人乳头状瘤病毒18型E6E7基因诱导人胚食管上皮永生化

提要人乳头状瘤病毒18型E6E7AAV感染胎儿食管，建立一株新的人食管，上皮细胞株（SHEE），这株细胞成为永生化并继续繁殖超过60代。经过长时间的传代培养，其10代细胞表型保留原始上皮细胞培养物的特征，表现为单层生长和锚使依赖性生长，在软琼脂培养不形成克隆，接种裸鼠未成瘤。SHEE细胞系电镜检查可见张力原纤维，免疫组化检查细胞角质蛋白阳性，证实为鳞状上皮来源。荧光原位杂交和PCR检测显示有HPV18E6E7基因。结论：我们提供这株用HPV18E6E7基因成功地诱导永生化细胞株SHEE，支持HPV18可能和食管癌病因有关，它可用以…     

人乳头状瘤病毒与促癌物协同作用诱发人胚宫颈细胞恶性转化研究

目的：研究人乳头状瘤病毒（HPV）与促癌物协同作用在scid小鼠体内诱发人胚宫颈细胞的恶性转化。方法：包装制备含HPV16E6E7逆转录病毒,感染人胚宫颈细胞,按分组将所需细胞移植于scid小鼠右侧肩部皮下,共分4组：实验组为感染病毒的宫颈细胞 亚精胺 正丁酸组,共7只;病毒组为感染病毒的宫颈细胞组,共5只;促癌组为正常宫颈细胞 亚精胺 正丁酸组,共5只;对照组为正常宫颈细胞组,共4只。按实验要求于移植第3日起在小鼠左侧肩部皮下注射亚精胺和正丁酸,每周1次。观察12周后处死动物,如发生肿瘤,则对瘤组织行病理诊断,并作PCR检测HPV16E6E7基因。结果：实验组成瘤比例5/7,其他3组成瘤率皆为0,实验组肿瘤的病理学检查证实为肉瘤,应用PCR方法在肿瘤组织中检测到HPV16E6E7基因。结论：宫颈细胞在感染含HPV16E6E7基因的逆转录病毒后,在亚精胺和正丁酸协同作用下发生恶性转化。     

交链孢酚诱发人胚食管上皮鳞癌的研究

互隔交链孢霉是食管癌高发区林县粮食中的优势污染菌,我们曾证明该菌产生的毒素之一交链孢酚(Alternariol,AOH)能引起大鼠肝细胞的DNA单链断裂,激活人胚食管上皮的H-ras和myc癌基因,与人食管上皮DNA的各种碱基呈共价结合。为研究AOH能否引起人食管上皮癌,将水囊引产的胎儿食管在体外培养一周后,用AOH处理,再培养2周,     

16型人乳头状瘤病毒E6、E7与宫颈癌、宫颈炎关系的初步研究

目的 了解重庆地区宫颈癌、宫颈炎发病与１６例人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ１６）Ｅ６、Ｅ７的关系。方法 运用ＰＣＲ,分子生物学技术进行ＨＰＶ１６Ｅ６、Ｅ７的扩增和克隆。结果 重庆地区宫颈癌、宫颈炎组织中ＨＰＶ１６Ｅ６,Ｅ７总检出率分别为７０％和６５％。结论 重庆地区ＨＰＶ１６感染与宫颈癌、宫颈炎的发生相关。Ｅ７原癌蛋白可能与宫颈癌发生早期有关,而Ｅ６原癌蛋白可能与宫颈癌形成晚期关系密切。     

人乳头状病毒16/18及E6、E7基因在宫颈癌组织中的表达

目的探讨高危型人乳头状病毒(HPV)16／18及其E6、E7基因在宫颈癌诊断中的价值。方法对104例宫颈新鲜组织(正常对照16例，轻度宫颈增生18例，中度宫颈增生20例，重度宫颈增生20例，宫颈癌30例)进行研究，荧光定量PCR用于HPV16／18的检测，PCR用于E6、E7基因的检测。结果正常对照组：HPV16／18阳性1例，E6、E7基因无阳性；轻度宫颈增生：HPV16／18阳性2例，R、E7基因无阳性；中度宫颈增生：HPV16／18阳性2例，E6、E7基因阳性1例；重度宫颈增生：HPV16／18阳性6例，R、E7基因阳性2例；浸润型宫颈癌：HPV16／18阳性16例，E6、E7基因阳性7例。结论宫颈癌组织HPV16／18和E6、E7基因阳性率明显高于其它子宫颈增生者，并随子宫颈增生程度逐渐增加。     

人乳头瘤病毒18型E7蛋白基因的克隆研究

根据人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８的核苷酸序列，设计扩增其Ｅ７基因的特定引物，并使引物进５′端引入ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ酶切位点，用聚合酶反应扩增ＨＰＶ１８Ｅ７片段，通过ｐＵＣ１８质粒载体多聚接头的ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与Ｅ７基因片段连接，构建一新的重组体，转化到大肠杆菌ＪＭ１０９，经筛选，快提质粒等鉴定，初步证实获得了ＨＰＶ１８Ｅ７基因的重组体。     

