate the feasibility of creating tracheal cartilage equivalents grown in the shape of cylindrical structure without scaffold. Chondrocytes from rabbit cartilage were expanded and seeded into a culture dish at high density to form mechanically stable chondrocyte macroaggregate. Once the chondrocyte macroaggregate was harvested by scrapping technique, it was wrapped around a silicon tube and implanted subcutaneously into the cell donor rabbit. Eight weeks later, specimens were harvested and analyzed for gross appearance, and histological, biochemical, and biomechanical properties. These values were compared with native rabbit cartilage. It was found that expanded chondrocytes could be harvested as a coherent cellular macroaggregate and could be fabricated into a tubelike graft. After in vivo implantation, cartilage-like tissue with cylindrical structure was regenerated successfully. Histological analysis showed engineered trachea cartilage consisted of evenly spaced lacunae embedded in a matrix rich in proteoglycans; type II collagen was also highly expressed in this engineered trachea cartilage. In a conclusion, based on the chondrocyte macroaggregate strategy, tracheal cartilage equivalents with cylindrical shape could be successfully reconstructed. This construct has advantages of high cell-seeding efficiency, good nutritional perfusion, and minimal inflammatory reaction, which provided a highly effective cartilage graft substitute and could be useful in many situations of trachea–cartilage loss encountered in clinical practice.     

Novel Strategy to Engineer Trachea Cartilage Graft With Marrow Mesenchymal Stem Cell Macroaggregate and Hydrolyzable Scaffold

Limited donor sites of cartilage and dedifferentiation of chondrocytes during expansion, low tissue reconstruction efficiency, and uncontrollable immune reactions to foreign materials are the main obstacles to overcome before cartilage tissue engineering can be widely used in the clinic. In the current study, we developed a novel strategy to fabricate tissue‐engineered trachea cartilage grafts using marrow mesenchymal stem cell (MSC) macroaggregates and hydrolyzable scaffold of polylactic acid–polyglycolic acid copolymer (PLGA). Rabbit MSCs were continuously cultured to prepare macroaggregates in sheet form. The macroaggregates were studied for their potential for chondrogenesis. The macroaggregates were wrapped against the PLGA scaffold to make a tubular composite. The composites were incubated in spinner flasks for 4 weeks to fabricate trachea cartilage grafts. Histological observation and polymerase chain reaction array showed that MSC macroaggregates could obtain the optimal chondrogenic capacity under the induction of transforming growth factor‐β. Engineered trachea cartilage consisted of evenly spaced lacunae embedded in a matrix rich in proteoglycans. PLGA scaffold degraded totally during in vitro incubation and the engineered cartilage graft was composed of autologous tissue. Based on this novel, MSC macroaggregate and hydrolyzable scaffold composite strategy, ready‐to‐implant autologous trachea cartilage grafts could be successfully fabricated. The strategy also had the advantages of high efficiency in cell seeding and tissue regeneration, and could possibly be used in future in vivo experiments.     

组织工程骨软骨复合物的构建与形态学观察

目的探讨采用组织工程技术构建骨软骨复合物的可行性。方法将骨髓基质细胞(BMSCs)成诱导软骨后接种于快速成形的三维支架材料聚乳酸／聚羟乙酸共聚物(PLGA)构建组织工程软骨，经成骨诱导的BMSCs接种于聚乳酸／聚羟乙酸共聚物／磷酸三钙(PLGA／TCP)构建组织工程骨，在体外分别培养2周后，将两种工程化组织及两者以无损伤线缝合形成的组织工程骨软复合体分别植入自体股部肌袋，术后8周取材，行组织学观察。结果术后组织学观察表明。组织工程软骨在体内可形成软骨组织组织工程骨在体内可形成骨组织，两者的复合体在体内可形成骨软骨复合物。结论以骨髓基质细胞为种子细胞、以快速成形的生物降解材料为支架体外构建的组织工程骨软骨复合物，可在体内形成骨软骨组织，有望用于骨软骨缺损的修复。     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

不同比例软骨细胞与间充质干细胞对构建组织工程软骨的影响

目的以不同比例将大鼠软骨细胞及骨髓间充质干细胞（bonemarrowstromalceu,BMSCs）依次体外及体内混合培养,探讨二者构建组织工程软骨的最佳比例。方法分别取1个月及1d龄SD大鼠的BMSCs及关节软骨,原代软骨细胞与第2代BMSCs混合比例为全软骨细胞组、3：1、1：1、1：3、全BMSCs组,共五组。以终浓度4×10^7／mI．种于聚乳酸一聚羟基乙酸支架上,体外培养4周后,植入裸鼠皮下继续培养,8周后对标本进行大体观察、组织学切片、Ⅱ型胶原免疫荧光染色及检测氨基糖胺多糖的含量。结果软骨细胞与BMSCs混合比例3：1组较其他各组所构建出的组织工程软骨体积大,厚度厚,有光泽;组织染色见软骨细胞增殖较旺盛,被大量细胞外基质包围,分布均匀,并可见软骨陷窝;Ⅱ型胶原免疫荧光染色见细胞内和细胞外基质发出的红色荧光较明亮;3：1组的组织块氨基糖胺多糖含量（470．38±29．78）μg高于其他各组（P〈O．05）。结论软骨细胞与BMSCs混合培养有助于节省软骨细胞,二者混合浓度比例以3：1最好。     

胎猪BMSC体外构建软骨的实验研究

目的比较胎猪骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）和成年猪BMSCs构建软骨能力的差异,寻找合适的同种异体组织工程软骨种子细胞来源。方法通过剖腹产手术获得胎龄为70 d的胎猪,胎猪骨髓液贴壁培养获得胎猪BMSCs;抽取成年猪骨髓液,经贴壁培养法获得成年猪BMSCs。两种细胞体外扩增培养后,观察第3代细胞形态,并进行成骨、成脂和成软骨诱导。分别取两种细胞以1×108 cells/mL的细胞终浓度,接种于聚乳酸包埋的聚羟基乙酸支架,体外诱导培养8周后取材。通过大体观察、糖胺聚糖（GAG）含量测定、总胶原含量测定、组织学,以及免疫组化等方法,对两种细胞构建的组织工程软骨的相关生物学特性进行比较。结果胎猪BMSCs比成年猪BMSCs具有更好的增殖和成骨、成脂和成软骨能力。胎猪BMSCs构建的软骨有良好的软骨外观,而且GAG含量和总胶原含量均高于成年猪BMSCs构建的软骨（P<0.01）。组织学和免疫组化显示,胎猪BMSCs构建的软骨组织结构致密,基质及Ⅱ型胶原显色程度均明显强于成年猪BMSCs构建的软骨。结论胎猪BMSCs是组织工程软骨较好的种子细胞来源。     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.