采用RT-PCR技术进行SARS冠状病毒基因检测

目的 建立RT—PCR检测SARS冠状病毒基因的方法，用于早期诊断。方法 对临床确诊的20例SARS患的血、鼻拭子、咽拭子、尿、便等69份标本进行总RNA提取，反转录成cDNA后再以本研究室自行设计合成的一对特异引物进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，出现140bp带为SARS病毒阳性。采用测序仪对140bp带进行特异性检测，并进行灵敏度试验。结果 140bp扩增序列与公布的SARS病毒的基因序列完全一致，灵敏度可达10个拷贝。SARS患II份尿标本中6份检出140bp阳性扩增带，8份便标本中检出3份阳性，从15份鼻拭子和15份咽拭子中分别检出6份和5份阳性标本，血清15份、白细胞5份分别检出2份阳性。20例SARS患中送检1至4种标本检测到SARS病毒阳性共15例(75％)。结论 本研究建立的RT—PCR方法灵敏、特异，可用于早期诊断。尿、便标本中的SARS病毒检出率较高且取材简便、病人无痛，是取材的极好选择。每例待测患最好同时取其尿、便、拭子、血等多种标本，可以提高SARS病毒检出率。     

SARS患者外周血白细胞计数的变化及其意义

目的　探讨白细胞计数在传染性非典型肺炎 (SARS)患者临床诊断中的价值。方法　对 5 0例临床确诊为SARS患者的外周血白细胞计数进行统计、分析。结果　 5 0例SARS患者中 ,白细胞计数正常及降低者 4 8例 (96 % ) ,淋巴细胞绝对值降低者 38例 (76 % ) ,淋巴细胞百分数降低者 2 7例 (5 4 % )。结论　SARS患者外周血白细胞计数一般正常或降低 ,同时以淋巴细胞绝对值降低多见。动态观察淋巴细胞、白细胞绝对值的变化 ,对于SARS的临床诊断及病情预后的判断具有重要意义     

细胞因子在SARS发病中起重要作用

SARS病人肺病理学改变因疾病分期不同而异 ,香港大学的Peiris等在 5月 16日在线出版的Lancet上报告 ,巨噬细胞出现和噬血细胞现象提示 ,对促炎细胞因子的过多诱生 ,用类固醇可能有效。SARS是新的波及全球的传染性疾病。该病为一种新的冠状病毒所致 ,但对其发病机制仍然不清。香港中文大学的研究人员对 6例 2～ 3月份死于SARS的病人标本进行了研究。他们对其中 1例病人进行了开放肺活检 ,并对组织学标本进行了组织学和病毒学分析。仅 1例做了全尸检。通过RT PCR和血清学分析以寻找SARS相关冠状病毒和人偏肺病毒的感染证据。病理…     

淋巴瘤患者外周血大颗粒淋巴细胞及淋巴细胞微核的分析

目的　探讨淋巴瘤患者外周血大颗粒淋巴细胞 (LGL)及淋巴细胞微核的变化及意义。方法　对 15例淋巴瘤患者及 2 0例输血人员外周血做血涂片 ,瑞氏染色 ,光学显微镜观察。结果　淋巴瘤患者外周血中LGL百分率为 2 4.0 1%± 7.5 1% ,对照组LGL百分率为 5 .6 5 %± 2 .6 0 % ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。淋巴瘤患者外周血中淋巴细胞微核率为 0 .87‰ ,对照组为 0 .6 5‰ ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　淋巴瘤患者外周血中LGL的变化对病人机体的免疫状态及预后等有一定的临床意义。     

细胞因子在SARS发病中起重要作用

SARS是新的波及全球的传染性疾病。该病为一种新的冠状病毒所致 ,但对其发病机制仍然不清。香港中文大学的研究人员对 6例 2～ 3月份死于SARS的病人标本进行了研究。他们对其中 1例病人进行了开放肺活检 ,并对组织学标本进行了组织学和病毒学分析。仅 1例做了全尸检。通过RT -PCR和血清学分析以寻找SARS相关冠状病毒和人偏肺病毒的感染证据。病理标本是以光镜和电镜及免疫组化检查的。结果显示 ,所有 6例病人的血清学证据均显示近期感染了SARS冠状病毒。肺泡弥漫性损害常见 ,但并非绝对。形态学改变确认有支气管上皮脱落、纤毛丧失…     