人乳头瘤病毒18型E7蛋白基因的克隆研究

根据人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８的核苷酸序列，设计扩增其Ｅ７基因的特定引物，并使引物的５′端引入ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ酶切位点，用聚合酶链反应扩增ＨＰＶ１８Ｅ７片段，通过ｐＵＣ１８质粒载体多聚接头的ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与Ｅ７基因片段连接，构建一新的重组体，转化到大肠杆菌ＪＭ１０９，经筛选，快提质粒等鉴定，初步证实获得了ＨＰＶ１８Ｅ７基因的重组体。     

宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型转化基因E7的检测

用聚合酶链反应扩增宫颈癌组织中人乳头瘤病毒１６型Ｅ７基因，获得含完整Ｅ７基因的３１２ｂｐ片段。分析２２例宫颈癌样品，Ｅ７基因的检出率为４５．５％，４０例宫颈炎中Ｅ７基因的检出率为５％。这一方法为进一步研究Ｅ７基因在宫颈癌发生中的作用奠定基础，并可用于宫颈癌的诊断与防治。     

黑素瘤细胞诱导人胚上皮干细胞的恶性转化

目的:探索体外肿瘤微环境中正常成体干细胞是否可以发生恶性转化而具有相关肿瘤学特性.方法:利用共培养池建立黑素瘤A-375细胞诱导表皮干细胞转化的模型,应用相差显微镜观察诱导前后表皮干细胞形态变化,免疫荧光法检测诱导后表皮干细胞E-钙黏着蛋白、肿瘤相关抗原P53突变蛋白的表达变化和双层软琼脂实验鉴定诱导后表皮干细胞克隆形成能力情况.结果:7 d后与黑素瘤细胞A-375直接接触共培养的表皮干细胞开始克隆样生长,细胞E-钙黏着蛋白表达下降,部分细胞表达P53突变蛋白,软琼脂培养克隆形成率为0.55%.结论:表皮干细胞经黑素瘤细胞直接诱导后,可以具有肿瘤细胞的相关生物学特性.结果表明,肿瘤微环境可以造成干细胞自我更新能力的失控.     

人乳头状瘤病毒和EB病毒在子宫颈上皮内瘤变中的表达

目的:探讨人乳头状瘤病毒(HPV)和EB病毒(EBV)在子宫颈上皮内瘤变(CIN)中的表达.方法:采用原位杂交对130例CIN(CIN1 50例,CIN2 40例,CIN3 40例)、子宫颈癌10例、子宫颈湿疣样病变10例、子宫颈正常黏膜10例的HPV(高危型16/18、低危型6/11)和EBV进行检测.结果:HPV16/18在CIN1、CIN2、CIN3的阳性表达率分别是44.0%、37.5%和62.5%,子宫颈癌为8/10,子宫颈湿疣样病变为10/10,子宫颈正常黏膜为3/10,差异有统计学意义(P<0.01).HPV6/11在CIN1、CIN 2、CIN3的表达率分别是36.0%、52.5%和70.0%,在子宫颈癌中的表达是6/10,子宫颈湿疣样病变9/10,子宫颈正常黏膜3/10,差异有统计学意义(P<0.01).HPV16/18和HPV6/11在CIN1、CIN2、CIN3中联合表达率分别为26.0%、22.5%和50.0%,子宫颈癌为6/10,子宫颈湿疣样病变为7/10,子宫颈正常黏膜为2/10,差异有统计学意义(P<0.01).EBV在CIN1、CIN2、CIN3的阳性表达率分别是24.0%、12.5%和22.5%,子宫颈癌为3/10,子宫颈湿疣样病变为0/10,子宫颈正常黏膜为0/10,差异无统计学意义(P>0.05).结论:HPV感染是引起CIN的主要致病因子,临床上往往是多种亚型混合感染.EB病毒在CIN和子宫颈癌表达的意义仍有争议.     

人乳头状瘤病毒和子宫颈癌

人乳头状瘤病毒(HPV)组包括约40种引起各种异常生长的不同病毒。巴黎巴斯德研究所的Gerard Orth说,总的说来,每种人乳头状瘤病毒对所侵犯的身体部位和引起异常生长的类型是有特异性的。大多数病毒引起良性改变,如长在手上的寻常疣或长在足底的扁平疣。但在过去数年中,日益增多的证据表明,某些HPV与子宫颈癌和生殖器及肛门部位的癌症有关。 HPV与癌瘤发生有关的证据包括肿瘤细胞内含有病毒DNA。德国海德尔堡德意志民主共和国癌症研究所的Harold zur Hausen说:“大部分子宫颈癌、阴茎癌和外阴部癌的细胞内都携     