36例SARS患者外周血象检查结果分析

目的　通过对 3 6例严重急性呼吸综合征 (SARS)患者外周血细胞数据的研究 ,动态监测SARS患者的血象变化 ,探讨血象在发生、发展转归中的临床意义。　方法　收集江门市医院 3 6例确诊SARS患者的外周血检查数据 ,进行动态分析。　结果　入院时 3 6例患者外周血白细胞计数 (WBC)均值为 ( 5 2± 3 0 )× 10 9/L随后WBC升高 ,至第4周有 91 6%病例WBC计数恢复正常 ,入院时淋巴细胞值低于 1 5× 10 9/L者占 88 9% ( 3 2 / 3 6) ,均值为 ( 1 0± 0 5 )×10 9/L ,入院 4周后有 86 1%患者淋巴细胞绝对数恢复正常。 1例血小板降低 ,占 2 8%。其他细胞分类及血红蛋白无明显异常。　结论　白细胞降低或正常及淋巴细胞降低可作为SARS的早期诊断指标 ,淋巴细胞降低可作为SARS早期诊断的标准之一 ;淋巴细胞的降低显示SARS病毒严重侵犯患者免疫功能 ,淋巴细胞是否回升可作为监测患者免疫功能是否重建的指标     

电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣原体样和冠状病毒样颗粒

目的 探索2002年末暴发于广东等地的非典型肺炎的病原。方法对来自广东、山西、四川省和北京市的7例非典型肺炎死亡病人的尸体解剖标本进行超薄切片电镜观察,将病人肺组织提取物接种于293细胞(人胚肾转化细胞系),分离病原,对病人组织中和分离的病原进行免疫学鉴定。结果超薄切片电镜观察,在死亡患者的肺(7例)、脾(2例)、肝(2例)、肾(3例)和淋巴结(1例)中均观察到衣原体样包涵体和网质小体、中间体、原生小体颗粒的存在,并在3例病人肺组织中同时见到了冠状病毒样颗粒和未知的基质样结构。用RT—PCR方法从2例病人肺组织中扩增出冠状病毒RNA聚合酶基因片段。将病人肺组织提取物接种于293细胞进行培养,取第2代细胞作电镜观察,也发现衣原体样颗粒和包涵体的存在。在病人组织和培养细胞中见到的衣原体样颗粒均不能与衣原体属特异性抗体和抗肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体抗体反应,提示可能为新的衣原体样因子。结论在死亡病人组织和培养细胞中发现的衣原体样和冠状病毒样颗粒,可能是广东等地暴发的非典型肺炎的主要病原。     

SARS病毒基因检测结果与患者病情关系的研究

1　材料和方法1.1　痰标本　留取 2 0例健康人 ,15例发烧非SARS患者和 72例不同病情SARS患者痰标本 ,用生理盐水稀释后 ,取5ml放入无菌管中 ,保存于 - 2 0℃。标本使用前置 95℃水浴中灭活 0 .5h ,才可用于RNA提取。1.2　试剂　本试验使用湖州数康生物科技有限公司提供的非典型肺炎病毒检测试剂盒 (巢式RT PCR) ,批号 0 30 5 0 1。PCR扩增仪型号为TC - 2 5 H。1.3　方法　检测 2 0例健康人 ,15例发烧非SARS患者和72例SARS患者痰标本中SARS病毒RNA。操作步骤详见试剂盒说明书。1.4　SARS患者病情诊断标准　①轻 :一般情况…     

100例SARS患者外周血T淋巴细胞亚群分析

目的 :探讨SARS患者外周血T淋巴细胞亚群变化。方法 :采用流式细胞仪检测10 0例SARS住院患者外周血T淋巴细胞亚群。结果 :与正常组比较 ,SARS组白细胞总数显著下降 ,淋巴细胞百分数和绝对数显著下降 ,粒细胞绝对数显著下降 ,CD3 、CD4 、CD8 细胞绝对数显著下降 ,CD4 细胞百分数 ,CD8 细胞百分数及CD4 /CD8 比值差异无统计学意义。比较SARS患者各病程CD3 、CD4 、CD8 ,于病程第一至第三周较第四周下降明显 (P <0 .0 5 ) ,病程第一至第三周之间差别无显著性 (P >0 .0 5 ) ;结论 :SARS患者外周血T淋巴细胞亚群的变化对阐明SARS的发病机制有一定意义。     

外周血淋巴细胞中汉坦病毒基因检测对HFRS早期诊断的意义

目的　探讨外周血淋巴细胞中汉坦病毒 (HV)基因的检测对流行性出血热 (又名肾综合征出血热 ,HFRS)早期诊断的意义。　方法　用RT PCR法检测 40例发病 3～ 7日内的HFRS患者外周血淋巴细胞和血浆中的HVRNA ,并与特异性IgM检测结果进行比较。　 结果　淋巴细胞中HVRNA阳性率为 82 .5 % (3 3 /4 0 ) ,特异性IgM阳性率为 90 % (3 6/4 0 ) ,两种方法的检出率无显著性差异 (χ2 =3 .2 5 ,P >0 .0 5 ) ,其一致率为 82 .5 % (3 3 /4 0 ) ;血浆中HVRNA阳性率为 5 5 % (2 2 /4 0 ) ,明显低于淋巴细胞 (χ2 =10 .3 7,P <0 .0 1)。　结论　RT PCR检测外周血淋巴细胞中HVRNA对HFRS的早期诊断具有潜在的应用价值     

Expression of immune cells and their roles in the involved tissues of SARS patients]

OBJECTIVE: To study the expression of the immune cell markers and their active antigens in the involved tissues of patients with severe acute respiratory syndrome (SARS). METHODS: Specimens of the lungs, spleens and lymph nodes were obtained from autopsy of 3 SARS cases to investigate the expression of the immune cells and their activities with double immunohistochemical staining (DAB and AP) by using 14 immune cell markers and their active antigens. RESULTS: A large quantity of proliferated macrophages could be observed in the lungs, spleens and lymph nodes of the SARS patients, some of which were positive for CD25 marker (active macrophages). In the lungs of the 3 patients, localized necrosis occurred where infiltration of CD45RO (+) T lymphocytes was observed, with only scarce Ki67 (+) T lymphocytes (active T lymphocytes) and B lymphocytes. In the lymph nodes, scattered T lymphocytes positive for Ki67 and CD45RO markers (active T lymphocytes) were seen, but the T lymphocytes subpopulations were obviously decreased, which was especially so with CD4+ and CD8+ T lymphocytes and NK cells. CONCLUSION: Significantly enhanced activity of the macrophages occurs in SARS as the major reactive cells, but T lymphocyte subsets are obviously decreased, indicating the important roles of the macrophages and T lymphocytes in the pathogenesis of SARS.     

免疫细胞在SARS病变组织中的表达及其作用

目的观察并探讨免疫细胞标志物及其活化抗原在严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)病变组织中的表达及其在SARS发病中的作用。方法采用14种免疫细胞标志物及其活化抗原,用免疫组化DAB及碱性磷酸酶(AP)双重染色法检测3例SARS尸检病变肺、脾、淋巴结免疫细胞及其活性表达情况。结果(1)病变肺、脾、淋巴结内均可见大量增生的单核巨噬细胞,部分经CD25标记显示阳性(活化单核巨噬细胞)。(2)肺组织炎症灶内可见散在的CD45RO阳性T淋巴细胞,而KI67阳性的T淋巴细胞(活化T淋巴细胞)则很少表达。(3)淋巴结内经KI67及CD45RO双染标记的T淋巴细胞(活化的T淋巴细胞)呈散在阳性;T淋巴细胞亚群数量均明显减少,CD4 、CD8 T淋巴细胞及NK细胞减少则更为严重。结论单核巨噬细胞在SARS发病过程中活性显著增加,为主要反应细胞,而T淋巴细胞亚群则显著减少。单核细胞及T淋巴细胞可能在SARS发病机制中起着重要作用。     