HPV18型E6E7基因诱导胎儿食管永生化上皮的生物学特性

提要目的：研究SHEE生物学特性，包括增殖，分化和凋亡。方法：SHEE细胞系，199培基培养细胞，用光镜，电镜和荧光显微镜，免疫组化（Ki67，角蛋白），TdT标记，流式细胞仪和染色体分析。结果：细胞培养呈单层，锚定依赖和接触抑制生长。增殖指数PI34％，分裂指数MI2．74％（1．2％－4．8％），凋亡指数AI1．30％－6.90m％，核染色体分析46条为主（44－54条）和细胞周期DNA呈2倍体核型分布。电镜可见胞浆有张力原纤维和角蛋白免疫组化证实鳞状上皮有分化特征。结论：从生物学行为看来，SHEE细胞株接近于其来源组织胎儿食管上皮基…     

深圳地区人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建

目的克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法采用PCR技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果成功构建了pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

人乳头状瘤病毒86E7重组蛋白的高效表达、纯化和表征

[目的]基因工程法构建谷胱甘肤S-转移酶(GST)-人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus)HPV86 E7融合蛋白表达质粒,高效表达、纯化、鉴定蛋白质和分析蛋白质的存在形式.[方法]GST-HPV86 E7融合蛋白基因与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1-GST-HPV86 E7,重组质粒转入BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-HPV86 E7,柱上切除GST标签,Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE、MALDI-TOF和色谱质谱联用系统分别用于蛋白质纯度分析、分子量测定和蛋白鉴定;非变性电泳和分子筛排阻色谱用于蛋白质四级结构的分析.[结果]HPV86 E7大肠杆菌中正确表达,基质辅助激光解析飞行时间质谱测得的HPV86 E7精确分子量为(11319.76±5.66)Da.反相高压液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定的匹配肽段有11个肽段,氨基酸的覆盖率为90%.非变性PAGE和凝胶过滤层析实验观察到了HPV86 E7的单聚体、二聚体及多聚体.[结论]重组质粒pGEX-6P-1-GST-HPV86 E7成功构建,诱导后高效表达GST-HPV86 E7融合蛋白,HPV86 E7得到纯化,质谱分析证实表达蛋白为86E7蛋白,以多聚体形式存在.     

人乳头状瘤病毒E6、E7蛋白在维吾尔族及汉族宫颈癌发展中的表达及意义

目的：分析维吾尔族及汉族宫颈癌患者中人乳头状瘤病毒（HPV）E6、E7蛋白表达与宫颈癌癌前病变恶性进展的关系,进一步了解其在维吾尔族及汉族宫颈癌患者间是否存在差异。方法选取2013年4月~2014年4月在新疆维吾尔自治区人民医院妇科门诊行第二代杂交捕技术HPV DNA检测结果为阳性的133例维吾尔族（n=75）和汉族（n=58）患者宫颈不同病变程度的石蜡包埋宫颈组织。采用免疫组化法分别检测各组织中HPV E6、E7蛋白表达,使用Spearman等级相关分析HPV E6、E7蛋白表达与病变程度的相关性,并采用字2检测比较维吾尔族及汉族宫颈癌患者HPV E6、E7蛋白表达的差异。结果维吾尔族和汉族慢性宫颈炎、CIN 1、CIN 2~3、宫颈鳞癌组织中HPV E6的阳性率,随着病情的进展呈逐渐增高趋势,差异均有统计学意义（χ2=39.61,P=0.001;χ2=19.77,P=0.001）;Spearman等级相关分析发现,维吾尔族及汉族宫颈癌患者HPV E6蛋白的表达与宫颈病变级别均呈显著正相关（r=0.708,P=0.001;r=0.729,P=0.001）、HPV E7在维吾尔族和汉族慢性宫颈炎、CIN 1、CIN 2~3、宫颈鳞癌组织中的阳性表达率,随着病情的进展呈逐渐增高,多组比较差异有统计学意义（χ2=32.48,P=0.001;χ2=24.16,P=0.001）;Spearman等级相关分析发现,维吾尔族及汉族宫颈癌患者E6蛋白表达与宫颈病变级别均呈显著正相关（r=0.649,P=0.001;r=0.759,P=0.001）;慢性宫颈炎、CIN 1、CIN 2~3维吾尔族患者HPV E6、E7蛋白的阳性表达率高于汉族,维吾尔族宫颈癌患者HPV E6、E7蛋白表达率低于汉族,但差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 HPV E6、E7蛋白是维吾尔族和汉族宫颈癌发展的重要因素,HPV E6、E7蛋白可能具有预测宫颈病变进展的价值。     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA筛查宫颈病变研究进展

宫颈癌筛查的目的是早期发现、早期诊断和早期治疗宫颈癌前病变和早期宫颈癌。目前宫颈癌筛查有局限性,细胞学检查特异性强,但敏感度差;人乳头瘤病毒(HPV)DNA检查敏感度高,但特异性差。HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈疾病早期筛查、宫颈病变发展及治疗后复发进展中具有较高的诊断敏感性及特异性,具有一定应用前景。该文总结了HPV E6/E7 mRNA在宫颈病变筛查中的研究进展,为临床选择宫颈病变筛查方法提供参考。