Rapid loss of both CD4+ and CD8+ T lymphocyte subsets during the acute phase of severe acute respiratory syndrome

Objective To study the alteration of peripheral lymphocyte subsets in severe acute respiratory syndrome (SARS) patients and to help improve the early diagnosis of the disease. Methods Anti-coagulating blood samples from 98 SARS patients in the acute phase, 56 normal healthy blood donors, and from patients infected by HIV, CMV and EBV were collected. The T lymphocyte subsets were counted by flow cytometry using fluorescence-labeled specific monoclonal antibodies. Results A significant decrease was observed in all SARS patients in their peripheral CD4+ and CD8+ T lymphocyte absolute counts ［256(104)×10(6)/L and 256 （117）×10(6)/L, respectively］, which were also lower than those of the patients infected with HIV, CMV and EBV. All patients infected with HIV, CMV and EBV had significantly higher CD8+ T lymphocyte counts in comparison with normal controls. Conclusions Decrease of both CD4+ and CD8+ T lymphocytes of patients is related to onset of SARS. T lymphocyte subset analysis would help improve the early diagnosis of the disease.     

严重急性呼吸综合征冠状病毒在肺组织内各种类型细胞中的表达

目的:了解肺组织内被严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome -associated coronavirus, SARS-CoV)感染的靶细胞类型, 并对SARS诱发的肺损伤发病机制进行探讨.方法: 运用SARS-CoV基因组序列合成的地高辛标记cDNA探针,对北京市7例及安徽省1例确诊的SARS死亡病例的肺组织进行原位杂交检测,在原位杂交基础上,进一步运用免疫组织化学方法显示SARS-CoV感染的靶细胞类型,如Cytokeratin(CK)标记上皮细胞,CD34标记血管内皮细胞,CD68标记巨噬细胞,Vimentin标记纤维母细胞, CD3标记全T细胞. 结果:原位杂交检测显示,8例患者肺组织中都表达SARS-CoV RNA,阳性信号位于靶细胞胞浆内,呈紫蓝色(NBT-BCIP).原位杂交和免疫组化结果显示:支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、纤维母细胞及T淋巴细胞在所有SARS病例中都受到了病毒感染.原位杂交阳性(紫蓝色,NBT-BCIP)和免疫组化阳性(红棕色,AEC)信号同时表达于靶细胞胞浆中而呈紫红色.结论:通过对SARS患者肺组织原位杂交和免疫组织化学双重标记研究表明,肺组织内支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞及纤维母细胞等多种细胞成分广泛受到了SARS-CoV攻击,肺组织内多种细胞成分弥漫性受损以及所释放的炎性介质在肺损伤的发病过程中起着重要作用.     

可诱导共刺激分子在系统性红斑狼疮病人外周血T细胞亚群的表达及与临床的关系

目的　检测可诱导共刺激分子(inducibleco stimulator,ICOS)及相关免疫分子在SLE病人外周血T细胞亚群的表达,探索其与SLE疾病活动程度、病程及血清抗dsDNA抗体和免疫球蛋白含量间的关系,为进一步研究ICOS在SLE免疫病理中的作用奠定基础。方法　采用流式细胞术检测第二军医大学附属长海医院住院和门诊SLE患者 (n=51)以及健康体检者 (n=30)外周血T细胞亚群表面ICOS及其他免疫分子CD45RO、CD45RA、HLA DR的表达水平,观察ICOS在不同细胞亚群表达水平与SLE活动程度、病程、血清抗dsDNA抗体和血清免疫球蛋白含量间的关系。结果　与正常人相比,活动期及稳定期SLE患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞表达ICOS的水平显著升高,但活动期患者与稳定期患者之间无统计学差异(P≥0 05);同一SLE患者在疾病活动期,外周血CD4+、CD8+、CD45RO+、CD4+CD45RO+和CD8+CD45RO+细胞表面ICOS的表达水平明显高于该患者经过治疗疾病缓解阶段(P<0 05);初发SLE患者CD45RO+细胞表达ICOS水平明显高于复发患者 (P<0 05);血清抗dsDNA抗体( +)及免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA中任何一种 )异常升高的患者外周血CD45RO+及CD4+CD45RO+细胞表达ICOS的水平分别明显高于血清抗dsDNA抗体 ( -)和免疫球蛋白含量正常的患者(P<0 05)。结论　SLE患者外周血某些T     

长期随访的严重急性呼吸综合征患者T淋巴细胞亚群动态变化

目的研究严重急性呼吸综合征(SARS)患者外周血T淋巴细胞亚群的动态变化,探讨SARS的发病机制。方法对62例SARS冠状病毒IgG抗体阳性患者进行为期1年的随访,采集患者发病后1周、2周、1月、2~3月及1年时的外周静脉血,采用流式细胞仪检测T细胞、CD4 T和CD8 T细胞、纯真及记忆CD4 T细胞亚群。并以56例健康者作为对照。结果SARS患者外周血淋巴细胞亚群在康复后短期内有明显恢复。在发病2~3月时,CD8 T细胞数与正常对照相比差异无显著性,平均CD4 T细胞及纯真CD4 T细胞数已分别增加至(534±197)/mm3和(175±75)/mm3。但发病1年时淋巴细胞总数、T细胞、CD4 T细胞和纯真CD4 T细胞数仍低于正常对照组。结论SARS患者外周血T淋巴细胞亚群表现为可逆的一过性快速减少及恢复。     

严重急性呼吸综合征患者细胞免疫功能的变化

为探讨老年严重急性呼吸综合征(SARS)患者细胞免疫功能的变化,为临床提供理论依据,对211例SARS患者按不同年龄、疾病严重程度以及激素使用情况分组。采用流式细胞技术测定患者不同病程的外周血T淋巴细胞亚群的变化。结果所有患者发病后均出现T淋巴细胞的明显下降,低谷出现于发病后22.83d。老年SARS患者疾病极期T细胞各亚群绝对数均低于中青年患者,重症患者低于轻症患者(P<0.01)。激素使用与否以及剂量大小对T细胞影响不大。提示SARS患者发病初期细胞免疫功能受到明显损害,老年、重症SARS患者的损害更为显著,外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞下降的程度可作为病情轻重及预后判断的指标之一。     

肾移植受者外周血循环中pp65阳性内皮细胞的新模式

目的：为了观察感染人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus HCMV）的1例女性肾移植外周血中膨大内皮细胞（Cytomegalic endothelial cells,CEC)的一种新模式。方法：本研究运用了HCMV pp65抗原分析法，实时PCR技术、流式细胞分析法等系列技术。结果：发现这一围绕并粘附了许多白细胞的蛋白样物质内，含有几个pp65阳性的CEC。这种蛋白质样物质的成分和功能目前还不清楚。该患者外周血中出现CEC表明其血管有损伤，而且该患者的CD4^ 及CD8^ 淋巴细胞的百分比都超出正常范围。其血浆、外周血白细胞及尿液中的HCMV-DNA都阳性，但该患者并没有明显的HCMV病症状。结论：HCMV感染和CEC形成之间的关系需进一步研究。     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

SARS相关冠状病毒的基因组和主要蛋白酶的研究进展

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)在2003年我国南方暴发流行,波及众多国家和地区,引起了全球关注.在SARS 病原体被确证为一类新的冠状病毒并被命名为SARS coronavirus(SARS-CoV)之后,全球对SARS相关冠状病毒进行了广泛的研究.至目前,SARS-CoV的基因组已在多个实验室被测定,并通过多种途径分析了其基因结构特征,研究了基因复制与翻译中相关的蛋白酶特性.SARS-CoV具有复杂的基因复制和翻译调节机制,如sg mRNA的不连续转录、核糖体的框移、翻译后的水解过程等等.其中SARS-CoV的3种蛋白酶(解旋酶和另外2种半胱氨酸蛋白酶)在病毒的复制、转录、翻译和翻译后加工等过程中发挥重要的生理和病理作用.本文综述了SARS-CoV的基因组成和主要蛋白酶的结构及其功能等方面的研究进展.